CN103789387B - 一种提高维生素c中间体2-酮基-l-古龙酸生产效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法以山梨糖为底物，以氧化葡糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌为菌种混菌发酵制备2-酮基-L-古龙酸，在整个发酵过程中，维持发酵液中高溶解氧浓度，以促进菌体生长、提高2-酮基-L-古龙酸的转化效率，实现2-酮基-L-古龙酸的高效生产。本发明缩短了发酵周期，提高了产物浓度，显著提高了2-酮基-L-古龙酸生产效率，经济效益好。

Description

一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法

技术领域

本发明涉及一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法，具体为在发酵生产过程中通入富氧空气，提高发酵液中的溶解氧浓度，以提高2-酮基-L-古龙酸生产效率，属于维生素C生产技术领域。

背景技术

维生素C又称L-抗坏血酸，它能参与体内多种氧化还原反应及羟化反应，是一类重要的细胞代谢氧化还原化合物，在人体内起到必不可少的重要生理作用，如治疗人类坏血病，增强人体抵抗力。绿色植物能够自己合成维生素C，然而人和许多动物由于身体肝脏中缺少古洛内酯氧化酶，因此不能自己合成，必须从外界摄取。目前维生素C已广泛应用于医药、食品、保健品和化妆品等领域。并且随着其用途的开发和人们物质文化生活水平的提高，对维生素C的需求量也不断增加。

1933年，德国化学家Reichstein等发明了以化学合成法为主的莱氏法，是最早工业化生产维生素C的方法，但此法合成路线过长，有毒有害的中间产物以及有机原料消耗量多，导致维生素C生产成本较高。七十年代初，我国首创了维生素C二步发酵法并将其应用于工业生产。该法在莱氏法一步发酵的基础上，采用混菌发酵，使山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，工艺简单、成本低、无污染，是目前维生素C工业生产的主要方法。

维生素C生产中采用两步发酵获得中间体2-酮基-L-古龙酸，第一步是在醋酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖，此步发酵工艺成熟，发酵周期约为20h，且转化率很高，现已能达98%以上；第二步是将L-山梨糖进一步氧化生成2-酮基-L-古龙酸，此步发酵由两种微生物混菌发酵进行，一种为氧化葡萄糖酸杆菌（又名氧化葡糖酸杆菌，拉丁文命名为Gluconobacteroxydans），俗称小菌，另一种常采用巨大芽孢杆菌，俗称大菌。小菌能够转化山梨糖生成2-酮基-L-古龙酸，但其单独培养生长较弱；大菌不能产酸，但和小菌混合培养，能够显著促进小菌产酸。目前维生素C生产第二步发酵，发酵周期约为40-50h，产物浓度约为80-95g/L，转化率约为80-90%。第二步发酵周期长、产物浓度和转化率相对较低，因此是限制维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的关键环节。

为了进一步提高维生素C发酵的生产效率，近年来许多研究机构对维生素C第二步发酵进行了研究。专利200910148114.X公开了一种维生素C第二步发酵菌种制备方法，菌种茄瓶制备过程中，先将小菌接种茄瓶，培养16-48h，然后再接种大菌，继续培养24-72h，这种条件下，可以提高小菌在混菌中的比例，提高菌种活力，发酵45h，2-酮基-L-古龙酸可达到100g/L，转化率达到90%左右，该方法效率有所提高，但是发酵时间仍然较长。专利200910069697.7公开了一种在发酵过程中添加巯基化合物来取代大菌促进小菌的生长和产酸，但其生产效率仍低于大、小菌混菌发酵的效率。专利200910034773.0公开了一种强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，通过添加海藻糖，提高菌体对古龙酸的耐受性，发酵52h，2-酮基-L-古龙酸可达到69.38g/L，该方法需要添加海藻糖，海藻糖价格较高，导致生产成本上升，不具有实用性。

富氧是应用物理或化学方法将空气中的氧气进行收集，使收集后气体中的氧气含量＞21%。随着技术的发展，现已经发展了低温法和膜分离法制备富氧空气，富氧空气制备技术成熟，使得富氧空气成本下降，富氧空气日趋广泛的应用到工业生产中。目前通过富氧空气发酵，提高2-酮基-L-古龙酸生产效率尚未有文献报道。

发明内容

本发明针对现有维生素C生产过程中第二步发酵生产效率低下的问题，提供了一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法。

