CN103290071B - 一种2-酮基-l-古龙酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法，其特征是：单独培养大菌，所得大菌发酵液先后经微滤和超滤处理得活性物质浓缩液，所得大菌活性物质浓缩液流加到小菌发酵培养基中促进小菌转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸。本发明将大菌进行单独培养，优选将大菌进行同步培养，能够满足大菌的最适生长条件，提高生产效率，采用先进的微滤和超滤技术收集大菌活性酶类物质往小菌发酵液中转移，进一步的可通过流加山梨糖溶液和pH维持剂稳定小菌发酵液的底糖和pH，增加小菌的数量，缩短菌体生长时间，加快小菌氧化山梨糖转化为2-KLG的反应速率，缩短发酵周期，提高产物浓度，降低生产成本，提高企业市场竞争力。
Description
技术领域
本发明涉及一种维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）的制备方法，特别涉及分别在最适条件下单独培养大、小菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法，属于维生素C生产技术领域。
背景技术
维生素C又称L-抗坏血酸，它能参与体内多种氧化还原反应及羟化反应，是一类重要的细胞代谢氧化还原化合物，在人体内起到必不可少的重要生理作用，如治疗人类坏血病，增强人体抵抗力。绿色植物能够自己合成维生素C，然而人和许多动物由于身体肝脏中缺少古洛内酯氧化酶，因此不能自己合成，必须从外界摄取。目前维生素C已广泛应用于医药、食品、保健品和化妆品等领域。并且随着其用途的开发和人们物质文化生活水平的提高，对维生素C的需求量也不断增加。
1933年，德国化学家Reichstein等发明了以化学合成法为主的莱氏法，是最早工业化生产维生素C的方法，但此法合成路线过长，有毒有害的中间产物以及有机原料消耗量多，导致维生素C生产成本较高。七十年代初，我国首创了维生素C二步发酵法并将其应用于工业生产。该法在莱氏法一步发酵的基础上，采用混菌发酵，使山梨糖转化为2-KLG，工艺简单、成本低、无污染，是目前维生素C工业生产的主要方法。
维生素C生产中采用两步发酵获得中间体2-KLG，第一步是在醋酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖，此步发酵工艺成熟，发酵周期约为20h，且转化率很高，现已能达98%以上；第二步是将L-山梨糖进一步氧化生成2-KLG，此步发酵通常由两种微生物混菌发酵进行，一种为小菌，小菌能够转化山梨糖生成2-KLG，但其单独培养生长较弱，例如氧化葡萄糖酸杆菌（又名氧化葡糖酸杆菌，拉丁文命名为Gluconobacter oxydans）；另一种俗称大菌或伴生菌，大菌不能产酸，但和小菌混合培养，能够显著促进小菌产酸，例如巨大芽孢杆菌。目前维生素C生产第二步发酵，发酵周期约为40-50h，产物浓度约为80-95 g/L，转化率约为80-90%。第二步发酵周期长、产物浓度和转化率相对较低，因此是限制维生素C中间体2-KLG生产效率的关键环节。
为了进一步提高维生素C发酵的生产效率，近年来许多研究机构对维生素C第二步发酵进行了研究。专利200910148114.X公开了一种维生素C第二步发酵菌种制备方法，菌种茄瓶制备过程中，先将小菌接种茄瓶，培养16-48 h，然后再接种大菌，继续培养24-72 h，这种条件下，可以提高小菌在混菌中的比例，提高菌种活力，发酵45h，2-KLG可达到100 g/L，转化率达到90%左右，该方法效率有所提高，但是发酵时间仍然较长。专利200910069697.7公开了一种在发酵过程中添加巯基化合物来取代大菌促进小菌的生长和产酸，但其生产效率仍低于大、小菌混菌发酵的效率。专利200910034773.0公开了一种强化2-KLG生产强度的方法，通过添加海藻糖，提高菌体对古龙酸的耐受性，发酵52h，2-KLG可达到69.38 g/L，该方法需要添加海藻糖，海藻糖价格较高，导致生产成本上升，不具有实用性。
发明内容
本发明针对现有维生素C生产过程中第二步发酵生产效率低下的问题，提供了一种一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法，该方法山梨糖转化成2-酮基-L-古龙酸时间短、效率高。
维生素C二步发酵生产方法中，第二步发酵将L-山梨糖混菌发酵产生2-KLG的过程中生产效率偏低，主要原因是大多数采用混菌发酵，发酵条件需要考虑大菌和小菌协同生长，将山梨糖氧化生成2-KLG的小菌生长缓慢，且现今公开的小菌菌种转化生产2-KLG的效率也较低，致使中间体2-KLG生产效率低。发明人通过研究发现，大菌在最适条件下单独培养，通过微滤收集大菌活性物质（主要为酶类物质），通过超滤对微滤滤液进行浓缩，将浓缩后的活性物质、山梨糖液和碱液流加入小菌发酵液中，以促进小菌转化山梨糖为2-KLG，以实现2-KLG的高效生产。因为小菌发酵时加入的是大菌的活性物质浓缩液，所以小菌在培养过程中也可以在最适条件下进行培养。通过进一步研究，得到了一种生产维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）的方法，如下所示：
一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法，其特征是：单独培养大菌，所得大菌发酵液先后经微滤和超滤处理得活性物质浓缩液，所得大菌活性物质浓缩液流加到小菌发酵培养基中促进小菌转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸。
上述制备方法中，所述大菌发酵液中大菌自溶（因为pH的变化而发生自溶，活性物质释放到发酵液中）。
上述制备方法中，大菌的培养过程包括菌种的活化、菌种的纯化、同步性菌种的制备、同步性菌种的培养、种子液的制备和发酵液的制备。本领域技术人员可以根据本发明的思路从现有技术中选取大菌培养的详细步骤，最优的，因为单独培养，所以选择大菌最适条件对其进行培养。
上述制备方法中，小菌的培养过程包括菌种的活化、菌种的分离纯化、小菌的培养、种子液的制备和发酵液的制备，除发酵液制备过程外，其他培养过程所用的培养基中都含有大菌活性物质浓缩液，含量均为0.1-0.3L/L培养基。
上述制备方法中，所述大菌活性物质浓缩液从发酵开始匀速流加至发酵结束。
上述制备方法中，所述大菌活性物质浓缩液流加量为发酵液原始体积的10-30%。
