CN101775387A - 一种介孔二氧化钛固定化酶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种介孔二氧化钛固定化酶，它包括酶和固定所述酶的载体，所述的酶为γ-谷氨酰转肽酶，所述的载体为介孔二氧化钛。本发明还公开了上述介孔二氧化钛固定化酶的制备方法及其应用。本发明所得到的介孔二氧化钛固定化酶具有性状均一、表面积大、酶稳定性强、重复使用性能好等特点，为进一步提高γ-谷氨酰转肽酶的稳定性和拓展谷氨酰基化反应的工业化应用奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种固定化酶及其制备方法和应用。
背景技术
无毒无害环境的二氧化钛材料是近年来备受关注的一种新型材料，它作为理想的含钛活性载体具有广阔的前景。介孔二氧化钛(M-TiO2)具有比表面积大，化学稳定性强，机械操作强度好等优良特性，因此开发生产M-TiO2介孔材料及以该材料为载体的固定化酶产品是很有意义的。
γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2)可特异性地将γ-谷氨酰基转移至受体分子，得到新的含γ-谷氨酰基的化合物，该反应成为谷氨酰基化反应。通过改变受体种类可获得不同的谷氨酰化合物，如催化合成药物或药物的前体，如L-γ-谷氨酰-L-多巴，它是帕金森综合症的前体药物；谷胱甘肽，其在临床上用于肝病的辅助治疗、有机物及重金属的戒毒等。由于其催化的过程位点特异性和光学选择性强，无需对反应物进行保护和脱保护，反应过程中也不消耗ATP。因此，利用该反应制备系列γ-谷氨酰基类化合物的研究正在成为工业生物催化领域的研究热点。目前，对γ-谷氨酰转肽酶的应用研究均以游离酶为催化剂，针对其的固定化方法及其性质研究未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种介孔二氧化钛固定化酶，以进一步提高γ-谷氨酰转肽酶的使用效率，降低制备谷氨酰化合物的工艺成本。
本发明还要解决的技术问题是提供上述介孔二氧化钛固定化酶的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述介孔二氧化钛固定化酶的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种介孔二氧化钛固定化酶，它包括酶和固定所述酶的载体，所述的酶为γ-谷氨酰转肽酶，所述的载体为介孔二氧化钛。
其中，所述的介孔二氧化钛为宽度100～300nm、长度1～10μm的棒状颗粒，颗粒上的微孔直径为20～50nm，比表面积可达30～80m2/g。
本发明所述的介孔二氧化钛(M-TiO2)具有很好的化学稳定性，可耐受pH 0～14，且结构稳定，有很好的机械操作强度，M-TiO2表面主要是羟基，极易与酶分子发生氢键吸附发应。
上述介孔二氧化钛固定化酶的制备方法，将介孔二氧化钛浸泡于pH7.0～9.0的30～60mmol/L Tris-HCl缓冲液中10～50h，抽干，加入浓度为0.010～0.127mg/mL的γ-谷氨酰转肽酶溶液，于4～45℃下振荡反应1～6h后，将液体滤出，固体颗粒用pH7.0～9.0的30～60mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2～3次，即制得介孔二氧化钛固定化酶。
优选的制备方法是：将介孔二氧化钛浸泡于pH8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液中24h，抽干，加入浓度为0.015～0.075mg/mL的γ-谷氨酰转肽酶溶液，于4℃下振荡反应2.5h后，将液体滤出，固体颗粒用pH8.0的50mmol/LTris-HCl缓冲液反复清洗2～3次，即制得介孔二氧化钛固定化酶。
其中，将介孔二氧化钛浸泡于pH7.0～9.0的30～60mmol/L Tris-HCl缓冲液中10～50h，对于每g介孔二氧化钛，Tris-HCl缓冲液的使用体积为30～100mL，优选使用体积为50mL。
其中，对于每g湿质量的介孔二氧化钛，γ-谷氨酰转肽酶溶液的加入体积为8～20mL，优选加入体积为10mL。