维生素C二步发酵生产方法中，第二步发酵将L-山梨糖混菌发酵产生2-酮基-L-古龙酸的过程中生产效率偏低，主要原因是将山梨糖氧化生成2-酮基-L-古龙酸的氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）（俗称小菌）生长缓慢，且现今公开的小菌菌种转化生产2-酮基-L-古龙酸的效率也较低，致使中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率低。发明人在研究过程中发现，在发酵过程中，通入富氧空气或氧气、提高溶解氧浓度的情况下，可以显著增加小菌的生长速度和数量，同时能够增加小菌转化生产2-酮基-L-古龙酸的效率，提高2-酮基-L-古龙酸的产量和生产效率。发明人进一步的进行了研究，得到了提高2-酮基-L-古龙酸生产效率的技术方案，如下所示：

一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法，以山梨糖为底物，以氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）和巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）为菌种混菌发酵制备2-酮基-L-古龙酸，在整个发酵过程中，维持发酵液中高溶解氧浓度，以促进菌体生长、提高2-酮基-L-古龙酸的转化效率，实现2-酮基-L-古龙酸的高效生产。

在现今混菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法中，每个阶段发酵液中溶解氧的浓度变化较大，例如在产酸前期，溶解氧浓度较高，在50%以上，而在发酵中期和后期，溶解氧的浓度减小，在50%以下，在整个发酵过程中发酵液中的溶解氧浓度在5-100%范围内变动。研究发现，在其他主要工艺条件不变的情况下（例如所用的菌种，培养条件等），整体上提高整个发酵过程中发酵液中的溶解氧浓度可以促进菌体生长，提高2-酮基-L-古龙酸转化速率，缩短发酵周期，提高2-酮基-L-古龙酸的产量，实现2-酮基-L-古龙酸高效生产，而发酵过程中溶解氧应满足：在整个发酵过程中，溶解氧浓度应始终保持在55-100%范围内。溶解氧浓度越高，其2-酮基-L-古龙酸的产量越高，优选的溶解氧浓度可保持在62.3-100%，更优选可维持在71.3-100%。

在有氧发酵中，一般都是通入空气，但是空气中氧气浓度较低，要达到溶解氧始终在55%以上比较困难。本发明提高溶解氧浓度可以采用通入氧气或者富氧空气的方式实现，所述富氧空气为氧气体积浓度＞21%的空气，优选氧气体积浓度为30-99%的富氧空气，最优选氧气体积浓度为45-75%的富氧空气。富氧空气可以用现有技术中公开的方法制备，制备技术成熟，成本低，因此优选采用通入富氧空气提高溶解氧浓度。在发酵过程中，氧气或富氧空气一般按照一定的通气比持续通入发酵液中，一般保证通气比为0.2-1.5L/L·min即可满足溶解氧浓度要求。

在不改变其他发酵条件的情况下，仅采用本发明方法提高发酵液中溶解氧浓度后，混菌发酵的时间可由40-50h缩短至12-20h，大大提高了生产效率。

上述方法中，混菌发酵过程可以采用现有技术中公开的以山梨糖为底物，采用氧化葡萄糖酸杆菌（即氧化葡糖酸杆菌，下同）和巨大芽孢杆菌为混合菌种的任意混菌发酵的方法，所用的菌种可以是任意现有技术中公开的氧化葡萄糖酸杆菌（简称为小菌）和巨大芽孢杆菌（简称为大菌），所用的培养基可以根据所用的菌种在现有技术中进行选择，所用的培养条件可以根据现有技术中公开的内容进行选择。

进一步的，在上述提高发酵液溶解氧浓度的基础上，本发明可以采用优选的氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）TL-1045CGMCCNO.6188或/和巨大芽孢杆菌ATCC14581为菌种，使本发明效果更突出，更有利于工业化大生产应用。

上述氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）TL-1045CGMCCNO.6188的诱变筛选过程为：以筛选得到的氧化葡糖酸杆菌TL-347为出发菌株，TL-347对2-酮基-L-古龙酸的耐受浓度为85g/L，发酵生产2-酮基-L-古龙酸的产量约为95g/L。挑取出发菌株氧化葡糖酸杆菌TL-347的单菌落，接入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，加30ml无菌生理盐水，150rpm震荡20min，将菌落打散，制成菌悬液。取菌悬液5ml加入培养皿中，于40瓦紫外灯下，20-40cm处照射1min、5min、10min，然后将三个处理的菌悬液分别稀释至10^-3-10^-5，涂布含有筛选培养基（2-酮基-L-古龙酸90-130g/L，山梨糖15g/L，胰蛋白胨3g/L，尿素0.1g/L，玉米浆4g/L，牛肉膏1.2g/L，酵母膏1.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，琼脂粉17g/L，pH6.7）的平板中，避光培养72h，挑取平板上的菌落，分别和巨大芽孢杆菌搭配，然后混菌接发酵摇瓶，检测发酵产2-酮基-L-古龙酸效率，将初步筛选的菌株反复多次诱变得到本发明中的2-酮基-L-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌TL-1045，其在110g/L或更高浓度的2-酮基-L-古龙酸中能够正常生长繁殖，其与巨大芽孢杆菌混菌发酵所得发酵液中2-酮基-L-古龙酸产量在125g/L以上，L-山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率在90%以上。

