CN106434581A - 一种固定化山梨醇脱氢酶及其固定化方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固定化山梨醇脱氢酶及其固定化方法与应用，以孔径适配的介孔材料SBA15为载体，并在适宜的pH条件下，固定游离的山梨醇脱氢酶得到山梨醇脱氢酶的固定化酶；以制备得到的固定化山梨醇脱氢酶为催化剂，在1.5~100 g/L的底物(山梨醇或D‑半乳糖醇或L‑艾杜糖醇)浓度下，添加20 U~300 U的NADH氧化酶和0.05~0.5 mmol/L的NAD+，在pH 8.0~9.0，20~30℃、180~280 rpm条件下反应3~12 h，得到D‑果糖(或D‑塔格糖或L‑山梨糖)，反应结束后过滤回收山梨醇脱氢酶可重复使用5次仍保留75%的催化活性。本发明中通过计算机模拟进行固定化条件优化，固定化效率高，蛋白固载量达到545 mg/g。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种固定化山梨醇脱氢酶及其固定化方法与应用。
背景技术
山梨醇脱氢酶（SDH, EC 1.1.1.14）是一类能够选择性氧化多元醇二位羟基为酮基生成相应酮糖的氧化还原酶。我们在此前的发明专利（CN105154457A）中公开了一种来源于丁香假单胞菌、属于短链脱氢酶家族的山梨醇脱氢酶，能高效氧化山梨醇、半乳糖醇以及L-艾杜糖醇为对应的酮糖（D-果糖、D-塔格糖以及L-山梨糖）。与传统的化学法相比，氧化还原酶在催化效率、立体选择性等方面具有显著优势，然而游离酶稳定性差、不能重复使用且不利于产物分离的缺点限制了其在工业中的应用。
固定化酶技术的发展距今已有100多年的历史，人们采用物理吸附、物理包埋、共价交联等固定化酶技术对游离酶进行修饰，以期提高生物酶的工业应用价值。但到目前为止，并没有合适的固定化山梨醇脱氢酶产品用于D-果糖、D-塔格糖或是L-山梨糖的生产，对于该反应所特定需要的固定化酶的生产工艺条件摸索也是空白。
本方法是通过对发明专利（CN105154457A）中公开的含有山梨醇脱氢酶基因的大肠杆菌工程菌诱导表达获得工业应用级的山梨醇脱氢酶，然后将酶固定于介孔材料SBA-15，应用于D-果糖、D-塔格糖或是L-山梨糖的生产。
本发明中采用的固定化材料相比于传统的海藻酸钠、壳聚糖、树脂等，其显著特性在于机械强度高、比表面大、孔隙率高，另外孔道表面富含弱酸性硅端羟基，可通过氢键、范德华力、静电力等弱相互作用将酶分子固定于介孔材料表面，以提高酶的稳定性及重复利用次数。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种固定化山梨醇脱氢酶及其固定化方法与应用，所述固定化山梨醇脱氢酶可应用于不同酮糖（D-果糖、D-塔格糖以及L-山梨糖）的制备。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种固定化山梨醇脱氢酶的方法，以孔径适配的介孔材料SBA15为载体，并在适宜的pH条件下，固定游离的山梨醇脱氢酶得到山梨醇脱氢酶的固定化酶；包括如下步骤：
1）山梨醇脱氢酶体积预测：采用在线工具swiss-model，并以PDB:1K2W为模板，对山梨醇脱氢酶进行3D结构同源建模，并预测其体积大小；
2）固定化pH范围预测：山梨醇脱氢酶3D结构提交在线服务器 PDB2PQR，对其在不同pH环境条件下的表面电势进行分析，并预测合适的固定化pH范围；