上述制备方法中，在发酵过程中还可以流加山梨糖溶液和pH维持剂（例如碳酸钠溶液、氢氧化钠溶液等，优选碳酸钠溶液）以保证发酵过程中山梨糖浓度保持在15-30mg/mL、pH保持在6.7-6.9。
制备大菌活性物质浓缩液时，微滤条件为：大菌发酵液通过1.0～1.5μm的微滤膜，滤膜压力为0.04～0.10MPa，流速为15～20m3/h。超滤条件为：大菌发酵液通过截留分子量为800～1200道尔顿的超滤膜系统进行处理，进口压力为0.15～0.20MPa，出口压力为0.05～0.10MPa，流速为10～15m3/h。
本发明所述大菌和小菌可以是现有技术中公开的混菌发酵中的所有的大菌和小菌，例如大菌可以为巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等，优选巨大芽孢杆菌；小菌可以为氧化葡萄糖酸杆菌、普通生酮基古龙酸菌等，优选为氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans），最优选为本公司自行诱变得到的氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）TL-1045 CGMCC NO.6188。
上述制备方法中，所述大菌培养方法包括以下步骤：
（1）菌种的活化：将茄瓶保存的大菌洗下接种到活化培养基中，在30-35℃、100-200 rpm的条件下培养10-14 h，得活化的大菌菌种液；
（2）菌种的纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的大菌菌种液进行梯度稀释，取10-5-10-7稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在30-35℃下培养24-36h；
（3）同步性菌种的制备：用接种环将步骤（2）中10-15个平板上培养得到的全部大菌菌落挑取到5ml无菌生理盐水中，搅拌均匀，制成大菌菌悬液，大菌菌悬液过2-3μm的微滤膜，个体较大的菌种被截留下来，收集截留部分，得到同步性大菌菌种；
（4）同步性菌种的培养：用接种环将步骤（3）中截留得到的同步性大菌菌种转移到0.2ml无菌生理盐水中，制成菌悬液；取菌悬液0.05-0.1ml接种到茄瓶中，涂布均匀，30-35℃培养1.5-2天；
（5）大菌种子液的制备：将步骤（4）中茄瓶培养得到的菌种接种到种子培养基中，在100-200 rpm、30-35℃条件下培养5-7h，得大菌种子液；
（6）大菌发酵液的制备：将步骤（5）得到的大菌种子液按10-15%的接种量接种到发酵培养基中，在150-300 rpm、通气比1-2L/L·min、30-35℃条件下培养8-13h，得大菌发酵液。
大菌发酵培养时，在培养过程中不控制发酵液的pH，随着发酵时间的延长，pH不断增加，在发酵结束时大菌因pH的变化而自溶，其中的活性物质释放出来，通过微滤和超滤可将活性成分进行收集和浓缩。
上述大菌培养方法中，所用培养基如下：
步骤（1）中活化培养基组成为：山梨糖2-8 g/L，葡萄糖 1-4 g/L，胰蛋白胨2-6g/L，酵母膏2-6 g/L，玉米浆2-6 g/L，硫酸镁1-3g/L，pH 6.8-7.5；
步骤（2）中平板培养基组成为：山梨糖5-10g/L，胰蛋白胨1-3g/L，尿素0.05-0.2 g/L，玉米浆2-6 g/L，牛肉膏0.5-2 g/L，酵母膏1-3 g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5 g/L，硫酸镁0.1-0.3 g/L，琼脂粉13 g/L，pH6.8-7.5;
步骤（4）中茄瓶培养基组成为：山梨糖3-6 g/L，酵母膏2-5 g/L，硫酸镁1-2 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.8-7.5；
步骤（5）中种子培养基组成为：山梨糖1-3g/L，胰蛋白胨5-15g/L，玉米浆2-6 g/L，酵母膏2-6 g/L，硫酸镁1-3g/L，pH 6.8-7.5；
步骤（6）中发酵培养基组成为：山梨糖5-15g/L，玉米浆2-6g/L，尿素0.05-0.15 g/L，，酵母膏2-6 g/L，牛肉膏2-6 g/L，碳酸钙0.05-0.15 g/L，磷酸二氢钾0.05-0.15 g/L，pH 6.8-7.5。
上述制备方法中，所述小菌发酵的步骤为：将小菌种子液按照10-20%的接种量接种到小菌发酵培养基中，在100-250 rpm、通气比1-1.5 L/L·min、温度27-29℃的条件下培养8-13 h，在发酵过程中流加山梨糖溶液和pH维持剂以保证发酵过程中山梨糖浓度保持在15-30mg/mL、pH保持在6.7-6.9，同时在发酵过程中匀速流加大菌的活性物质浓缩液，流加量为发酵液原始体积的10-30%。
小菌发酵时，发酵培养基包括以下成分：山梨糖10-25 g/L，葡萄糖3-6 g/L，玉米浆10-15 g/L，尿素0.1-0.2 g/L，pH 6.7-6.9。
小菌种子液的制备包括以下步骤：
（1）菌种的活化：将茄瓶保存的小菌用活化培养基洗下，接种在活化培养基中，在27-29℃下培养15-20h，得活化的菌种液；
（2）菌种的分离纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化的菌种液进行梯度稀释，取10-5-10-7稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在27-29℃下培养2-3天；
（3）小菌的培养：用接种环将步骤（2）中10-20个平板上培养得到的全部小菌菌落挑取到0.2 ml无菌生理盐水中，制成小菌菌悬液；取菌悬液0.05-0.1ml接种到茄瓶中，涂布均匀，27-29℃培养1.5-3天；
（4）种子液的制备：将步骤（3）中茄瓶培养得到的小菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，在27-29℃、100-200 rpm的条件下培养15-20 h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶。
制备小菌种子液时，所用培养基如下：
步骤（1）中活化培养基的组成为：山梨糖6-10 g/L，，胰蛋白胨1-3 g/L，酵母膏3-6g/L，大菌活性物质浓缩液0.1-0.3L/L，玉米浆5-8 g/L，尿素0.05-0.15 g/L，pH 6.7-6.9；
