CN112625955B - 一种氧化葡糖杆菌及其在生产古龙酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氧化葡糖杆菌及其在生产古龙酸中的应用，属于生物技术领域。本发明采用ARTP诱变，最终筛选得到一株温度敏感型的氧化葡糖杆菌(G.oxydans)Nhu1209‑1。该菌株的酶活与原始菌株相比，提高了10～15％，发酵周期缩短了8～10h。此外，该菌株在山梨糖发酵结束后，可以在较低温度(45℃)和较短时间(20min)下实现彻底灭菌，不仅降低了能耗，同时也减少了对营养物质的破坏，有助于提高产酸量。
Description
技术领域
本发明涉及一种氧化葡糖杆菌及其在生产古龙酸中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
维生素C(Vitamin C，简称VC)，即L-抗坏血酸(L-Ascorbic acid)，是人体必须从外界摄入的一种水溶性维生素，在医药、食品、化妆品、饲料等领域应用广泛。2-酮基-L-古龙酸 (2-keto-L-gulonic acid，简称2-KGA)是合成维生素C的重要前体，目前“二步发酵法”依然是工业化生产VC的主要工艺。二步发酵法第一步是用氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans) 将D-山梨醇转化为L-山梨糖，然后用芽孢杆菌和普通生酮古龙酸菌混菌发酵，将山梨糖氧化为2-酮基-L-古龙酸，所获得的2-酮基-L-古龙酸通过酯化反应等步骤合成维生素C。在此工艺中，第一步发酵制得的含有山梨糖的发酵液，需要在60～80℃下灭菌30分钟以上，然后将灭菌后的发酵液作为二步发酵的培养基使用。这一过程能耗大，耗时长，对山梨糖的营养成分也有所破坏。
目前，也有为了降低能耗而不对发酵得到的含有山梨糖的发酵液灭菌，直接作为培养基使用，但第一步发酵中的氧化葡糖杆菌会随着含有山梨糖的发酵液进入第二步的发酵过程，并在第二步的发酵过程中消耗培养基中的营养物质，使得底物转化率显著降低，仅有 60％～80％，且转化率不稳定，与现有技术中灭菌的二步发酵法90％以上的转化率相比，存在一定的差距。
发明内容
为解决上述含有山梨糖的发酵液灭菌过程中存在的能耗大，耗时长，对发酵液的营养成分有所破坏等问题，本发明筛选获得了温度敏感型氧化葡糖杆菌菌株，适用于山梨糖低温灭菌过程。本发明的温度敏感型氧化葡糖杆菌菌株，能够在较低温度下实现彻底灭活，带来了以下优势：1.降低了低温灭菌过程中的能耗；2.降低了还原糖与有机氮高温条件下的复杂的副反应，从而降低了山梨糖发酵液中营养成分的破坏。
本发明的第一个目的是提供一株氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)Nhu1209-1，已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.21196。
在本发明的一种实施方式中，所述菌株氧化葡糖杆菌Nhu1209-1的诱变筛选方法是：将出发菌株氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC No.17448，经ARTP诱变后，通过平板影印法最终筛选得到温度敏感型的目标菌株氧化葡糖杆菌Nhu1209-1。其具体步骤为：
(1)出发菌株活化：将保藏于甘油管中的氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans)CGMCC No.17448于固体培养基上划线，在25～37℃下培养10～20h，挑取单菌落于新鲜液体培养基，25～37℃培养8～24h后，按20～60mL/100mL接种量转接新鲜液体培养基，进行同步培养；
(2)ARTP诱变处理：将步骤(1)得到的菌液用新鲜的液体培养基稀释至OD600为0.6～0.8 后，取5～15μL均匀涂于无菌载片上，在ARTP育种系统作用下开始诱变处理；
ARTP育种系统，所用气源为氦气，气体流量设定为15～45SLM(StandardLiterperMinute，公升/分钟)，功率为30～50W，处理时间为15-35s，照射距离为1～3mm。