3）SBA15介孔材料的吸附：用醋酸钠缓冲溶液配制2~4 mg/mL适配孔径的介孔材料溶液，超声15 min后，磁力搅拌30 min，获得均匀分散的介孔材料溶液，向其中加入游离的山梨醇脱氢酶，终浓度1~2 mg/mL，室温下搅拌或者低速震荡吸附0.25~6 h，取出过滤，并用醋酸钠缓冲溶液冲洗，得到固定化山梨醇脱氢酶，置于4℃下保存。
本发明所述的山梨醇脱氢酶可以为任意来源的山梨醇脱氢酶，比如来源于丁香假单胞菌的山梨醇脱氢酶，将发明专利CN105154457A中公开的含有山梨醇脱氢酶基因的大肠杆菌工程菌进行诱导表达后收集菌体，经高压破碎处理获得山梨醇脱氢酶的粗酶液。
步骤1）中所述的山梨醇脱氢酶的预测体积为7×7×2.5 nm。
步骤2）中所述的预测合适的固定化pH范围为4~5.5。
步骤3）中所述介孔材料的孔径选取为6~9 nm。
步骤3）中醋酸钠缓冲溶液的pH为4~5.5。
步骤3）中介孔材料溶液浓度为2 mg/ml，游离酶终浓度为1 mg/mL。
所述方法制备得到的固定化山梨醇脱氢酶，蛋白固载量为545 mg/g，最适温度为30 ℃，最适pH为8.5。本发明中所述的蛋白固载量是指每克载体上固定的游离酶的质量。
本发明中采用的固定化材料相比于传统的海藻酸钠、壳聚糖、树脂等，其显著特性在于机械强度高、比表面大、孔隙率高，另外孔道表面富含弱酸性硅端羟基，可通过氢键、范德华力、静电力等弱相互作用将酶分子固定于介孔材料表面，以提高酶的稳定性及重复利用次数。在发酵得到粗酶液后无需提纯，直接进行固定化操作，操作简单，固定化效率高。
所述固定化山梨醇脱氢酶在催化制备D-果糖或D-塔格糖或L-山梨糖中的应用。在1.5~100 g/L的底物浓度下，添加8 U~100 U固定化山梨醇脱氢酶、20 U~300 U的NADH氧化酶和0.05~0.5 mmol/L 的NAD+，在pH 8.0~9.0，20~30℃、180~280 rpm条件下反应3~12 h，得到D-果糖或D-塔格糖或L-山梨糖，反应结束后过滤回收山梨醇脱氢酶可重复使用，所述底物为山梨醇或D-半乳糖醇或D-艾杜糖醇。
有益效果：
本发明将计算机模拟引入固定化酶条件的优化，通过选取合适孔径大小的介孔材料以及适宜的固定化pH条件固定化山梨醇脱氢酶。该方法优势在于：1、利用计算机模拟的方式减少了传统繁琐的固定化条件优化；2、利用与目标蛋白大小相近孔径的载体对酶进行固定化，省去了传统需要对粗酶液处理的过程；3、采用适宜的pH使载体与酶分别带不同的电荷，利用静电相互作用使酶固定在孔道表面，操作简便，固定化效率高，蛋白固载量达到了545mg/g；经固定化后的山梨醇脱氢酶的最适温度为30 ℃，最适pH为8.5，并且相较游离酶展现出了更好的温度和pH稳定性（图4-7）；经固定化后的山梨醇脱氢酶在循环使用五次后仍能保持75%的催化活性。本发明方法简单，易于操作，具有极大的应用价值。
附图说明
图1为山梨醇脱氢酶的3D同源模型；
图2为山梨醇脱氢酶在不同pH条件下的表面静电分析；
图3为介孔材料SBA15吸附固定山梨醇脱氢酶的示意图；
图4 温度对固定化酶与游离酶的活性影响；
图5 温度对固定化酶与游离酶的稳定性影响；
图6 不同pH条件对游离酶和固定化酶的活性影响；
图7 pH对固定化酶与游离酶的稳定性影响;
图8 固定化山梨醇脱氢酶催化山梨醇合成果糖的稳定性。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1 游离山梨醇脱氢酶的制备
参照发明专利CN105154457A中公开的方法，准备含有山梨醇脱氢酶的大肠杆菌工程菌，进行诱导表达15 h，菌液经4 ℃、8 000 r/min离心15 min后，弃上清，收集的菌体在磷酸钠缓冲（pH 7.0）清洗2次后悬浮在同样的缓冲中，使用高压均质机（-20 ℃、8.0×107Pa）对细胞进行破碎。细胞破碎液经4 ℃、10 000 r/min离心30 min后，弃沉淀，上清即为山梨醇脱氢酶的粗酶液。