步骤（2）中平板培养基的组成为：山梨糖10-15g/L，胰蛋白胨2-3 g/L，尿素0.1-0.2 g/L，玉米浆3-5 g/L，牛肉膏0.5-1.5 g/L，大菌活性物质浓缩液0.1-0.3L/L，酵母膏0.5-1.0 g/L，磷酸二氢钾0.5-1.0 g/L，硫酸镁0.05-0.15 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.7-6.9；
步骤（3）中茄瓶培养基的组成为：山梨糖6-10 g/L，酵母膏3-5 g/L，大菌活性物质浓缩液0.1-0.3L/L，硫酸镁1-2 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.7-6.9；
步骤（4）中种子培养基的组成为：山梨糖10-15 g/L，葡萄糖3-6 g/L，玉米浆10-15 g/L，大菌活性物质浓缩液0.1-0.3L/L，尿素0.1-0.2 g/L，pH 6.7-6.9。
本发明将大菌进行单独培养，优选将大菌进行同步培养，能够满足大菌的最适生长条件，提高生产效率，采用先进的微滤和超滤技术收集大菌活性酶类物质往小菌发酵液中转移，进一步的可通过流加山梨糖溶液和pH维持剂稳定小菌发酵液的底糖和pH，增加小菌的数量，缩短菌体生长时间，加快小菌氧化山梨糖转化为2-KLG的反应速率，缩短发酵周期，提高产物浓度，降低生产成本，提高企业市场竞争力。
保藏信息
本发明所用菌种氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）TL-1045 CGMCC NO.6188已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.6188，保藏日期为2012年6月6日。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。但是本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体工艺条件、物料配比及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。
本发明的关键创新点是改变了大菌小菌混菌培养的传统思路，将大菌单独培养，小菌在大菌活性物质的存在下单独培养，这样可以让它们在各自最优的条件下成长、扩增，得到性能最佳的菌种。然后将得到的大菌活性成分浓缩液流加到小菌的发酵液中，提高小菌发酵效率。因为单独最适条件培养，所得菌种都在最佳状态，两者混合制备2-酮基-L-古龙酸效率得到大大提升，可以由原先的40-50h缩短到十几个小时，大大提高了生产效率。
本发明改进了菌种培养方法，将原先的混菌发酵改为大菌在最适条件下单独培养，然后将大菌的活性成分直接加入小菌发酵液中，以提高发酵效率。本发明大菌采用同步培养，筛选个体较大的菌种为同步性菌种，同步性菌种处的生理周期是一样的，也同时产孢，效率更高。本发明这一单独培养大菌，小菌发酵过程中流加大菌活性成分的思路可以适合于现有技术中公开的所有大菌和小菌，大菌例如巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等，小菌例如氧化葡萄糖酸杆菌、普通生酮基古龙酸菌等。所述菌种可以采用现有技术中公开的方法进行培养，例如，专利201110338275.2、201110338281.8、201210529451.5中公开的方法，除了将混菌发酵改成单菌发酵外，发酵制备2-酮基-L-古龙酸的方法也可以采用现有技术中公开的方法，例如专利201110338275.2、201110338281.8、201210529451.5、201110235170.4、200810180630.6、200910260056.X、201110169689.7等公开的方法。
下面列举使用本发明优选菌种的几个实施例，以证明本发明的有益效果。下述实施例所用小菌为氧化葡萄糖酸杆菌TL-1045，其为2-KLG高耐受型菌，已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC NO.6188，保藏日期为2012年6月6日，该菌种首次记载于专利CN 102757928中，该专利已于2012年10月31日公开；所用大菌为巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌ATCC 14581，购于上海复祥生物科技有限公司。
实施例1
一种2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）的制备方法，包括以下步骤：
1、大菌种子液的制备及发酵过程为：
（1）菌种的活化：将茄瓶保存的大菌培养基洗下接种到盛有活化培养基的摇瓶中，装液量20%，在31℃、100 rpm的条件下培养14h，活化培养基组成为：山梨糖3 g/L，葡萄糖 1 g/L，胰蛋白胨3g/L，酵母膏3g/L，玉米浆4 g/L，硫酸镁2g/L，pH 7.5；
（2）菌种的纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10-6稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在31℃下培养36h，平板培养基组成为：山梨糖5g/L，胰蛋白胨3g/L，尿素0.05 g/L，玉米浆2 g/L，牛肉膏2 g/L，酵母膏3 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.3 g/L，琼脂粉13 g/L，pH7.5；
（3）同步性菌种的分离：用接种环将步骤（2）中10个平板上培养得到的全部大菌菌落挑取到5ml无菌生理盐水中，搅拌均匀，制成大菌菌悬液，通过3μm的微滤膜对菌悬液进行过滤，收集截留部分，得到同步性大菌菌种；
（4）同步性大菌的培养：用接种环将步骤（3）中截留的同步性大菌全部转移到0.2 ml无菌生理盐水中，制成菌悬液；取菌悬液0.05mL接种到茄瓶中，涂布均匀，31℃培养2天，茄瓶培养基组成为：山梨糖3g/L，酵母膏5 g/L，硫酸镁2 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 7.5。
（5）大菌种液制备：将步骤（4）中茄瓶培养得到的种子培养基洗下，全部接种到盛有种子培养基的750mL摇瓶中，装液量20%，在100rpm、31℃条件下培养5h，得到大菌种子摇瓶，种子培养基组成为：山梨糖1g/L，胰蛋白胨15g/L，玉米浆2 g/L，酵母膏5g/L，硫酸镁1g/L，pH7.5；
（6）大菌发酵：将步骤（5）得到的种子液按15%的接种量接种到10L发酵罐中，装液量70%，在150 rpm、通气比1L/L·min、31℃条件下培养13h，大菌发酵培养基组成为：山梨糖15g/L，玉米浆2g/L，尿素0.05 g/L，酵母膏6 g/L，牛肉膏2g/L，碳酸钙0.05 g/L，磷酸二氢钾0.15 g/L，pH7.5。