对氧化葡糖酸杆菌TL-1045的分类学特征进行研究，如下：

一、氧化葡糖酸杆菌TL-1045的菌体和菌落形态见表1。

二、氧化葡糖酸杆菌TL-1045的生理生化特征见表2。

在采用优选的菌种氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）TL-1045CGMCCNO.6188和巨大芽孢杆菌ATCC14581进行混菌发酵生产2-酮基-L-古龙酸时，需要先对菌种进行活化、纯化、混合培养、种子液制备等步骤制成种子液，以满足发酵时接种量的要求。其中，种子液的制备过程为：

（1）菌种的活化：将用茄瓶保存的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖酸杆菌用活化培养基洗下，接种在活化培养基中，然后于27-32℃下培养18-24h，得活化的菌种液；所用活化培养基的组成为：山梨糖5-15g/L，葡萄糖2-5g/L，酵母膏3-8g/L，玉米浆3-10g/L，尿素0.05-0.2g/L，pH6.7-7.2。

（2）菌种的分离纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10^-5-10^-7稀释液0.1ml涂布在平板上，然后将平板在27-32℃下培养4-6天；所用平板培养基组成为：山梨糖5-20g/L，胰蛋白胨1-5g/L，尿素0.05-0.2g/L，玉米浆2-6g/L，牛肉膏0.5-2g/L，酵母膏0.5-2.0g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L，琼脂粉17g/L，pH6.7-7.2。

（3）混菌的培养：用接种环将步骤（2）中10-25个平板上培养得到的全部氧化葡糖酸杆菌菌落挑取到0.2ml无菌生理盐水中，制成氧化葡糖酸杆菌菌悬液；然后从步骤（2）中平板上选择巨大芽孢杆菌菌落，用接种环在巨大芽孢杆菌菌落内环和外环之间挑取针尖大小的巨大芽孢杆菌接到氧化葡糖酸杆菌菌悬液中，搅拌混匀制得混菌悬液；取混菌悬液0.05-0.1ml接种到茄瓶培养基中，涂布均匀，27-32℃培养3-5天；所用茄瓶培养基组成为：山梨糖3-8g/L，酵母膏2-6g/L，硫酸镁1-3g/L，琼脂粉17g/L，pH6.7-7.2。

（4）种子液的制备：将步骤（3）中茄瓶培养得到的混菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，在27-32℃、80-250rpm的条件下培养18-24h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶；所用种子培养基的组成为：山梨糖8-20g/L，葡萄糖1-5g/L，玉米浆5-12g/L，尿素0.05-0.2g/L，pH6.7-7.2。

（5）种子液的扩大培养：将步骤（4）得到的种子液按5-20%的接种量接种到扩大培养基中，在80-250rpm、富氧空气或氧气通气比0.2-1.5L/L·min、27-32℃条件下培养10-15h，富氧空气氧气含量为30-99%；所用扩大培养基组成为：山梨糖8-20g/L，葡萄糖1-5g/L，玉米浆5-12g/L，尿素0.05-0.2g/L，pH6.7-7.2。

所得种子液接种于发酵培养基中进行混菌发酵，混菌发酵的过程为：将种子液按照5-20%的接种量接入发酵培养基中，在温度27-32℃、转速80-250rpm条件下进行混菌发酵，发酵时间一般为12-20h，在发酵过程维持溶解氧浓度为55-100%，流加碱性物质溶液控制pH为6.7-7.3，当发酵液中L-山梨糖下降到5-15g/L时，流加L-山梨糖保持L-山梨糖浓度为10-25g/L。混菌发酵培养基组成为：山梨糖20-30g/L，玉米浆5-12g/L，尿素0.05-0.2g/L，pH6.7-7.3。为了保证溶解氧浓度，优选通过向发酵液中持续通入氧气或富氧空气的形式实现，氧气或富氧空气的通气比为0.2-1.5L/L·min。混菌发酵时流加的碱性物质溶液优选为碳酸钠溶液。

采用优选菌种，在改进发酵液中溶解氧浓度的情况下，发酵结束后，发酵液中2-酮基-L-古龙酸含量不低于125g/L，山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率在95%以上。

