CN103060397B - 一种固定化赤霉菌并用于生物转化制备烟酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术应用领域，具体涉及一种赤霉菌CA3-1（<i>Gibberella？intermedia</i><i>）</i>，保藏号CGMCC？No.？4903固定化并应用于生物转化制备烟酸的方法。具体是将赤霉菌CA3-1固定化，加入适量的3-氰基吡啶，选择固定化菌体的最适反应条件，得到产物烟酸。菌体经固定化后增强了菌体对底物的耐受性，提高了单位菌体的生产能力，并大大简化了产物的分离过程，重复利用次数显著增多，为利用赤霉菌进行生物转化法制备烟酸的工艺实现提供了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种将赤霉菌CA3-1（Gibberellaintermedia，CGMCCNo.4903）固定化并用于制备烟酸的方法，属于生物工程应用技术领域。
背景技术
烟酸属于维生素B系列化合物，是人体不可缺少的营养物质，在促进人体正常发育、促进新陈代谢、扩张血管、缓解末梢血管痉挛等方面具有广泛的作用。同时，烟酸也是一种重要的医药中间体和化工中间体，可以作为医药中间体生产异烟肼、尼可刹米、及烟酸肌醇酯治疗皮肤病、高血压病、动脉硬化和冠心病等疾病的药物。
传统的烟酸生产主要是采用化学合成法，如氨氧化法、高锰酸钾氧化法、硝酸氧化法、臭氧氧化法、气相氧化法、电解氧化法等，化学合成法：合成条件苛刻，往往需要高温高压，过程能耗较大，并且产生大量的废气废渣等，对环境造成极大的污染，不符合原子经济性和绿化化学的发展方向，与可持续发展战略相违背。
化学合成法本身存在的局限以及环境问题促进了生物催化法制备烟酸的发展。利用腈水解酶转化腈类化合物制备有机酸日益成为化工产品生产的重要工艺，并广泛性应用在制药、食品等领域。腈水解酶属于腈类物质代谢酶系中的一种，可以高效的将3-氰基吡啶转化为烟酸。生物催化法生产烟酸的条件温和，反应过程易于控制，对环境的影响小，相比于化学合成法，生物法具有更大的优势。
尽管如此，生物催化法由于采用细胞或酶为催化剂，活性容易受到外界扰动的影响，在稳定性以及后续产物分离方面不具有优势。尤其对于腈类化合物转化体系，底物对细胞存在一定的毒害作用，从而造成催化剂使用周期短、成本投入高的问题。固定化技术的出现可以弥补生物催化的缺陷。通过细胞或酶的固定化，提高其对外界扰动的抵抗能力，增强对底物的耐受性，同时便于产物的分离提取，以及催化剂的回收重复利用。
固定化细胞与游离细胞相比，虽然酶活性因操作过程的影响而有所降低，但有利于产物的分离纯化，而且固定化细胞容易回收重复利用，提高了单位利用效率，降低了生产成本。因此，选择合适的固定化材料和固定方法制备保留活性高、操作和储存稳定性好、能多次重复利用的固定化细胞前景值得期待。但是，至今为止，从未有利用产腈水解酶的丝状真菌制备固定化细胞用于腈类化合物生物转化的任何专利及文献报道。
本发明将腈水解酶产生菌赤霉菌CA3-1固定化，通过与游离菌体相比较，考察催化转化3-氰基吡啶制备烟酸的能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种将产腈水解酶的赤霉菌CA3-1（Gibberellaintermedia，CGMCCNo.4903）固定化用于制备烟酸的方法。该菌株于2011年5月24日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为Gibberellaintermedia，保藏编号为CGMCCNo.4903。本发明的技术方案为：赤霉菌CA3-1（Gibberellaintermedia，CGMCCNo.4903）通过液体培养得到菌液，经过离心分离获得菌体，用生理盐水离心洗涤数次后重悬于生理盐水中，加入海藻酸钠溶液，混合均匀后逐滴滴入到CaCl2溶液中，固化，得到的固定化小球经过滤、洗去表面未固定的菌体和CaCl2溶液。取定量的固定化小球参与反应，加入PBS缓冲液（含有一定量的CaCl2），加底物3-氰基吡啶，在一定温度、一定pH值的条件下反应一定时间得到产物烟酸和副产物烟酰胺的混合溶液。
上述过程中，腈水解酶产生菌的液体培养基（g/L）为：磷酸二氢钾2.72，硫酸亚铁0.0139，葡萄糖10，酵母粉7.5，氯化钠1.16，己内酰胺3.39，pH值为7.0。培养条件为：500mL三角瓶装50mL培养基在30℃，220rpm，往复式摇床振荡培养60h。离心分离所得菌体干重为0.03g，海藻酸钠的质量分数为5.5%，CaCl2溶液的质量分数为1%，固化时间7h，固化温度0℃。形成的固定化小球用纱布过滤，用PBS缓冲液洗涤。转化反应时，PBS缓冲液的量为7mL，pH值为9.0，其中含有30mM的CaCl2，底物3-氰基吡啶的浓度为100mM，温度为40℃，反应时间为35min。
附图说明
图1固定化菌体生物转化3-氰基吡啶的产物液相图谱