2、大菌活性物质（也可称之为活性酶类物质）的收集及浓缩过程为：
（1）活性物质的收集：将发酵发酵所得的发酵液通过1.0μm的微滤膜过滤，滤膜压力0.04MPa，流速15m3/h，收集滤液，活性物质截留率99.1%。
（2）活性物质的浓缩：步骤（1）收集的滤液通过截留分子量为1200道尔顿的超滤膜系统进行处理，进口压力0.20MPa，出口压力0.10MPa，流速15m3/h，活性酶类物质得到截留，收集截留成分，收率99%，得到活性酶类物质浓缩液。
3、小菌种子液的制备及发酵过程为：
（1）菌种的活化：将茄瓶保存的小菌用活化培养基洗下，接种在活化培养基中，装液量20%，然后29℃下培养15h，活化培养基的组成为：山梨糖6 g/L，胰蛋白胨2 g/L，酵母膏3g/L，玉米浆6 g/L，大菌活性物质浓缩液0.1L/L，尿素0.15 g/L，pH 6.7；
（2）菌种的分离纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10-5稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在29℃下培养2天，平板培养基组成为：山梨糖12g/L，胰蛋白胨2g/L，尿素0.1g/L，玉米浆3 g/L，牛肉膏1.5 g/L，酵母膏0.5 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，大菌活性物质浓缩液0.1L/L，硫酸镁0.15 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.7；
（3）小菌的培养：用接种环将步骤（2）中15个平板上培养得到的全部小菌菌落挑取到0.2 ml无菌生理盐水中，制成小菌菌悬液；取菌悬液0.05ml接种到茄瓶中，涂布均匀，29℃培养3天，茄瓶培养基组成为：山梨糖7 g/L，酵母膏3 g/L，硫酸镁2 g/L，大菌活性物质浓缩液0.1L/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.7；
（4）小菌种子液的制备：将步骤（3）中茄瓶培养得到的小菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，装液量20%，在29℃，200 rpm的条件下培养15 h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶，种子培养基的组成为：山梨糖10 g/L，葡萄糖6 g/L，玉米浆13g/L，大菌活性物质浓缩液0.1L/L，尿素0.2 g/L，pH 6.7；
（5）小菌发酵：将步骤（4）得到的小菌种子液按10%的接种量接种到50L发酵罐中，装液量60%，发酵过程通过流加山梨糖溶液、碱液（碱液选用碳酸钠溶液或氢氧化钠溶液，优选碳酸钠溶液）稳定底糖浓度为15mg/mL，pH值为6.7，在发酵过程中同时还匀速流加发酵液原始体积（所述发酵液原始体积指的是发酵培养基灭菌后发酵罐中液体总体积，下同）10vol%的大菌发酵活性酶类浓缩液，在150 rpm、通气比1.5 L/L·min、温度29℃条件下培养13 h，发酵培养基的组成为：山梨糖15 g/L，葡萄糖3 g/L，玉米浆13 g/L，尿素0.2 g/L，pH 6.7。发酵13h后，2-KLG产量为135.8 g/L，山梨糖转化率96.3%。
实施例2
一种生产维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）的方法，所用菌种与实施例1相同，包括以下步骤：
大菌种子液的制备及发酵过程为：
（1）菌种的活化：将茄瓶保存的大菌培养基洗下接种到盛有活化培养基的摇瓶中，装液量20%，在30℃、150 rpm的条件下培养10h，活化培养基组成为：山梨糖2 g/L，葡萄糖 4 g/L，胰蛋白胨4g/L，酵母膏2g/L，玉米浆6 g/L，硫酸镁1g/L，pH7.0；
（2）菌种的纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10-7稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在30℃下培养30h，平板培养基组成为：山梨糖6g/L，胰蛋白胨1g/L，尿素0.1 g/L，玉米浆3 g/L，牛肉膏1.5 g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，硫酸镁0.1 g/L，琼脂粉13 g/L，pH7.0；
（3）同步性菌种的分离：用接种环将步骤（2）中15个平板上培养得到的全部大菌菌落挑取到5 ml无菌生理盐水中，搅拌均匀，制成大菌菌悬液，通过2μm的微滤膜对菌悬液进行过滤，收集截留部分，得到同步性大菌菌种；
（4）同步性大菌的培养：用接种环将步骤（3）中截留的同步性大菌转移到到0.2 ml无菌生理盐水中，制成菌悬液；取菌悬液0.05mL接种到茄瓶中，涂布均匀，30℃培养1.5天，茄瓶培养基组成为：山梨糖5g/L，酵母膏2 g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂粉17 g/L，pH 7.0。
（5）大菌种液制备：将步骤（4）中茄瓶培养得到的种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的750mL摇瓶中，装液量20%，在200rpm、30℃条件下培养7h，得到大菌种子摇瓶，种子培养基组成为：山梨糖2g/L，胰蛋白胨10g/L，玉米浆3 g/L，酵母膏6g/L，硫酸镁3g/L，pH7.0；
（6）大菌发酵：将步骤（5）得到的种子液按13%的接种量接种到10L发酵罐中，装液量70%，在300 rpm、通气比1L/L·min、30℃条件下培养10h，大菌发酵培养基组成为：山梨糖10g/L，玉米浆3g/L，尿素0.15 g/L，酵母膏3 g/L，牛肉膏4g/L，碳酸钙0.15 g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，pH7.0。
活性酶类物质的收集及浓缩过程为：
（1）活性物质的收集：大菌发酵液通过1.0μm的微滤膜过滤，滤膜压力0.1MPa，流量20m3/h，收集滤液，活性物质截留率98.6%。