在采用现有技术中公开的菌种进行混菌发酵时，也需要经菌种活化、分离、混合培养等步骤提前进行种子液的制备，以满足发酵接种要求，种子液制备过程可以根据所用菌种从现有技术中公开的内容中进行选择。

本发明在发酵过程中提高溶解氧的浓度，可以促进小菌的生长，增加小菌的数量，缩短菌体生长时间，同时可加快小菌氧化山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸的反应速率，缩短发酵周期，提高产物浓度，显著提高2-酮基-L-古龙酸生产效率。优选采用通入富氧空气的方式提高溶解氧浓度，因富氧空气价格低，技术成熟，使生产成本更低，经济效益更好。

保藏信息

本发明所用优选菌种氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）TL-1045已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNO.6188，保藏日期为2012年6月6日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。但是本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体工艺条件、物料配比及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。

实施例1

所用氧化葡萄糖酸杆菌为氧化葡萄糖酸杆菌TL-1045，其为2-酮基-L-古龙酸高耐受型菌，简称为小菌，已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNO.6188，保藏日期为2012年6月6日；所用巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌ATCC14581，简称为大菌，购于上海复祥生物科技有限公司。

利用富氧空气发酵制备2-酮基-L-古龙酸，包括以下步骤：

（1）菌种的活化：用活化培养基将长有大、小菌的茄瓶上菌体全部洗下，接种到活化培养基中，装液量20%，220rpm，27℃培养18h；活化培养基组成为：山梨糖10g/L，葡萄糖5g/L，酵母膏3g/L，玉米浆10g/L，尿素0.2g/L，pH7.2；

（2）菌种的分离纯化：无菌条件下，用无菌生理盐水将（1）中活化的菌种液进行梯度稀释，取10^-7稀释液0.1ml涂布在分离用平板上，平板27℃培养5天；平板培养基组成为：山梨糖5g/L，胰蛋白胨5g/L，尿素0.05g/L，玉米浆2g/L，牛肉膏2g/L，酵母膏2g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.3g/L，琼脂粉17g/L，pH7.2；

（3）茄瓶的制备：用接种环将（2）中15个平板上培养所得的全部小菌菌落挑取到0.2ml无菌生理盐水中，作为小菌菌悬液；然后从（2）中平板上选择色白、饱满且边缘整齐的大菌菌落，用接种环在大菌菌落内环和外环之间挑取针尖大小大菌接到小菌菌悬液中，搅拌混匀作为混菌悬液；取混菌悬液0.1ml接种到空白茄瓶培养基中，涂布均匀，27℃培养5天；茄瓶培养基组成为：山梨糖8g/L，酵母膏6g/L，硫酸镁1g/L，琼脂粉17g/L，pH7.2；

（4）种子液的制备：吸取少量种子培养基将（3）中茄瓶菌体全部洗下，接种到三角摇瓶中，一个茄瓶接两个三角摇瓶（750ml），装液量20%，220rpm，27℃培养18h；种子培养基组成为：山梨糖10g/L，葡萄糖4g/L，玉米浆5g/L，尿素0.2g/L，pH6.7；

（5）100L发酵罐扩培种液的制备：装液量70%，按10%接种量将步骤（4）中摇瓶种子液接种到扩大培养基中，250rpm，富氧空气通气比为0.6L/L·min，富氧空气中氧气体积分数为50%，发酵过程中溶解氧浓度维持在68.4-100%，27℃培养15h；所述扩大培养基组成和步骤（4）中摇瓶种液培养基组成相同；

（6）1m³发酵罐培养：装液量70%，按10%接种量将步骤（5）中扩大培养种子液接种到发酵培养基中，在100rpm，富氧空气通气比为0.6L/L·min，富氧空气中氧气体积分数为50%，27℃下培养，发酵过程中溶解氧浓度维持在65.1-100%，L-山梨糖下降到8-12g/L以下时，开始流加山梨糖，控制山梨糖浓度10-15g/L左右，发酵过程中流加碳酸钠溶液控制pH为6.7；发酵18h结束，液相检测发酵液中2-酮基-L-古龙酸产量为140.3g/L，山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率98.1%；发酵罐培养基组成为：山梨糖30g/L，玉米浆8g/L，尿素0.10g/L，初始pH6.8。

实施例2

利用富氧空气发酵制备2-酮基-L-古龙酸，所用菌种与实施例1相同，包括以下步骤：

（1）菌种的活化：用活化培养基将长有大、小菌的茄瓶上菌体全部洗下，接种到活化培养基中，装液量20%，220rpm，29℃培养24h；活化培养基组成为：山梨糖5g/L，葡萄糖3g/L，酵母膏5g/L，玉米浆5g/L，尿素0.1g/L，pH6.7；