图2游离菌体生物转化3-氰基吡啶的产物液相图谱
具体实施方式
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实例一
1、水解酶产生菌菌液的制备
液体培养基：磷酸二氢钾2.72g，硫酸亚铁0.0139g，葡萄糖10g，酵母粉7.5g，氯化钠1.16g，己内酰胺3.39g，加水至1L，充分溶解后调pH值为7.0。
培养方法：从斜面菌种中用接种环挑取真菌，接种于摇瓶种子培养基中，500mL三角瓶装50mL液体培养基，在30℃，220rpm条件下，培养60h。
2、菌体固定化
将制备的菌液经离心分离获得菌体，用生理盐水离心洗涤后，取0.03菌体重悬于生理盐水中，制备成9g/L的菌悬液，向其加入质量分数为5.5%的海藻酸钠溶液，充分混合均匀后用注射器平稳注入到质量分数为1%（w/v）CaCl2溶液中，0℃下固化7h，得到固定化小球经过纱布过滤后用PBS缓冲液洗去未固定的菌体和CaCl2溶液，固化结束小球保存于含有30mMCaCl2的生理盐水中。海藻酸钠小球呈白色，直径2mm左右。
3、烟酸的生产方法
向上述制得的海藻酸钠小球中，加入7mL的PBS缓冲液（含有30mM的CaCl2），加入浓度为100mM的底物3-氰基吡啶7mL，40℃，pH9.0，反应35min得到产物烟酸。液相检测图谱如图1。
作为对照，取与固定化菌体等量的游离菌体参与转化反应，加入7mL的PBS缓冲液，加入浓度为100mM的3-氰基吡啶7mL，40℃，pH9.0，反应45min得到产物烟酸。液相检测图谱如图2。
表1液相检测数据以及反应时间对比
液相检测数据以及反应时间如表1所示，由转化条件和液相检测图谱可知，固定化菌体的转化能力比游离菌体强，副产物产率低。
实例二
向上述制得的海藻酸钠小球中，加入7mL的PBS缓冲液（含有30mM的CaCl2）加入浓度为100mM的底物3-氰基吡啶7mL，pH9.0，反应35min，对不同温度下固定化菌体的比酶活进行测定（见表2），结果表明反应温度在40℃时固定化菌体的比酶活最高，因此确定反应体系的最适反应温度为40℃。
表2温度对转化的影响
| 温度（℃） | 25 | 30 | 35 | 40 | 45 | 50 | 55 |
| 比酶活 | 402.6 | 512.7 | 587.1 | 674.2 | 597.3 | 436.9 | 330.2 |
实例三
向上述制得的海藻酸钠小球中，加入7mL的PBS缓冲液（含有30mM的CaCl2）加入浓度为100mM的底物3-氰基吡啶7mL，40℃，反应35min，对不同pH下固定化菌体的比酶活进行测定（见表3），结果表明在pH9.0固定化菌体的比酶活最高，因此反应体系的最适pH为9.0。
表3pH对转化的影响
| pH值 | 6.0 | 7.0 | 8.0 | 9.0 | 10.0 | 11.0 |
| 比酶活 | 366.8 | 493.7 | 568.1 | 642.4 | 532．6 | 452.7 |
实例四
向上述制得的海藻酸钠小球中，加入7mL的PBS缓冲液（含有30mM的CaCl2）加入浓度为100mM的底物3-氰基吡啶7mL，40℃，pH9.0，对不同反应时间下的3-氰基吡啶的转化量进行测定（见表4），结果表明反应时间为35min时底物完全转化，因此反应时间确定为35min。
表4反应时间对转化的影响
Claims (2)
1.一种利用固定化后的赤霉菌细胞生产烟酸的方法，其特征是，所述的赤霉菌是保藏编号为CGMCCNo.4903的Gibberellaintermedia；将保藏编号为CGMCCNo.4903的赤霉菌经过液体培养得到菌液，经过离心分离获得菌体，用生理盐水离心洗涤后重悬于生理盐水中，得到浓度为6-10g/L的菌悬液；取2-6mL菌悬液加入2-6mL3.5-6.5%海藻酸钠溶液，混合均匀后用注射器平稳的注入到质量分数为0.1-1%的CaCl2溶液中，于0-10℃下，固化2-8h，得到的固定化小球直径2mm左右，经过滤、洗去表面未固定的细胞和CaCl2溶液；最后将固定化细胞保存在含有20-50mMCaCl2、0-10℃的生理盐水中，用于转化生产烟酸；取定量固定化细胞参与反应，加入7mLpH值9.0的PBS缓冲液，其中含有30mM的CaCl2，加100mM底物3-氰基吡啶，在40℃、pH值为9.0的条件下反应35min，得到产物烟酸和副产物烟酰胺的混合溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是保藏编号为CGMCCNo.4903的赤霉菌的液体培养基为葡萄糖6-12g，酵母粉5-10g，磷酸二氢钾1-3g，氯化钠1-2g，硫酸亚铁0.01-0.1g，己内酰胺2-4g，加水至1L，pH为7.0，培养条件为500mL三角瓶装液30-60mL，于25-35℃、180-220rpm摇床培养36-72h。
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