（2）活性物质的浓缩：步骤（1）收集的滤液通过截留量800道尔顿的超滤膜系统进行处理，进口压力0.15MPa，出口压力0.10MPa，流量13m3/h，活性酶类物质得等截留，收集截留成分，收率99.2%，得到活性酶类物质浓缩液。
小菌种子液的制备及发酵过程为：
（1）菌种的活化：将茄瓶保存的小菌用活化培养基洗下，接种在活化培养基中，装液量20%，然后29℃下培养16h，活化培养基的组成为：山梨糖10 g/L，胰蛋白胨1 g/L，酵母膏5g/L，玉米浆8g/L，大菌活性物质浓缩液0.3L/L，尿素0.05 g/L，pH 6.9；
（2）菌种的分离纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10-7稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在29℃下培养3天，平板培养基组成为：山梨糖15g/L，胰蛋白胨2.5g/L，尿素0.15g/L，玉米浆4 g/L，牛肉膏0.5 g/L，酵母膏0.5 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，大菌活性物质浓缩液0.3L/L，硫酸镁0.05 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.9；
（3）小菌的培养：用接种环将步骤（2）中20个平板上培养得到的全部小菌菌落挑取到0.2 ml无菌生理盐水中，制成小菌菌悬液；取菌悬液0.05ml接种到茄瓶中，涂布均匀，29℃培养1.5天，茄瓶培养基组成为：山梨糖10g/L，酵母膏3 g/L，硫酸镁1 g/L，大菌活性物质浓缩液0.3L/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.9；
（4）小菌种子液的制备：将步骤（3）中茄瓶培养得到的小菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，装液量20%，在29℃，100 rpm的条件下培养16 h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶，种子培养基的组成为：山梨糖13 g/L，葡萄糖3 g/L，玉米浆15g/L，大菌活性物质浓缩液0.3L/L，尿素0.2 g/L，pH 6.9；
（5）小菌发酵：将步骤（4）得到的小菌种子液按10%的接种量接种到50L发酵罐中，装液量60%，发酵过程通过流加山梨糖溶液、碱液，碱液选用碳酸钠溶液，稳定底糖浓度25mg/mL，pH值6.9，匀速流加发酵液原始体积30%的大菌发酵活性酶类浓缩液，在250 rpm、通气比1.5 L/L·min、温度29℃条件下培养8 h，发酵培养基的组成为：山梨糖10 g/L，葡萄糖6 g/L，玉米浆15 g/L，尿素0.2 g/L，pH 6.9。发酵8h后，2-KLG产量为130.7 g/L，山梨糖转化率95.3%；
实施例3
一种生产维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）的方法，所用菌种与实施例1相同，包括以下步骤：
大菌种子液的制备及发酵过程为：
（1）菌种的活化：将茄瓶保存的大菌培养基洗下接种到盛有活化培养基的摇瓶中，装液量20%，在33℃、150 rpm的条件下培养13h，活化培养基组成为：山梨糖5 g/L，葡萄糖 3 g/L，胰蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，玉米浆2 g/L，硫酸镁3g/L，pH7.3；
（2）菌种的纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10-5稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在33℃下培养26h，平板培养基组成为：山梨糖6g/L，胰蛋白胨1g/L，尿素0.1 g/L，玉米浆3 g/L，牛肉膏1.5 g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，硫酸镁0.1 g/L，琼脂粉13 g/L，pH7.3；
（3）同步性菌种的分离：用接种环将步骤（2）中13个平板上培养得到的全部大菌菌落挑取到5 ml无菌生理盐水中，搅拌均匀，制成大菌菌悬液，通过3μm的微滤膜对菌悬液进行过滤，收集截留部分，得到同步性大菌菌种；
（4）同步性大菌的培养：用接种环将步骤（3）中截留的同步性大菌转移到到0.2 ml无菌生理盐水中，制成菌悬液；取菌悬液0.05mL接种到茄瓶中，涂布均匀，33℃培养1.5天，茄瓶培养基组成为：山梨糖6g/L，酵母膏3 g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂粉17 g/L，pH 7.3。
（5）大菌种液制备：将步骤（4）中茄瓶培养得到的种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的750mL摇瓶中，装液量20%，在175rpm、33℃条件下培养6.5h，得到大菌种子摇瓶，种子培养基组成为：山梨糖3g/L，胰蛋白胨10g/L，玉米浆5 g/L，酵母膏3g/L，硫酸镁1.5g/L，pH7.3。
（6）大菌发酵：将步骤（5）得到的种子液按13%的接种量接种到10L发酵罐中，装液量70%，在230 rpm、通气比1.5L/L·min、33℃条件下培养11h，大菌发酵培养基组成为：山梨糖10g/L，玉米浆6g/L，尿素0.1 g/L，酵母膏2g/L，牛肉膏3g/L，碳酸钙0.15 g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，pH7.3。
活性酶类物质的收集及浓缩过程为：
（1）活性物质的收集：大菌发酵液通过1.0μm的微滤膜过滤，滤膜压力0.08MPa，流量16m3/h，收集滤液，活性物质截留率99.5%。
（2）活性物质的浓缩：步骤（1）收集的滤液通过截留量1000道尔顿的超滤膜系统进行处理，进口压力0.15MPa，出口压力0.1MPa，流量12m3/h，活性酶类物质得等截留，收集截留成分，收率99.6%，得到活性酶类物质浓缩液。
小菌种子液的制备及发酵过程为：
（1）菌种的活化：将茄瓶保存的小菌用活化培养基洗下，接种在活化培养基中，装液量20%，然后27.5℃下培养16h，活化培养基的组成为：山梨糖8 g/L，胰蛋白胨3 g/L，酵母膏3g/L，玉米浆5g/L，大菌活性物质浓缩液0.2L/L，尿素0.15 g/L，pH 6.8；