（2）菌种的分离纯化：无菌条件下，用无菌生理盐水将（1）中活化的菌种液进行梯度稀释，取10^-5稀释液0.1ml涂布在分离用平板上，平板29℃培养6天；平板培养基组成为：山梨糖15g/L，胰蛋白胨3g/L，尿素0.1g/L，玉米浆4g/L，牛肉膏1.2g/L，酵母膏1.2g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，琼脂粉17g/L，pH6.7；

（3）茄瓶的制备：用接种环将（2）中10个平板上培养所得的全部小菌菌落挑取到0.2ml无菌生理盐水中，作为小菌菌悬液；然后从（2）中平板上选择色白、饱满且边缘整齐的大菌菌落，用接种环在大菌菌落内环和外环之间挑取针尖大小大菌接到小菌菌悬液中，搅拌混匀作为混菌悬液；取混菌悬液0.05ml接种到空白茄瓶培养基中，涂布均匀，29℃培养3天；茄瓶培养基组成为：山梨糖5g/L，酵母膏3g/L，硫酸镁2g/L，琼脂粉17g/L，pH6.7；

（4）种子液的制备：吸取少量种子培养基将（3）中茄瓶菌体全部洗下，接种到三角摇瓶中，一个茄瓶接两个三角摇瓶（750ml），装液量20%，220rpm，29℃培养23h；种子培养基组成为：山梨糖20g/L，葡萄糖1g/L，玉米浆8g/L，尿素0.05g/L，pH7.2；

（5）100L发酵罐扩培种液的制备：装液量70%，按10%接种量将步骤（4）中摇瓶种子液接种到扩大培养基中，150rpm，富氧空气通气比为0.4L/L·min，富氧空气中氧气体积分数为75%，发酵过程中溶解氧浓度维持在75.3-100%，29℃培养10h；所述扩大培养基组成和步骤（4）中摇瓶种液培养基组成相同；

（6）1m³发酵罐培养：装液量70%，按10%接种量将步骤（5）中扩大培养种子液接种到发酵培养基中，在150rpm，富氧空气通气比为0.4L/L·min，富氧空气中氧气体积分数为75%，发酵过程中溶解氧浓度维持在71.3-100%，29℃下培养，L-山梨糖下降到5-10g/L以下时，开始流加山梨糖，控制山梨糖浓度10-15g/L左右，发酵过程中流加碳酸钠溶液控制pH为6.9；发酵18h结束，液相检测发酵液中2-酮基-L-古龙酸产量为142.8g/L，山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率98.5%；发酵培养基组成为：山梨糖20g/L，玉米浆12g/L，尿素0.2g/L，初始pH7.0。

实施例3

利用氧气发酵制备2-酮基-L-古龙酸，所用菌种与实施例1相同，包括以下步骤：

（1）菌种的活化：用活化培养基将长有大、小菌的茄瓶上菌体全部洗下，接种到活化培养基中，装液量20%，220rpm，32℃培养22h；活化培养基组成为：山梨糖15g/L，葡萄糖2g/L，酵母膏8g/L，玉米浆3g/L，尿素0.05g/L，pH7.0；

（2）菌种的分离纯化：无菌条件下，用无菌生理盐水将（1）中活化的菌种液进行梯度稀释，取10^-6稀释液0.1ml涂布在分离用平板上，平板32℃培养4天；平板培养基组成为：山梨糖10g/L，胰蛋白胨1g/L，尿素0.2g/L，玉米浆6g/L，牛肉膏0.6g/L，酵母膏0.5g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，硫酸镁0.1g/L，琼脂粉17g/L，pH6.9；

（3）茄瓶的制备：用接种环将（2）中20个平板上培养所得的全部小菌菌落挑取到0.2ml无菌生理盐水中，作为小菌菌悬液；然后从（2）中平板上选择色白、饱满且边缘整齐的大菌菌落，用接种环在大菌菌落内环和外环之间挑取针尖大小大菌接到小菌菌悬液中，搅拌混匀作为混菌悬液；取混菌悬液0.1ml接种到空白茄瓶培养基中，涂布均匀，32℃培养4天；茄瓶培养基组成为：山梨糖3g/L，酵母膏5g/L，硫酸镁3g/L，琼脂粉17g/L，pH6.9；

（4）种子液的制备：吸取少量种子培养基将（3）中茄瓶菌体全部洗下，接种到三角摇瓶中，一个茄瓶接两个三角摇瓶（750ml），装液量20%，220rpm，32℃培养20h；种子培养基组成为：山梨糖15g/L，葡萄糖2g/L，玉米浆12g/L，尿素0.1g/L，pH6.9；