实施例2 计算机模拟辅助固定化酶条件优化
采用在线工具swiss-model（https://swissmodel.expasy.org/），并以PDB:1K2W为模板，对实施例1得到的山梨醇脱氢酶的氨基酸序列进行3D结构同源建模，并预测其体积大小为7×7×2.5 nm（图1）。将山梨醇脱氢酶3D同源模型提交在线服务器 PDB2PQR（http://nbcr-222.ucsd.edu/pdb2pqr_2.1.1/），对其在不同pH环境条件下的表面电势进行分析，并预测合适的固定化pH范围为4~5.5（图2）。
实施例3 山梨醇脱氢酶的固定化操作
用pH5.5的醋酸钠缓冲配制2 mg/mL 孔径为6~9mm的SBA15介孔材料（南京先丰纳米材料科技有限公司），超声15 min后，磁力搅拌30 min，获得均匀分散的介孔材料溶液，向其中加入实施例1中的游离的山梨醇脱氢酶，终浓度1 mg/mL，室温下搅拌或者低速震荡吸附0.25 h，取出过滤，并用醋酸钠缓冲冲洗，置于4℃下保存，蛋白固载量为545 mg/g。
实施例4 固定化山梨醇脱氢酶的酶学性质
酶活的测定：酶反应体系包括100 mM Tris-HCl缓冲(pH 9.0)，1 mM NAD+，50 mM 山梨醇，适量的游离酶或者固定化酶，30℃，340 nm处测定吸光值的上升。酶活定义为每分钟内生成1 μmol NADH所需要的酶量为一个酶活单位U。
1）最适温度的测定
取等酶量的游离酶和固定化酶放置于不同恒温水浴 (25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45℃、50 ℃、60 ℃) 5 min后，加入底物山梨醇、辅酶NAD+和缓冲液，分别测定游离酶和固定化酶的活性。图4为温度对固定化酶与游离酶的活性影响，游离酶与固定化酶的最适温度均为30 ℃。相较于游离酶，固定化酶受温度上升的活性影响较小。
2）温度稳定性的测定
取等酶量的游离酶和固定化酶放置于不同恒温水浴(30 ℃、40 ℃、50 ℃)，每间隔30min取样，加入底物山梨醇、辅酶NAD+和缓冲液，分别测定游离酶和固定化酶的活性。图5为游离酶和固定化酶温度稳定性测定。30 ℃时，游离酶和固定化酶的稳定性最好。随着温度提高，保温3 h后，固定化山梨醇脱氢酶 和游离酶的活性均有所下降，而游离酶的活性下降幅度比较大。在50 ℃保温1.5 h后，游离酶失去活性。研究显示，固定化后，山梨醇脱氢酶的热稳定性得到提高。
3）最适pH的测定
取等酶量的游离酶和固定化酶放置于不同pH缓冲条件下，加入底物山梨醇、辅酶NAD+和缓冲液，分别测定游离酶和固定化酶的活性。图6为不同pH条件对山梨醇脱氢酶游离酶和固定化酶的活性影响，经固定化之后，固定化山梨醇脱氢酶的最适pH为8.5，相较于游离酶(最适pH为9.0)，固定化山梨醇脱氢酶的pH向酸性偏移了0.5个单位。
4）pH稳定性测定
取等酶量的游离酶和固定化酶放置于不同pH缓冲条件下，放置在室温下5 h取样，加入底物山梨醇、辅酶NAD+和缓冲液，分别测定游离酶和固定化酶的活性。图7为游离酶和固定化酶pH稳定性测定，固定化酶较游离酶更为稳定，在pH在8.0~9.0条件下，能保留80%以上的活性。
实施例5 固定化酶催化山梨醇产D-果糖
取实施例3的固定化山梨醇脱氢酶悬浮于200 mL的pH 8.0 Tris-HCl缓冲中，加入山梨醇100 g/L，NADH氧化酶300 U，NAD+ 0.2 mmol/L，25℃，280 rpm，10 h。产物D-果糖的产量为98.4 g/L，产物的得率为：99.5%。