(3)突变株的后培养：将诱变后的菌液均匀涂布于含有新鲜固体培养基的平板A上，30℃培养4～16h；
(4)温度敏感型突变株筛选：通过平板影印法将菌落复制于平板B，并将其放置于45℃培养，同时将平板A放置于30℃培养。24h后，将平板A与平板B相比，挑选出在平板A生长而在平板B不生长的菌落，转接至平板C上，至于45℃培养24h。不能生长的，则认为是温度敏感型突变株。
(5)温度敏感型突变株的效果验证：将温度敏感型突变株接种至液体培养基中，在30℃培养16h，然后将培养温度提高至45℃，发现在10～30min后就无法检测到活菌存在。
本发明的第二个目的是提供一种生产山梨糖的方法，用所述氧化葡糖杆菌生产山梨糖。
在本发明的一种实施方式中，将氧化葡糖杆菌在种子培养基中培养20-30h后以5-15 mL/100mL的量加入发酵培养基中。
所述的种子培养基：按g/L计，含有：D-山梨醇250-320g，酵母膏0.2-0.5g，液体玉米浆1-4g，轻质碳酸钙0.1-0.7g，调节pH为6.0-6.5。
所述的发酵培养基：按g/L计，含有：D-山梨醇250-320g，酵母膏0.2-0.5g，液体玉米浆1-4g，轻质碳酸钙0.1-0.7g，调节pH为6.0-6.5。
在本发明的一种实施方式中，在35-37℃、600-750rpm下发酵。
本发明的第三个目的是提供一种生产古龙酸的方法，以所述生产山梨糖的方法制备得到的含有山梨糖的发酵液为碳源。
在本发明的一种实施方式中，将所述含有山梨糖的发酵液在45℃灭菌20min，将灭菌后的发酵液加入发酵体系中。
在本发明的一种实施方式中，利用普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌转化山梨糖生成古龙酸。
在本发明的一种实施方式中，将所述普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌等比例混合，在180～200rpm下培养得到OD600为6.0-10的混合菌液，将混合菌液以5-15mL/100mL 的量接种至发酵体系进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，控制通气比为(1-3):(1-3)，搅拌转速400-550rpm，温度 30-35℃，当残糖浓度降低至1g/L以下时终止发酵。
在本发明的一种实施方式中，发酵体系每升含有：L-山梨糖80～120g，玉米浆4.0～ 6.0g，尿素11.0～13.0g，磷酸二氢钾0.5～1.5g，无水硫酸镁0.1～0.2g，碳酸钙4.0～6.0g， pH6.0～8.0。
本发明的有益效果：
本发明采用ARTP诱变，最终筛选得到一株温度敏感型的氧化葡糖杆菌(G.oxydans) Nhu1209-1。该菌株的酶活与原始菌株相比，提高了10～15％，发酵周期缩短了8～10h。此外，该菌株在山梨糖发酵结束后，可以在较低温度(45℃)和较短时间(20min)下实现彻底灭菌，不仅降低了能耗，同时也减少了对营养物质的破坏，有助于提高产酸量。
生物材料保藏
本发明所提供的氧化葡糖杆菌Nhu1209-1，分类命名为氧化葡糖杆菌Gluconobacteroxydans，已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21196，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所提供的普通生酮古龙酸菌，分类命名为普通生酮古龙酸菌Ketogulonicigenium vulgare，已于2019年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17446，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所提供的巨大芽孢杆菌，分类命名为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium，已于2019 