（5）100L发酵罐扩培种液的制备：装液量70%，按10%接种量将步骤（4）中摇瓶种子液接种到扩大培养基中，80rpm，氧气通气比为0.2L/L·min，发酵过程中溶解氧浓度维持在67.2-100%，32℃培养10h；所述扩大培养基组成和步骤（4）中摇瓶种液培养基组成相同；

（6）1m³发酵罐培养：装液量70%，按10%接种量将步骤（5）中扩大培养种子液接种到发酵培养基中，在80rpm，氧气通气比为0.2L/L·min，32℃下培养，发酵过程中溶解氧浓度维持在62.3-100%，L-山梨糖下降到10-15g/L以下时，开始流加山梨糖，控制山梨糖浓度15-25g/L左右，发酵过程中流加碳酸钠溶液控制pH为7.2；发酵12h结束，液相检测发酵液中2-酮基-L-古龙酸产量为138.7g/L，山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率为97.2%；发酵罐培养基组成为：山梨糖25g/L，玉米浆10g/L，尿素0.15g/L，初始pH7.0。

实施例4

利用富氧空气发酵制备2-酮基-L-古龙酸，所用菌种和培养基与实施例1相同，包括以下步骤：

（1）菌种的活化：用活化培养基将长有大、小菌的茄瓶上菌体全部洗下，接种到活化培养基中，装液量20%，220rpm，29℃培养18h；

（2）菌种的分离纯化：无菌条件下，用无菌生理盐水将（1）中活化的菌种液进行梯度稀释，取10^-6稀释液0.1ml涂布在分离用平板上，平板29℃培养4天；

（3）茄瓶的制备：用接种环将（2）中25个平板上培养所得的全部小菌菌落挑取到0.2ml无菌生理盐水中，作为小菌菌悬液；然后从（2）中平板上选择色白、饱满且边缘整齐的大菌菌落，用接种环在大菌菌落内环和外环之间挑取针尖大小大菌接到小菌菌悬液中，搅拌混匀作为混菌悬液；取混菌悬液0.1ml接种到空白茄瓶培养基中，涂布均匀，29℃培养5天；

（4）种子液的制备：吸取少量种子培养基将（3）中茄瓶菌体全部洗下，接种到三角摇瓶中，一个茄瓶接两个三角摇瓶（750ml），装液量20%，220rpm，29℃培养18h；

（5）100L发酵罐扩培种液的制备：装液量70%，按10%接种量将步骤（4）中摇瓶种子液接种到扩大培养基中，200rpm，富氧空气通气比为1.5L/L·min，富氧空气中氧气体积分数为30%，发酵过程中溶解氧浓度维持在55.3-100%，29℃培养12h；所述扩大培养基组成和步骤（4）中摇瓶种液培养基组成相同；

（6）1m³发酵罐培养：装液量70%，按10%接种量将步骤（5）中扩大培养种子液接种到发酵培养基中，在250rpm，富氧空气通气比为1.5L/L·min，富氧空气中氧气体积分数为30%，29℃下培养，发酵过程中溶解氧浓度维持在55.0-100%，L-山梨糖下降到8-12g/L以下时，开始流加山梨糖，控制山梨糖浓度10-15g/L左右，发酵过程中流加碳酸钠溶液控制pH为6.9；发酵20h结束，液相检测发酵液中2-酮基-L-古龙酸产量为134.1g/L，山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率96.2%。

实施例5

利用富氧空气发酵制备2-酮基-L-古龙酸，所用菌种为氧化葡糖酸杆菌ATCC10493和巨大芽孢杆菌ATCC21916，均购于北京北纳创联生物技术研究院，培养基与实施例2相同，包括以下步骤：

步骤（1）、（2）、（3）、（4）条件同实施例2；

（5）100L发酵罐扩培种液的制备：装液量70%，按10%接种量将步骤（4）中摇瓶种子液接种到扩大培养基中，250rpm，富氧空气通气比为0.4L/L·min，富氧空气中氧气体积分数为75%，29℃培养10h，发酵过程中溶解氧浓度维持在77.3-100%；所述扩大培养基组成和步骤（4）中摇瓶种液培养基组成相同；

（6）1m³发酵罐培养：装液量70%，按10%接种量将步骤（5）中扩大培养种子液接种到发酵培养基中，在100rpm，富氧空气通气比为0.4L/L·min，富氧空气中氧气体积分数为75%，29℃下培养，发酵过程中溶解氧浓度维持在74.1-100%，L-山梨糖下降到8-12g/L以下时，开始流加山梨糖，控制山梨糖浓度10-15g/L左右，发酵过程中流加碳酸钠溶液控制pH为6.9；发酵18h结束，液相检测发酵液中2-酮基-L-古龙酸产量为127.7g/L，山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率95.3%。

