CN101838672B - 固定化植物乳杆菌生产γ-氨基丁酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及固定化植物乳杆菌生产γ-氨基丁酸的方法，以来源广泛的海藻酸钠为固定化原料，选用的菌株为食品安全的植物乳杆菌，克服了一般固定化制备γ-氨基丁酸为有害的大肠杆菌。与固定化酶相比，节省了由于酶的分离提取和纯化而产生的大量成本。固定化细胞酶活力强，转化过程简单，转化液中无复杂成分，简化了GABA的分离纯化过程，对开发γ-氨基丁酸的工业化生产具有积极意义。
Description
技术领域
本发明涉及微生物法生产γ-氨基丁酸的方法，尤其涉及到固定化植物乳杆菌生产γ-氨基丁酸的方法。
背景技术
γ-氨基丁酸(γ-Aminobutanoicacid，简称GABA)又名4-氨基丁酸、γ-氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，广泛存在于动物、植物和微生物中。GABA是哺乳动物中枢神经系统中的重要的抑制性神经递质，具有重要的生理功能，已报道的生理活性有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、增加生长激素分泌、健肝利肾等多种功效，在食品、医药等行业得到广泛的应用。
γ-氨基丁酸制备方法主要有化学合成法和生物合成法两种，化学合成方法主要是以邻苯二甲酰亚氨钾和γ-氯丁氰在强烈条件下(180℃)反应，产物与浓硫酸回流水解，再经过结晶提纯而得到。化学合成GABA虽然反应迅速，但是具有反应条件苛刻、安全性差、能耗大、成本高、副反应多以及环境污染严重等缺点。相比较而言生物合成法较安全，成本也低。生物合成法主要是利用生物体的谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐的α-羧基发生脱羧反应，从而生成GABA。由于植物富集的GABA含量较低，因而微生物发酵生产GABA具有工业化开发前景。具有较高GAD活性的微生物，如大肠杆菌、曲霉、酵母、乳酸菌等都作为GABA的生产菌株，随着绿色食品的不断开发，酵母、乳酸菌等食品安全菌株逐渐替代了大肠杆菌用于制备GABA。但发酵液是一个极其复杂的多相体系，包括菌体、蛋白质、残糖、色素等多种杂质，造成GABA的分离提取的困难。采用游离细胞或固定化细胞催化生产GABA，以简化GABA分离纯化工艺和降低生产成本。利用固定化细胞催化合成GABA具有稳定性好、可连续重复使用、产物易于分离、操作稳定性高、同时还能克服游离细胞对环境敏感，性质不稳定以及易失活等缺点。利用固定化细胞在酒精，有机酸、抗生素等发酵产品都实现了工业化生产。
目前国内利用固定化技术生产GABA，主要是固定化大肠杆菌或者固定化GAD，但大肠杆菌作为肠道菌有一定的致病性，在实际应用中受到了一定的限制：而固定化GAD，需要对GAD进行提取纯化，操作工艺复杂，成本较高，无法进行大规模的生产应用。
本发明利用本实验室筛选的具有高GAD活性的食品安全菌株对其进行固定化，以期获得具有较高转化能力的固定化细胞，以L-Glu为底物转化生成GABA，从而实现利用固定化细胞生产GABA的工业化应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种固定化细胞生产GABA的方法。该方法利用的菌株为植物乳杆菌，是食品安全级；同时该方法克服了游离细胞对环境敏感，性质不稳定等缺点，省去提取和纯化GAD冗长工序和时间的耗费，降低成本。
实现上述目的的技术方案为：先对菌体进行培养，离心收集菌体，用生理盐水制成菌悬液后，加入到2％的海藻酸钠溶液中，充分混匀后，逐滴加入到氯化钙溶液中，在氯化钙中浸泡2h后，滤出海藻酸钙胶珠，用去离子水洗涤两次，备用。
①植物乳杆菌的培养：将保存菌种接入到活化培养基，于30℃、160r/min振荡反应24h，再以2％的接种量接入种子培养基，30℃、160r/min振荡反应24h，离心收集菌体，置于4℃冷藏备用。
所述培养基组成：
活化培养基(g/L)：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，pH 6.5。
种子培养基(g/L)：蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，丁二酸钠5g/L，pH 6.5。
②海藻酸钠溶液的制备：称取2g海藻酸钠，加入100ml去离子水加热煮沸溶解，静止2h以上，使海藻酸钠溶液中的气泡完全消失，备用。
③固定化细胞的制备：用无菌生理盐水将菌体悬浮，按菌体湿重与生理盐水体积比例为1∶1(g/ml)制成菌悬液，加入到2％海藻酸钠溶液中至菌体终浓度为80g/L，充分混匀，然后逐滴滴入0.2mol/L的氯化钙溶液中，继续在氯化钙中浸泡2h，用于凝胶反应。然后过滤出海藻酸钙胶珠，用去离子水洗涤两次，4℃下保存备用。
④转化反应：称取5g固定化细胞，悬浮于30mL乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2M，pH 4.8)中，加入吐温-800.01g，再加入3g的L-Glu，在30℃，160r/min振荡反应24h，停止转化，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量为2.09g。
本发明的有益效果：固定化原料为海藻酸钠，具有来源广泛、价格低廉、固定化条件温和、操作简单，生物相容性好等优点。选用的菌株为食品安全菌株植物乳杆菌，对人体没有害，可以进行工业化生产。节省了酶的分离提取和纯化过程，与固定化酶相比，从而节省了由于酶的分离提取和纯化而产生的大量成本。
附图说明
图1反应温度对合成γ-氨基丁酸的影响
图2反应体系pH对合成γ-氨基丁酸的影响
图3底物浓度对合成γ-氨基丁酸的影响
图4固定化细胞操作稳定性的考察
具体实施方法
实施例1：固定化细胞的制备
将保存菌种接入到活化培养基，于30℃、160r/min振荡反应24h，再以2％的接种量接入种子培养基，30℃、160r/min振荡反应24h，离心收集菌体，称取0.8g湿菌体，用0.8ml生理盐水悬浮制成菌悬液，加入到10ml的2％的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀，用注射器逐滴滴入0.2mol/L的氯化钙溶液中，继续在氯化钙中浸泡2h，用于凝胶反应。然后过滤出海藻酸钙胶珠，用去离子水洗涤两次，4℃下保存备用。