（2）菌种的分离纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10-6稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在27.5℃下培养2.5天，平板培养基组成为：山梨糖10g/L，胰蛋白胨2g/L，尿素0.15g/L，玉米浆4 g/L，牛肉膏1 g/L，酵母膏0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，大菌活性物质浓缩液0.2L/L，硫酸镁0.1 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.8；
（3）小菌的培养：用接种环将步骤（2）中15个平板上培养得到的全部小菌菌落挑取到0.2 ml无菌生理盐水中，制成小菌菌悬液；取菌悬液0.1ml接种到茄瓶中，涂布均匀，27.5℃培养2天，茄瓶培养基组成为：山梨糖6g/L，酵母膏3 g/L，硫酸镁2 g/L，大菌活性物质浓缩液0.2L/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.8；
（4）小菌种子液的制备：将步骤（3）中茄瓶培养得到的小菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，装液量20%，在27.5℃，200 rpm的条件下培养18 h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶，种子培养基的组成为：山梨糖13 g/L，葡萄糖5 g/L，玉米浆10g/L，大菌活性物质浓缩液0.2L/L，尿素0.1 g/L，pH 6.8；
（5）小菌发酵：将步骤（4）得到的小菌种子液按15%的接种量接种到50L发酵罐中，装液量60%，发酵过程通过流加山梨糖溶液、碱液，碱液选用碳酸钠溶液，稳定底糖浓度25mg/mL，pH值6.8，匀速流加发酵液原始体积25%的大菌发酵活性酶类浓缩液，在200 rpm、通气比1.5 L/L·min、温度27.5℃条件下培养12 h，发酵培养基的组成为：山梨糖20 g/L，葡萄糖4 g/L，玉米浆13 g/L，尿素0.2 g/L，pH 6.8。发酵12h后，2-KLG产量为145 g/L，山梨糖转化率98.8%。
实施例4
一种生产维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸（2-KLG）的方法，所用菌种与实施例1相同，包括以下步骤：
大菌种子液的制备及发酵过程为：
（1）菌种的活化：将茄瓶保存的大菌培养基洗下接种到盛有活化培养基的摇瓶中，装液量20%，在35℃、200 rpm的条件下培养10h，活化培养基组成为：山梨糖8 g/L，葡萄糖 1 g/L，胰蛋白胨6g/L，酵母膏6g/L，玉米浆2 g/L，硫酸镁1g/L，pH6.8；
（2）菌种的纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10-6稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在35℃下培养24h，平板培养基组成为：山梨糖10g/L，胰蛋白胨2g/L，尿素0.2 g/L，玉米浆6 g/L，牛肉膏0.5 g/L，酵母膏2g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，琼脂粉13 g/L，pH6.8；
（3）同步性菌种的分离：用接种环将步骤（2）中10个平板上培养得到的全部大菌菌落挑取到5 ml无菌生理盐水中，搅拌均匀，制成大菌菌悬液，通过3μm的微滤膜对菌悬液进行过滤，收集截留部分，得到同步性大菌菌种；
（4）同步性大菌的培养：用接种环将步骤（3）中截留的同步性大菌转移到到0.2 ml无菌生理盐水中，制成菌悬液；取菌悬液0.1mL接种到茄瓶中，涂布均匀，35℃培养2天，茄瓶培养基组成为：山梨糖6g/L，酵母膏5 g/L，硫酸镁1g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.8。
（5）大菌种液制备：将步骤（4）中茄瓶培养得到的种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的750mL摇瓶中，装液量20%，在150rpm、35℃条件下培养6h，得到大菌种子摇瓶，种子培养基组成为：山梨糖3g/L，胰蛋白胨5g/L，玉米浆6g/L，酵母膏2g/L，硫酸镁1.5g/L，pH6.8。
（6）大菌发酵：将步骤（5）得到的种子液按10%的接种量接种到10L发酵罐中，装液量70%，在200 rpm、通气比2L/L·min、35℃条件下培养8h，大菌发酵培养基组成为：山梨糖5g/L，玉米浆6g/L，尿素0.1 g/L，酵母膏3g/L，牛肉膏6g/L，碳酸钙0.1 g/L，磷酸二氢钾0.15g/L，pH6.8。
活性酶类物质的收集及浓缩过程为：
（1）活性物质的收集：大菌发酵液通过1.5μm的微滤膜过滤，滤膜压力0.1MPa，流量20m3/h，收集滤液，活性物质截留率97.3%。
（2）活性物质的浓缩：步骤（1）收集的滤液通过截留量1000道尔顿的超滤膜系统进行处理，进口压力0.15MPa，出口压力0.05MPa，流量10m3/h，活性酶类物质得等截留，收集截留成分，收率98.8%，得到活性酶类物质浓缩液。
小菌种子液的制备及发酵过程为：
（1）菌种的活化：将茄瓶保存的小菌用活化培养基洗下，接种在活化培养基中，装液量20%，然后27℃下培养20h，活化培养基的组成为：山梨糖8 g/L，胰蛋白胨1g/L，酵母膏6g/L，玉米浆5g/L，大菌活性物质浓缩液0.15L/L，尿素0.15 g/L，pH 6.7；
（2）菌种的分离纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10-6稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在27℃下培养2.5天，平板培养基组成为：山梨糖10g/L，胰蛋白胨3g/L，尿素0.2g/L，玉米浆3g/L，牛肉膏0.5 g/L，酵母膏1 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，大菌活性物质浓缩液0.15L/L，硫酸镁0.05 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.7；