实施例6

利用富氧空气发酵制备2-酮基-L-古龙酸，所用菌种为氧化葡糖酸杆菌TL-347，保藏于山东天力药业有限公司研发中心，巨大芽孢杆菌ATCC21916，购于北京北纳创联生物技术研究院，培养基与实施例2相同，包括以下步骤：

步骤（1）、（2）、（3）、（4）条件同实施例2；

（5）100L发酵罐扩培种液的制备：装液量70%，按10%接种量将步骤（4）中摇瓶种子液接种到扩大培养基中，250rpm，富氧空气通气比为0.4L/L·min，富氧空气中氧气体积分数为75%，29℃培养10h，发酵过程中溶解氧浓度维持在79.1-100%；所述扩大培养基组成和步骤（4）中摇瓶种液培养基组成相同；

（6）1m³发酵罐培养：装液量70%，按10%接种量将步骤（5）中扩大培养种子液接种到发酵培养基中，在100rpm，富氧空气通气比为0.4L/L·min，富氧空气中氧气体积分数为75%，29℃下培养，发酵过程中溶解氧浓度维持在74.1-100%，L-山梨糖下降到8-12g/L以下时，开始流加山梨糖，控制山梨糖浓度10-15g/L左右，发酵过程中流加碳酸钠溶液控制pH为6.9；发酵18h结束，液相检测发酵液中2-酮基-L-古龙酸产量为125.4g/L，山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率94.2%。

对照实施例1

利用普通空气发酵制备2-酮基-L-古龙酸，所用菌种和培养基与实施例2相同，包括以下步骤：

步骤（1）、（2）、（3）、（4）条件同实施例2；

（5）100L发酵罐扩培种液的制备：装液量70%，按10%接种量将步骤（4）中摇瓶种子液接种到扩大培养基中，150rpm，普通空气通气比为0.4L/L·min，普通空气中氧气体积分数为21%，发酵过程中溶解氧浓度维持在18.1-100%，29℃培养10h；所述扩大培养基组成和步骤（4）中摇瓶种液培养基组成相同；

（6）1m³发酵罐培养：装液量70%，按10%接种量将步骤（5）中扩大培养种子液接种到发酵培养基中，在150rpm，普通空气通气比为0.4L/L·min，普通空气中氧气体积分数为21%，29℃下培养，发酵过程中溶解氧浓度维持在10.3-100%，L-山梨糖下降到5-10g/L以下时，流加山梨糖控制山梨糖浓度10-15g/L左右，发酵过程中流加碳酸钠溶液控制pH始终为6.9；发酵18h结束，液相检测发酵液中2-酮基-L-古龙酸产量为70.6g/L，山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率90.2%。

对照实施例2

利用普通空气发酵制备2-酮基-L-古龙酸，所用菌种和培养基与实施例5相同，包括以下步骤：

步骤（1）、（2）、（3）、（4）条件同实施例5；

（5）100L发酵罐扩培种液的制备：装液量70%，按10%接种量将步骤（4）中摇瓶种子液接种到扩大培养基中，250rpm，普通空气通气比为0.4L/L·min，发酵过程中溶解氧浓度维持在21.6-100%,29℃培养10h；所述扩大培养基组成和步骤（4）中摇瓶种液培养基组成相同；

（6）1m³发酵罐培养：装液量70%，按10%接种量将步骤（5）中扩大培养种子液接种到发酵培养基中，在100rpm，普通空气通气比为0.4L/L·min，29℃下培养，发酵过程中溶解氧浓度维持在17.3-100%，L-山梨糖下降到8-12g/L以下时，开始流加山梨糖，控制山梨糖浓度10-15g/L左右，发酵过程中流加碳酸钠溶液控制pH为6.9；发酵18h结束，液相检测发酵液中2-酮基-L-古龙酸产量为59.7g/L，山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率87.3%。

从上述实施例可以看出，采用保持高溶氧量的方法可以大大缩减发酵周期，且2-酮基-L-古龙酸的产量和转化率均很高，满足生产要求，大大提高了生产效率，并且在采用本发明优选的氧化葡糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌时，2-酮基-L-古龙酸的产量和转化率更高，更有利于工业化推广应用。

本发明提高2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法可作为发酵法制备维生素C的一个步骤，采用此方法可以提高整个工艺的生产效率，降低维生素C生产成本。