通过本发明方法制备得到的介孔二氧化钛固定化酶在pH7.0～9.0的30～60mmol/LTris-HCl缓冲液中保存。
通过本发明方法制备得到的介孔二氧化钛固定化酶可用于催化制备系列γ-谷氨酰基化合物。
有益效果：本发明充分利用M-TiO2这一固定化酶载体的良好特性，特别是形状均一、机械强度高、良好的结合性能等，通过氢键吸附法固定化γ-谷氨酰转肽酶，从而为发明M-TiO2固定化γ-谷氨酰转肽酶提供了良好的前提条件。通过本发明方法制备的M-TiO2固定化γ-谷氨酰转肽酶形状均一，酶活力回收率平均达到54.0％；与游离酶相比，固定化酶的最适作用pH和温度略有改变，且适用pH和温度范围均有一定程度的扩大，固定化酶的温度及pH稳定性均较游离酶有大幅度提高，且重复使用性能好。
附图说明
图1为给酶量对酶固定化效果的影响，该图显示：在制备过程中，若恒定其他条件，当每克M-TiO2湿载体的给酶量为0.38mg时，固定化酶的酶活力为131U/g载体，固定化酶的酶活回收率为最高，达58.6％。
图2为吸附反应温度对酶固定化效果的影响，该图显示：当结合温度为4℃时，固定化酶的酶活力与酶活回收率分别为123U/g和58.6％，均达到最大值。
图3为吸附固定时间对酶固定化效果的影响，从图中可以看出，当氢键吸附达到2.5小时，固定化酶的酶活力与酶活回收率均达到最大值，分别为105U/g载体和52.6％。综上所述，在以上最佳固定化条件下制备M-TiO2固定化γ-谷氨酰转肽酶，其酶活力为102～141U/g载体，平均达到121U/g载体，酶活回收率为52～58％，平均达到54.6％。
图4为游离酶和固定化酶的最适pH值，图中显示：M-TiO2固定化γ-谷氨酰转肽酶的最适pH为9。
图5为游离酶和固定化酶的最适温度，图中显示：M-TiO2固定化γ-谷氨酰转肽酶的最适温度为50℃。
图6为游离酶和固定化酶的pH稳定性，图中显示：M-TiO2固定化γ-谷氨酰转肽酶的的稳定性得到了明显改善，在各pH条件下，固定化GGT的稳定性均较游离酶有大幅提高，在pH 11.0条件下保存15小时，固定化酶的残余酶活可达69.6％。
图7为游离酶和固定化酶的保温4h后的热稳定性，图中显示：M-TiO2固定化γ-谷氨酰转肽酶的热稳定性明显提高，当保温在50℃下4h时固定化酶的残余酶活为初始值的67.5％。
图8为M-TiO2固定化γ-谷氨酰转肽酶的使用稳定性，图中显示：随着转化次数的增多，固定化酶的活力略有下降，但经储存约40d，转化12个批次后，固定化GGT酶活力仍可保持初始值的84％左右。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以下实施例所使用的介孔二氧化钛为宽度100～300nm，长度1～10μm的棒状颗粒，颗粒上的微孔直径20～50nm，比表面积可达53m2/g。该材料由南京工业大学化学化工学院陆小华老师课题组所赠，其制备方法可参照陆小华，何明，杨祝红，冯新，郑仲，暴宁钟.一种高比表面积氧化钛合成方法[P].中国专利：03158274.5，2003.9.22。
以下实施例中酶活力检测方法如下：称取0.01g(湿重)固定化酶，和1.0mL 5mmol·L-1γ-GpNA溶液、1.0mL 0.12mol·L-1双甘二肽溶液、1.0mLpH 8.0缓冲一起加入砂芯反应管中。37℃，振荡速度120r·min-1，反应30min。于分光光度计(λ＝410nm)下测定吸光值，根据标准曲线计算对硝基苯胺浓度。
以下实施例中酶活回收率计算方法如下：
回收率＝(固定化酶活力/总投入酶活)×100％
实施例1：
M-TiO2载体的平衡：称取5g M-TiO2介孔材料，用pH8.050mmol/L的Tris-HCl缓冲液250mL平衡载体24h，并于4℃下保存在上述缓冲液中备用。
介孔材料M-TiO2载体上γ-谷氨酰转肽酶的固定化：将上述M-TiO2抽干，称取1gM-TiO2湿颗粒置于砂芯管中，加入0.038mg/mL的γ-谷氨酰转肽酶溶液10mL(酶活为22.35U/mL)，于4℃冰浴振荡反应2.5h。反应结束后用pH8.050mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗去多余的酶溶液，并保存在上述缓冲液中，即制得M-TiO2固定化γ-谷氨酰转肽酶。其酶活力为131U/g载体，酶活回收率为58.6％。