（3）小菌的培养：用接种环将步骤（2）中10个平板上培养得到的全部小菌菌落挑取到0.2 ml无菌生理盐水中，制成小菌菌悬液；取菌悬液0.1ml接种到茄瓶中，涂布均匀，27℃培养3天，茄瓶培养基组成为：山梨糖8g/L，酵母膏5 g/L，硫酸镁1 g/L，大菌活性物质浓缩液0.15L/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.7；
（4）种子液的制备：将步骤（3）中茄瓶培养得到的小菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，装液量20%，在27℃，150 rpm的条件下培养20 h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶，种子培养基的组成为：山梨糖15g/L，葡萄糖3 g/L，玉米浆10g/L，大菌活性物质浓缩液0.15L/L，尿素0.2 g/L，pH 6.7；
（5）小菌发酵：将步骤（4）得到的小菌种子液按20%的接种量接种到50L发酵罐中，装液量60%，发酵过程通过流加山梨糖溶液、碱液，碱液选用碳酸钠溶液，稳定底糖浓度30mg/mL，pH值6.7，匀速流加发酵液原始体积30%的大菌发酵活性酶类浓缩液，在100 rpm、通气比1 L/L·min、温度27℃条件下培养13h，发酵培养基的组成为：山梨糖25 g/L，葡萄糖5g/L，玉米浆10 g/L，尿素0.1g/L，pH 6.7。发酵13h后，2-KLG产量为123.6 g/L，山梨糖转化率94.3%；
对照实施例1
采用混菌发酵技术和上述实施例中相同的大菌和小菌。包括以下步骤：
（1）菌种的活化：用活化培养基将长有大、小菌的茄瓶上菌体全部洗下，接种到活化培养基中，装液量20%，200rpm，27℃培养18 h；活化培养基组成为：山梨糖10 g/L，葡萄糖3g/L，酵母膏5 g/L，玉米浆5g/L，尿素0.2 g/L，pH 7.2；
（2）菌种的分离纯化：无菌条件下，用无菌生理盐水将（1）中活化的菌种液进行梯度稀释，取10-7稀释液0.1 ml涂布在分离用平板上，平板27℃培养5天；平板培养基组成为：山梨糖5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，尿素0.05 g/L，玉米浆2 g/L，牛肉膏2 g/L，酵母膏2 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，硫酸镁0.3 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 7.2；
（3）茄瓶的制备：用接种环将（2）中15个平板上培养所得的全部小菌菌落挑取到0.2ml无菌生理盐水中，作为小菌菌悬液；然后从（2）中平板上选择色白、饱满且边缘整齐的大菌菌落，用接种环在大菌菌落内环和外环之间挑取针尖大小大菌接到小菌菌悬液中，搅拌混匀作为混菌悬液；取混菌悬液0.1 ml接种到空白茄瓶培养基中，涂布均匀，27℃培养5天；茄瓶培养基组成为：山梨糖8 g/L，酵母膏6 g/L，硫酸镁1 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 7.2；
（4）种子液的制备：吸取少量种子培养基将（3）中茄瓶菌体全部洗下，接种到三角摇瓶中，一个茄瓶接两个三角摇瓶（750ml），装液量20%，220 rpm，27℃培养18 h；种子培养基组成为：山梨糖10 g/L，葡萄糖4 g/L，玉米浆5 g/L，尿素0.2 g/L，pH 6.7；
（5）10L发酵罐培养：装液量70%，按15%接种量将步骤（4）中摇瓶种子液接种到扩大培养基中，150rpm，通气比为1L/L·min，29℃培养13h，种子培养基组成为：山梨糖10g/L，葡萄糖5g/L，玉米浆5g/L，尿素0.2g/L，pH6.7；
（6）50L发酵罐培养：装液量60%，按10%接种量将步骤（5）中扩大培养种子液接种到发酵培养基中，在150rpm，普通空气通气比为1 L/L·min，29℃下培养，流加山梨糖控制山梨糖浓度15-20g/L，流加碳酸钠溶液控制pH 为6.7；发酵18h，发酵醪液中2-KLG含量为98.5 g/L，山梨糖转化率92.3%。
对照实施例2
采用混菌发酵技术和上述实施例中相同的大菌和小菌。包括以下步骤：
步骤（1）、（2）、（3）、（4）同对照实施例1；
（5）10L发酵罐培养：装液量70%，按10%接种量将步骤（4）中摇瓶种子液接种到扩大培养基中，200rpm，通气比为1.5L/L·min，29℃培养14h，种子培养基组成为：山梨糖10g/L，葡萄糖5g/L，玉米浆6g/L，尿素0.15g/L，pH6.9；
（6）50L发酵罐培养：装液量60%，按15%接种量将步骤（5）中扩大培养种子液接种到发酵培养基中，在200rpm，普通空气通气比为1.5 L/L·min，29℃下培养，流加山梨糖控制山梨糖浓度15-20g/L，流加碳酸钠溶液控制pH 为6.9；发酵20h，发酵醪液中2-KLG含量为113 g/L，山梨糖转化率94.7%。
从上述实施例可以看出，在巨大芽孢杆菌最适条件下同步培养，通过微滤、超滤收集浓缩菌体自溶后的活性成分流加入氧化葡萄糖酸杆菌发酵液中，促进氧化葡萄糖酸杆菌转化山梨糖为2-KLG，大大提高了2-KLG的高效生产，大大降低了生产成本，更有利于工业化生产。
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。
Claims (7)
1.一种2-酮基-L-古龙酸的制备方法，其特征是：单独培养大菌，所得大菌发酵液先后经微滤和超滤处理得活性物质浓缩液，所得大菌活性物质浓缩液流加到小菌发酵培养基中促进小菌转化山梨糖为2-酮基-L-古龙酸；
大菌培养方法包括以下步骤：
（1）菌种的活化：将茄瓶保存的大菌洗下接种到活化培养基中，在30-35℃、100-200 rpm的条件下培养10-14 h，得活化的大菌菌种液；
（2）菌种的纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的大菌菌种液进行梯度稀释，取10-5-10-7稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在30-35℃下培养24-36h；
（3）同步性菌种的制备：用接种环将步骤（2）中10-15个平板上培养得到的全部大菌菌落挑取到5ml无菌生理盐水中，搅拌均匀，制成大菌菌悬液，大菌菌悬液过2-3μm的微滤膜，收集截留部分，得到同步性大菌菌种；
（4）同步性菌种的培养：用接种环将步骤（3）中截留得到的同步性大菌菌种转移到0.2ml无菌生理盐水中，制成菌悬液；取菌悬液0.05-0.1ml接种到茄瓶中，涂布均匀，30-35℃培养1.5-2天；