实施例6 固定化酶的重复利用。
将实施例5反应体系中的固定化山梨醇脱氢酶过滤处理，清洗，重新加入底物进行催化，重复上述操作步骤，检测不同循环次数反应10 h 底物山梨醇的转化率。相较于游离酶，固定化山梨醇脱氢酶可回收反复利用，图8为回收利用5次固定化山梨醇脱氢酶仍保留75%的催化活性。
产物的检测方法：
采用高效液相色谱(HPLC)测定D-山梨醇、D-果糖、D-半乳糖醇、D-塔格糖、L-艾杜糖醇及L-山梨糖浓度。高效液相色谱仪采用美国戴安(DIONEX)公司UltiMate3000，色谱柱为美国Bio-Rad公司Aminex HPX-87H column（300 x 7.8 mm）色谱柱；流动相为5 mM H2SO4；流速0.6 mL/min；柱温为65℃；采用示差检测器。
Claims (10)
1.一种固定化山梨醇脱氢酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）山梨醇脱氢酶体积预测：采用在线工具swiss-model，并以PDB:1K2W为模板，对山梨醇脱氢酶进行3D结构同源建模，并预测其体积大小；
2）固定化pH范围预测：山梨醇脱氢酶3D结构提交在线服务器 PDB2PQR，对其在不同pH环境条件下的表面电势进行分析，并预测合适的固定化pH范围；
3）SBA15介孔材料的吸附：用醋酸钠缓冲溶液配制2~4 mg/mL适配孔径的介孔材料溶液，超声，磁力搅拌，获得均匀分散的介孔材料溶液，向其中加入游离的山梨醇脱氢酶，终浓度1~2 mg/mL，室温下搅拌或者低速震荡吸附0.25~6 h，取出过滤，并用醋酸钠缓冲溶液冲洗，得到固定化山梨醇脱氢酶，置于4℃下保存。
2.根据权利要求1所述的一种固定化山梨醇脱氢酶的方法，其特征在于，所述山梨醇脱氢酶为来源于丁香假单胞菌的山梨醇脱氢酶。
3.根据权利要求2所述的一种固定化山梨醇脱氢酶的方法，其特征在于，步骤1）中所述的山梨醇脱氢酶的预测体积为7×7×2.5 nm。
4.根据权利要求2所述的一种固定化山梨醇脱氢酶的方法，其特征在于，步骤2）中所述的预测合适的固定化pH范围为4~5.5。
5.根据权利要求2所述的一种固定化山梨醇脱氢酶的方法，其特征在于，步骤3）中所述介孔材料的孔径选取为6~9 nm。
6.根据权利要求2所述的一种固定化山梨醇脱氢酶的方法，其特征在于，步骤3）中醋酸钠缓冲溶液的pH为4~5.5。
7.根据权利要求1所述的一种固定化山梨醇脱氢酶的方法，其特征在于，步骤3）中介孔材料溶液浓度为2 mg/ml，游离酶终浓度为1 mg/mL。
8.权利要求1-7中任意一项所述方法制备得到的固定化山梨醇脱氢酶，蛋白固载量为545 mg/g，固定化酶最适温度为30 ℃，最适pH为8.5。
9.权利要求8所述固定化山梨醇脱氢酶在催化制备D-果糖或D-塔格糖或L-山梨糖中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，在1.5~100 g/L的底物浓度下，添加8 U~100 U固定化山梨醇脱氢酶、20 U~300 U的NADH氧化酶和0.05~0.5 mmol/L 的NAD+，在pH8.0~9.0，20~30℃、180~280 rpm条件下反应3~12 h，得到D-果糖或D-塔格糖或L-山梨糖，反应结束后过滤回收山梨醇脱氢酶可重复使用，所述底物为山梨醇或D-半乳糖醇或D-艾杜糖醇。
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