实施例2：
M-TiO2载体的平衡：称取5g M-TiO2介孔材料，用pH8.050mmol/L的Tris-HCl缓冲液250mL平衡载体24h，并于4℃下保存在上述缓冲液中备用。
介孔材料M-TiO2载体上γ-谷氨酰转肽酶的固定化：将上述M-TiO2抽干，称取1gM-TiO2湿颗粒置于砂芯管中，加入0.073mg/mL的γ-谷氨酰转肽酶溶液10mL(酶活为22.62U/mL)，于4℃冰浴振荡反应4h。反应结束后用pH8.050mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗去多余的酶溶液，并保存在上述缓冲液中，即制得M-TiO2固定化γ-谷氨酰转肽酶。其酶活力为119U/g载体，酶活回收率为52.6％。
实施例3：
M-TiO2载体的平衡：称取5g M-TiO2介孔材料，用pH8.050mmol/L的Tris-HCl缓冲液250mL平衡载体24h，并于4℃下保存在上述缓冲液中备用。
介孔材料M-TiO2载体上γ-谷氨酰转肽酶的固定化：将上述M-TiO2抽干，称取1gM-TiO2湿颗粒置于砂芯管中，加入0.017mg/mL的γ-谷氨酰转肽酶溶液10mL(酶活为21.07U/mL)，于4℃冰浴振荡反应2.5小时。反应结束后用pH8.050mmol/L的Tris-HCl缓冲液洗去多余的酶溶液，并保存在上述缓冲液中，即制得M-TiO2固定化γ-谷氨酰转肽酶。其酶活力为107.8U/g载体，酶活回收率为51.15％。
实施例4：
γ-谷氨酰转肽酶作为一种催化剂，可用于酶法合成硫代苄基-γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)，供体为L-谷氨酰胺(Gln)和硫代苄基-L-半胱氨酸(S-Bzl-cys)。
配制Gln和S-Bzl-cys浓度均为20mmol·L-1的底物混合物(pH 9.0)，分别加入游离酶和实施例1方法制备的固定化酶，使反应液中酶浓度均为0.0375U/mL，于40℃水浴反应，定时取样测定产物S-Bzl-GGC的浓度。在反应初始阶段，产物S-Bzl-GGC的产率随反应时间的延长逐渐增加。但随着反应的继续，产物浓度达到最大值后逐渐降低，这一现象与GGT的催化机制有关。实验结果表明，以固定化酶为催化剂，在相同的酶浓度下，反应22h后产物得率为4.3mmol·L-1，较游离酶提高了11.96％。
实施例5：给酶量对酶固定化效果的影响试验。
将平衡处理后的M-TiO2抽干，称取1g M-TiO2湿颗粒置于砂芯管中，分别加入0.01mg/mL、0.017mg/mL、0.038mg/mL、0.073mg/mL、0.127mg/mL的γ-谷氨酰转肽酶溶液10mL，于4℃冰浴振荡反应2.5小时。测定固定化酶的活力，结果如图1所示：当每克M-TiO2湿载体的给酶量为0.38mg时，固定化酶的酶活力为131U/g载体，固定化酶的酶活回收率为最高，达58.6％。这可能是由于树脂的担载量为定值，随着酶液蛋白总量的增加，蛋白固定量有所增加。但是蛋白固定量的增加并没有使酶活表现率有相应的增加，即并不是所有固定于树脂上的酶分子都表现出了相同的催化性能。
实施例6：吸附反应温度对酶固定化效果的影响试验。
将平衡处理后的M-TiO2抽干，称取1g M-TiO2湿颗粒置于砂芯管中，加入0.038mg/mL的γ-谷氨酰转肽酶溶液10mL，分别在不同的温度下(4℃～45℃)水浴振荡反应2.5小时。测定固定化酶的活力，结果如图2所示：当结合温度为4℃时，固定化酶的酶活力与酶活回收率分别为123U/g和58.6％，均达到最大值。这可能是由于在高温下酶迅速失活导致固定化回收率降低。
实施例7：吸附固定时间对酶固定化效果的影响试验。
将平衡处理后的M-TiO2抽干，称取1g M-TiO2湿颗粒置于砂芯管中，加入0.035mg/mL的γ-谷氨酰转肽酶溶液10mL，于4℃冰浴下分别振荡反应1～6小时。测定固定化酶的活力，结果如图3所示：当氢键吸附达到2.5小时，固定化酶的酶活力与酶活回收率均达到最大值，分别为105U/g载体和52.6％。在最初的2.5小时内，载体上可吸附的孔数很多，主要是固液两相传质的过程。而随着固定化时间的增加，载体表面的可用孔道变少，酶分子之间也会发生相互排斥，从而影响进一步扩散。