（5）大菌种子液的制备：将步骤（4）中茄瓶培养得到的菌种接种到种子培养基中，在100-200 rpm、30-35℃条件下培养5-7h，得大菌种子液；
（6）大菌发酵液的制备：将步骤（5）得到的大菌种子液按10-15%的接种量接种到发酵培养基中，在150-300 rpm、通气比1-2L/L·min、30-35℃条件下培养8-13h，得大菌发酵液；
大菌培养时，所用培养基如下：
步骤（1）中活化培养基组成为：山梨糖2-8 g/L，葡萄糖 1-4 g/L，胰蛋白胨2-6g/L，酵母膏2-6 g/L，玉米浆2-6 g/L，硫酸镁1-3g/L，pH 6.8-7.5；
步骤（2）中平板培养基组成为：山梨糖5-10g/L，胰蛋白胨1-3g/L，尿素0.05-0.2 g/L，玉米浆2-6 g/L，牛肉膏0.5-2 g/L，酵母膏1-3 g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5 g/L，硫酸镁0.1-0.3 g/L，琼脂粉13 g/L，pH6.8-7.5;
步骤（4）中茄瓶培养基组成为：山梨糖3-6 g/L，酵母膏2-5 g/L，硫酸镁1-2 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.8-7.5；
步骤（5）中种子培养基组成为：山梨糖1-3g/L，胰蛋白胨5-15g/L，玉米浆2-6 g/L，酵母膏2-6 g/L，硫酸镁1-3g/L，pH 6.8-7.5；
步骤（6）中发酵培养基组成为：山梨糖5-15g/L，玉米浆2-6g/L，尿素0.05-0.15 g/L，酵母膏2-6 g/L，牛肉膏2-6 g/L，碳酸钙0.05-0.15 g/L，磷酸二氢钾0.05-0.15 g/L，pH 6.8-7.5；
小菌的培养过程包括菌种的活化、菌种的分离纯化、小菌的培养、种子液的制备和发酵液的制备，除发酵液制备过程外，其他培养过程所用的培养基中都含有大菌活性物质浓缩液，含量均为0.1-0.3L/L培养基；
小菌发酵的步骤为：将小菌种子液按照10-20%的接种量接种到小菌发酵培养基中，在100-250 rpm、通气比1-1.5 L/L·min、温度27-29℃的条件下培养8-13 h，在发酵过程中流加山梨糖溶液和pH维持剂以保证发酵过程中山梨糖浓度保持在15-30mg/mL、pH保持在6.7-6.9，同时在发酵过程中匀速流加大菌的活性物质浓缩液，流加量为发酵液原始体积的10-30%；
小菌发酵培养基包括以下成分：山梨糖10-25 g/L，葡萄糖3-6 g/L，玉米浆10-15 g/L，尿素0.1-0.2 g/L，pH 6.7-6.9。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：所得大菌发酵液中大菌自溶，大菌的活性物质释放到发酵液中；
所述大菌活性物质浓缩液从发酵开始匀速流加至发酵结束。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：微滤时，大菌发酵液通过1.0～1.5μm的微滤膜，滤膜压力为0.04～0.10MPa，流速为15～20m3/h；超滤时，大菌发酵液通过截留分子量为800～1200道尔顿的超滤膜系统进行处理，进口压力为0.15～0.20MPa，出口压力为0.05～0.10MPa，流速为10～15m3/h。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是：所述大菌为巨大芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌；所述小菌为氧化葡萄糖酸杆菌或普通生酮基古龙酸菌。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：所述小菌为氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）TL-1045 CGMCC NO.6188。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是：小菌种子液的制备包括以下步骤：
（1）菌种的活化：将茄瓶保存的小菌用活化培养基洗下，接种在活化培养基中，在27-29℃下培养15-20h，得活化的菌种液；
（2）菌种的分离纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化的菌种液进行梯度稀释，取10-5-10-7稀释液0.1 ml涂布在平板上，然后将平板在27-29℃下培养2-3天；
（3）小菌的培养：用接种环将步骤（2）中10-20个平板上培养得到的全部小菌菌落挑取到0.2 ml无菌生理盐水中，制成小菌菌悬液；取菌悬液0.05-0.1ml接种到茄瓶中，涂布均匀，27-29℃培养1.5-3天；
（4）种子液的制备：将步骤（3）中茄瓶培养得到的小菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，在27-29℃、100-200 rpm的条件下培养15-20 h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征是，制备小菌种子液时，所用培养基如下：
步骤（1）中活化培养基的组成为：山梨糖6-10 g/L，胰蛋白胨1-3 g/L，酵母膏3-6g/L，大菌活性物质浓缩液0.1-0.3L/L，玉米浆5-8 g/L，尿素0.05-0.15 g/L，pH 6.7-6.9；
步骤（2）中平板培养基的组成为：山梨糖10-15g/L，胰蛋白胨2-3 g/L，尿素0.1-0.2 g/L，玉米浆3-5 g/L，牛肉膏0.5-1.5 g/L，大菌活性物质浓缩液0.1-0.3L/L，酵母膏0.5-1.0 g/L，磷酸二氢钾0.5-1.0 g/L，硫酸镁0.05-0.15 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.7-6.9；
步骤（3）中茄瓶培养基的组成为：山梨糖6-10 g/L，酵母膏3-5 g/L，大菌活性物质浓缩液0.1-0.3L/L，硫酸镁1-2 g/L，琼脂粉17 g/L，pH 6.7-6.9；
步骤（4）中种子培养基的组成为：山梨糖10-15 g/L，葡萄糖3-6 g/L，玉米浆10-15 g/L，大菌活性物质浓缩液0.1-0.3L/L，尿素0.1-0.2 g/L，pH 6.7-6.9。
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