实施例2：固定化细胞合成GABA
称取5g固定化细胞，悬浮于30mL pH 4.8乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2M)中，加入吐温-800.01g，再加入3g的L-Glu，在30℃，160r/min振荡反应24h，停止转化，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。
实施例3：固定化细胞转化GABA最适温度的选择
称取5g固定化细胞，悬浮于30mL乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2M，pH 4.8)中，加入吐温-800.01g，再加入3g的L-Glu，在不同温度下，160r/min振荡反应1h，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量，比较不同温度下固定化细胞的生物转化力，确定固定化细胞转化GABA最适温度为30℃
实施例4：固定化细胞转化GABA最适pH的选择
称取5g固定化细胞，悬浮于30mL不同pH的乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2M)中，加入吐温-800.01g，再加入3g的L-Glu，在30℃下，160r/min振荡反应1h，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量，比较不同pH条件下固定化细胞的生物转化力，确定固定化细胞转化GABA最适pH为4.8
实施例5：固定化细胞转化GABA最适底物浓度的选择
称取5g固定化细胞，悬浮于30mL乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2M，pH 4.8)中，加入吐温-800.01g，加入不同浓度的L-Glu，在30℃下，160r/min振荡反应1h，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量，比较不同底物浓度下固定化细胞的生物转化力，确定固定化细胞转化GABA最适底物浓度为100g/L。
实施例6：固定化细胞操作稳定性的考察
称取5g固定化细胞，悬浮于30mL乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2M，pH 4.8)中，加入吐温-800.01g，加入3g的L-Glu，在30℃，160r/min振荡反应24h后，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。过滤收集固定化细胞，去离子水洗涤两次，重新悬浮于30mL乙酸-乙酸钠缓冲液(0.2M，pH 4.8)中，加入吐温-800.01g，再加入3g的L-Glu，在30℃，160r/min振荡反应24h后，再用氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量。如此重复转化十次，固定化细胞稳定性较好，利用L-Glu转化为GABA的初转化率为100％，重复反应十个批次后，GABA的产率仍能达到70％以上，可以将30gL-Glu转化为19.7g的GABA，理论转化率为91.2％。
Claims (1)
1.固定化植物乳杆菌生产γ-氨基丁酸的方法，其特征在于：
①将保存菌种接入到活化培养基，于30℃、160r/min振荡反应24h，再以2％的接种量接入种子培养基，30℃、160r/min振荡反应24h，离心收集菌体，置于4℃冷藏备用；
②称取2g海藻酸钠，加入100ml去离子水加热煮沸溶解，静止2h以上，使海藻酸钠溶液中的气泡完全消失，备用；
③用无菌生理盐水将菌体悬浮，按菌体湿重g与生理盐水体积ml比例为1∶1制成菌悬液，加入到2％海藻酸钠溶液中至菌体终浓度为80g/L，充分混匀，然后逐滴滴入0.2mol/L的氯化钙溶液中，继续在氯化钙中浸泡2h，用于凝胶反应，然后过滤出海藻酸钙胶珠，用去离子水洗涤两次，4℃下保存备用；
④称取5g固定化细胞，悬浮于30mL 0.2M、pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液中，加入吐温-80 0.01g，再加入3g的L-Glu，在30℃，160r/min振荡反应24h，停止转化，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量；
⑤称取5g固定化细胞，悬浮于30mL 0.2M、pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液中，加入吐温-80 0.01g，再加入3g的L-Glu，在30℃，160r/min振荡反应24h，停止转化，氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量，过滤收集固定化细胞，去离子水洗涤两次，重新悬浮于30mL 0.2M、pH4.8乙酸-乙酸钠缓冲液中，加入吐温-80 0.01g，再加入3g的L-Glu，在30℃，160r/min振荡反应24h后，再用氨基酸测定仪测定转化液中的γ-氨基丁酸含量，如此重复转化十次；
其中，所述的菌株是分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GB01-21，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M209102；
固定化所需菌体采用的活化培养基以g/L计：酪蛋白胨10g/L，牛肉提取物10g/L，酵母提取物5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺0.2g/L，吐温0.1g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，pH6.5；种子培养基以g/L计：蛋白胨5g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖10g/L，丁二酸钠5g/L，pH6.5。
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