实施例8：游离酶和固定化酶的最适pH值比较试验。
按照上述的最优固定化条件制备得到固定化酶，分别在pH 6～9(Tris-HCl缓冲)及pH10～11(碳酸氢钠缓冲)的溶液中测定游离酶及固定化酶的活力，结果如图4所示。固定化酶和游离酶的最适作用pH分别为9.5和9，当pH小于或大于该值时，游离酶和固定化酶的活性均有下降，且在碱性条件，游离酶的活性下降较固定化酶更为迅速，表明通过固定化可以有效地扩大GGT的作用pH范围。
实施例9：游离酶和固定化酶的最适温度比较试验。
按照上述的最优固定化条件制备得到固定化酶，在不同温度(20-50℃)下分别测定游离酶及固定化酶活力，结果如图5。由图可知，固定化酶和游离酶在50℃和40℃时酶活最高，当温度过高时，游离酶活性迅速下降，而固定化酶的活性下降较缓慢。
实施例10：游离酶和固定化酶的pH稳定性试验。
将游离酶和固定化酶分别置于pH 6～11的缓冲液中，37℃保温15h后测定酶活，以0时刻的初始酶活为100％，计算残余酶活(图6)。结果表明，B.subtilis NX-2GGT的稳定性较差，尤其在碱性条件下(pH＞8.0)稳定性更差。在pH 11.0条件下，经过15小时贮存，其残余酶活仅为初始酶活的12.1％。通过固定化GGT的pH稳定性得到了明显改善，在各pH条件下，固定化GGT的稳定性均较游离酶有大幅提高，在pH 11.0条件下保存15小时，固定化酶的残余酶活可达69.63％。
实施例11：游离酶和固定化酶的保温4h后的热稳定性试验。
将游离酶和固定化酶置于不同温度(30～50℃)下保温4h后取样测定酶活，设保温前初始酶活为100％，计算残余酶活，结果见图7。游离酶的热稳定性较差，当温度超过35℃时，酶活迅速下降，在50℃下保温4h后，残余酶活仅为初始值的10.12％。而固定化后GGT的热稳定性明显提高，当温度为50℃时固定化酶的残余酶活可达初始值的67.5％，。
实施例12：M-TiO2固定化γ-谷氨酰转肽酶的使用稳定性试验。
称取0.05g的固定化酶，于4℃下贮藏，定期测定酶活，固定化酶的储存稳定性测试结果见图8。在转化初期(4～6个批次)固定化酶活有明显的下降，这可能是由于结合较弱的酶分子脱落造成的。随着转化次数的增多，固定化酶的活力略有下降，但经储存约40d，转化12个批次后，固定化GGT酶活力仍可保持初始值的84％左右。
Claims (10)
1.一种介孔二氧化钛固定化酶，其特征在于它包括酶和固定所述酶的载体，所述的酶为γ-谷氨酰转肽酶，所述的载体为介孔二氧化钛。
2.根据权利要求1所述的介孔二氧化钛固定化酶，其特征在于所述的介孔二氧化钛为宽度100～300nm、长度1～10μm的棒状颗粒，颗粒上的微孔直径为20～50nm，比表面积可达30～80m2/g。
3.权利要求1所述的介孔二氧化钛固定化酶的制备方法，其特征在于将介孔二氧化钛浸泡于pH7.0～9.0的30～60mmol/L Tris-HCl缓冲液中10～50h，抽干，加入浓度为0.010～0.127mg/mL的γ-谷氨酰转肽酶溶液，于4～45℃下振荡反应1～6h后，将液体滤出，固体颗粒用pH7.0～9.0的30～60mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2～3次，即制得介孔二氧化钛固定化酶。
4.根据权利要求3所述的介孔二氧化钛固定化酶的制备方法，其特征在于将介孔二氧化钛浸泡于pH8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液中24h，抽干，加入浓度为0.015～0.075mg/mL的γ-谷氨酰转肽酶溶液，于4℃下振荡反应2.5h后，将液体滤出，固体颗粒用pH8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液反复清洗2～3次，即制得介孔二氧化钛固定化酶。
5.根据权利要求3或4所述的介孔二氧化钛固定化酶的制备方法，其特征在于将介孔二氧化钛浸泡于pH7.0～9.0的30～60mmol/L Tris-HCl缓冲液中10～50h，对于每g介孔二氧化钛，Tris-HCl缓冲液的使用体积为30～100mL。