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种提高维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸生产效率的方法，其特征是：以山梨糖为底物，以氧化葡糖酸杆菌和巨大芽孢杆菌为菌种混菌发酵制备2-酮基-L-古龙酸，在整个发酵过程中，维持发酵液中高溶解氧浓度，以促进菌体生长、提高2-酮基-L-古龙酸的转化效率，实现2-酮基-L-古龙酸的高效生产；所用氧化葡糖酸杆菌为氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）TL-1045CGMCCNO.6188；所述高溶解氧浓度指的是整个发酵过程中溶解氧浓度始终维持在55-100%范围内。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：整个发酵过程中溶解氧浓度始终维持在62.3-100%范围内。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：整个发酵过程中溶解氧浓度始终维持在71.3-100%范围内。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征是：采用通入富氧空气或氧气的方式维持发酵液中的高溶解氧浓度，所述富氧空气中氧气的体积分数为30-99%；发酵过程发酵周期为12-20h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：发酵过程中保持氧气或富氧空气的通气比为0.2-1.5L/L·min。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征是：所述富氧空气中氧气的体积分数为45-75%。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所用的巨大芽孢杆菌为巨大芽孢杆菌ATCC14581。

8.根据权利要求1、2、3或7所述的方法，其特征是：混菌发酵时，按照5-20%的接种量将菌种接种到发酵培养基中，在温度27-32℃、转速80-250rpm条件下发酵12-20h，发酵过程中流加碱性物质溶液控制pH6.7-7.3，当发酵液中L-山梨糖下降到5-15g/L时，流加L-山梨糖保持L-山梨糖浓度为10-25g/L；发酵培养基组成为：山梨糖20-30g/L，玉米浆5-12g/L，尿素0.05-0.2g/L，pH6.7-7.3。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征是：混菌发酵前需要制备种子液，以得到接种量所需数量的菌种，种子液制备包括以下步骤：

（1）菌种的活化：将用茄瓶保存的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖酸杆菌用活化培养基洗下，接种在活化培养基中，然后27-32℃下培养18-24h，得活化的菌种液；

（2）菌种的分离纯化：用无菌生理盐水将步骤（1）得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10^-5-10^-7稀释液0.1ml涂布在平板上，然后将平板在27-32℃下培养4-6天；

（3）混菌的培养：用接种环将步骤（2）中10-25个平板上培养得到的全部氧化葡糖酸杆菌菌落挑取到0.2ml无菌生理盐水中，制成氧化葡糖酸杆菌菌悬液；然后从步骤（2）中平板上选择巨大芽孢杆菌菌落，用接种环在巨大芽孢杆菌菌落内环和外环之间挑取针尖大小的巨大芽孢杆菌接到氧化葡糖酸杆菌菌悬液中，搅拌混匀制得混菌悬液；取混菌悬液0.05-0.1ml接种到茄瓶中，涂布均匀，27-32℃培养3-5天；

（4）种子液的制备：将步骤（3）中茄瓶培养得到的混菌用种子培养基洗下，接种到盛有种子培养基的摇瓶中，在27-32℃、80-250rpm的条件下培养18-24h，得种子液，每个茄瓶接种两个摇瓶；

（5）种子液的扩大培养：将步骤（4）得到的种子液按5-20%的接种量接种到扩大培养基中，在80-250rpm、富氧空气或氧气通气比0.2-1.5L/L·min、27-32℃条件下培养10-15h，所述富氧空气的氧气体积分数为30-99%；

种子液制备过程中，所用培养基组成如下：

步骤（1）中活化培养基的组成为：山梨糖5-15g/L，葡萄糖2-5g/L，酵母膏3-8g/L，玉米浆3-10g/L，尿素0.05-0.2g/L，pH6.7-7.2；

步骤（2）中平板培养基组成为：山梨糖5-20g/L，胰蛋白胨1-5g/L，尿素0.05-0.2g/L，玉米浆2-6g/L，牛肉膏0.5-2g/L，酵母膏0.5-2.0g/L，磷酸二氢钾0.5-1.5g/L，硫酸镁0.1-0.3g/L，琼脂粉17g/L，pH6.7-7.2；

步骤（3）中茄瓶培养基组成为：山梨糖3-8g/L，酵母膏2-6g/L，硫酸镁1-3g/L，琼脂粉17g/L，pH6.7-7.2；

步骤（4）中种子培养基的组成为：山梨糖8-20g/L，葡萄糖1-5g/L，玉米浆5-12g/L，尿素0.05-0.2g/L，pH6.7-7.2；

步骤（5）中扩大培养基组成为：山梨糖8-20g/L，葡萄糖1-5g/L，玉米浆5-12g/L，尿素0.05-0.2g/L，pH6.7-7.2。