6.根据权利要求5所述的介孔二氧化钛固定化酶的制备方法，其特征在于将介孔二氧化钛浸泡于pH7.0～9.0的30～60mmol/L Tris-HCl缓冲液中10～50h，对于每g介孔二氧化钛，Tris-HCl缓冲液的使用体积为50mL。
7.根据权利要求3或4所述的介孔二氧化钛固定化酶的制备方法，其特征在于对于每g湿质量的介孔二氧化钛，γ-谷氨酰转肽酶溶液的加入体积为8～20mL。
8.根据权利要求7所述的介孔二氧化钛固定化酶的制备方法，其特征在于对于每g湿质量的介孔二氧化钛，γ-谷氨酰转肽酶溶液的加入体积为10mL。
9.根据权利要求3或4所述的介孔二氧化钛固定化酶的制备方法，其特征在于制备得到的介孔二氧化钛固定化酶在pH7.0～9.0的30～60mmol/L Tris-HCl缓冲液中保存。
10.权利要求1所述的介孔二氧化钛固定化酶在催化制备γ-谷氨酰基化合物中的应用。
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Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102559648A (zh) * | 2012-01-13 | 2012-07-11 | 南京工业大学 | 一种以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶及其制备方法和应用 |
| CN102676494A (zh) * | 2012-05-03 | 2012-09-19 | 天津大学 | 核壳结构固定化酶颗粒及其制备方法 |
| CN102851272A (zh) * | 2012-09-25 | 2013-01-02 | 南京工业大学 | 一种γ-谷氨酰转肽酶固定化酶及其制备方法和应用 |
| CN103937776A (zh) * | 2014-04-10 | 2014-07-23 | 南京工业大学 | 一种以载体两性电解质修饰γ-谷氨酰转肽酶固定化酶的方法 |
| CN105565509A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-05-11 | 南昌航空大学 | 一种利用TiO2-邻菲啰啉负载CYP119酶光催化氧化降解甲基橙的方法 |
| CN105621627A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-06-01 | 南昌航空大学 | 一种利用TiO2-CeO2负载CYP119酶光催化还原Cr6+的方法 |
| CN105754985A (zh) * | 2016-04-15 | 2016-07-13 | 清华大学 | 一种酶-金属离子纳米复合物及其制备方法 |
| CN106434581A (zh) * | 2016-09-18 | 2017-02-22 | 南京工业大学 | 一种固定化山梨醇脱氢酶及其固定化方法与应用 |
| CN110964712A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-07 | 牡丹江医学院 | 一种γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成用固定化酶的制备方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1526474A (zh) * | 2003-09-22 | 2004-09-08 | 南京工业大学 | 一种高比表面积的氧化钛合成方法 |
| CN101648147A (zh) * | 2009-08-28 | 2010-02-17 | 南京工业大学 | 一种介孔复合氧化钛及其制备方法 |
-
2010
- 2010-03-23 CN CN2010101307447A patent/CN101775387B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1526474A (zh) * | 2003-09-22 | 2004-09-08 | 南京工业大学 | 一种高比表面积的氧化钛合成方法 |
| CN101648147A (zh) * | 2009-08-28 | 2010-02-17 | 南京工业大学 | 一种介孔复合氧化钛及其制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 《Materials Science and Engineering C》 20090101 Yanjun Jiang et al. The improved stability of enzyme encapsulated in biomimetic titania particles 328-334 1-10 第29卷, 第3期 2 * |
| 《化学反应工程与工艺》 20091031 宋希文等 固定化gamma-谷氨酰转肽酶催化合成gamma-L-谷氨酰-L-半胱氨酸 420-425 1-10 第25卷, 第5期 2 * |
| 《现代化工》 20091031 肖彦羚等 固定化gamma-谷氨酰转肽酶的催化特性研究 147-149，151 1-10 第29卷, 2 * |
| 《生物学通报》 20011231 肖海军等 固定化酶及其应用研究进展 9-10 1-10 第36卷, 第7期 2 * |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102559648A (zh) * | 2012-01-13 | 2012-07-11 | 南京工业大学 | 一种以改性的环氧基树脂为载体的固定化酶及其制备方法和应用 |
| CN102676494A (zh) * | 2012-05-03 | 2012-09-19 | 天津大学 | 核壳结构固定化酶颗粒及其制备方法 |
| CN102676494B (zh) * | 2012-05-03 | 2013-10-30 | 天津大学 | 核壳结构固定化酶颗粒及其制备方法 |
| CN102851272A (zh) * | 2012-09-25 | 2013-01-02 | 南京工业大学 | 一种γ-谷氨酰转肽酶固定化酶及其制备方法和应用 |
| CN102851272B (zh) * | 2012-09-25 | 2013-10-09 | 南京工业大学 | 一种γ-谷氨酰转肽酶固定化酶及其制备方法和应用 |
| CN103937776A (zh) * | 2014-04-10 | 2014-07-23 | 南京工业大学 | 一种以载体两性电解质修饰γ-谷氨酰转肽酶固定化酶的方法 |
| CN105565509A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-05-11 | 南昌航空大学 | 一种利用TiO2-邻菲啰啉负载CYP119酶光催化氧化降解甲基橙的方法 |
| CN105621627A (zh) * | 2015-12-23 | 2016-06-01 | 南昌航空大学 | 一种利用TiO2-CeO2负载CYP119酶光催化还原Cr6+的方法 |
| CN105621627B (zh) * | 2015-12-23 | 2017-12-05 | 南昌航空大学 | 一种利用TiO2‑CeO2负载CYP119酶光催化还原Cr6+的方法 |
| CN105754985A (zh) * | 2016-04-15 | 2016-07-13 | 清华大学 | 一种酶-金属离子纳米复合物及其制备方法 |
| CN106434581A (zh) * | 2016-09-18 | 2017-02-22 | 南京工业大学 | 一种固定化山梨醇脱氢酶及其固定化方法与应用 |
| CN110964712A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-07 | 牡丹江医学院 | 一种γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸合成用固定化酶的制备方法 |
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