年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17447，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明所提供的出发菌株氧化葡萄糖酸杆菌，分类命名为氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacteroxydans，已于2019年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17448，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
(一)培养基
诱变筛选和一步发酵过程中所用的固体培养基：按g/L计，含有：山梨醇120-160g，酵母膏3-8g，轻质碳酸钙5-12g，琼脂15～20g，pH自然。
诱变筛选和一步发酵过程中所用的液体培养基：按g/L计，含有：山梨醇120-160g，酵母膏3-8g，轻质碳酸钙5-12g，pH自然。
一步发酵过程中所用的种子培养基：按g/L计，含有：D-山梨醇250-320g，酵母膏0.2-0.5g，液体玉米浆1-4g，轻质碳酸钙0.1-0.7g，调节pH为6.0-6.5。
一步发酵过程中所用的发酵培养基：按g/L计，含有：D-山梨醇250-320g，酵母膏0.2-0.5g，液体玉米浆1-4g，轻质碳酸钙0.1-0.7g，调节pH为6.0-6.5。
二步发酵过程中所用的固体培养基：按g/L计，含有：L-山梨糖60～80g，玉米浆4.0～6.0g，尿素11.0～13.0g，磷酸二氢钾0.5～1.5g，无水硫酸镁0.1～0.2g，碳酸钙4.0～6.0g，琼脂15～ 20g，pH6.0～8.0。
二步发酵过程中所用的种子培养基：按g/L计，含有：L-山梨糖80～120g，玉米浆4.0～6.0g，尿素11.0～13.0g，磷酸二氢钾0.5～1.5g，无水硫酸镁0.1～0.2g，碳酸钙4.0～6.0g，pH6.0～8.0。
二步发酵过程中所用的发酵培养基：按g/L计，含有：L-山梨糖80～120g，玉米浆4.0～6.0g，尿素11.0～13.0g，磷酸二氢钾0.5～1.5g，无水硫酸镁0.1～0.2g，碳酸钙4.0～6.0g，pH6.0～8.0。
(二)酶活力测定
酶活力单位(U)定义为在20g/L山梨醇浓度下，30℃，pH 6.0的磷酸缓冲液体系中，每分钟催化D-山梨醇生成1.0μmoL L-山梨糖的所需要的酶量。D-山梨醇及L-山梨糖浓度通过高效液相色谱(HPLC)测定。
山梨醇脱氢酶酶活检测操作流程：取发酵液20mL离心10000rpm，10min，弃上清，洗涤一遍，离心弃上清，配制缓冲液100mM PBS，再将20g/L山梨醇和5g/L七水硫酸镁溶于缓冲液，重新调pH至6.0，建立10mL的反应体系，28℃反应30min，取样1mL离心进行液相检测分析山梨醇的转化率及山梨糖产物得率；液相检测条件为：流动相为5mM H2SO4溶液；流速0.6mL/min；进样量20μL；柱温60℃，时间12min。
(三)山梨糖浓度的测定方法
液相检测：使用色谱柱(糖柱)，型号：Carbomix Ca-NP5:8％7.8x300mm，5um Non-Porous；流动相100％纯水；柱温：80℃；进样量20μL；流速：0.5mL/min；
甘油酮法：甘油酮可与还原性糖(包括山梨糖)反应形成甘油和山梨糖酸及氧化铜红色沉淀。次甲基蓝(水溶液呈蓝色)具有氧化性，可氧化一些还原性较强的物质，如山梨糖，而自身被还原成无色的还原态亚甲蓝。当甘油酮被山梨糖完全反应后，次甲基蓝被山梨糖还原为无色，因此滴定终点为含有砖红色氧化铜的颜色。
空白滴定：
移液管移取20mL甘油酮至250mL的锥形瓶中，用量筒量取20mL的蒸馏水，预加13mL的标准山梨糖(此时不可以加热)，加入4-7颗玻璃珠，将锥形瓶置于电炉上至微沸(预热时间控制在1分钟以内)。待样品微沸，加入指示剂3-5滴，并立刻滴加标准山梨糖(每秒一滴)，通过调节滴定速度滴定至由蓝色变成砖红色，则滴定完成。记录滴定所消耗的标准滴定液的体积V1(滴定时间控制在1min以内)。
样品滴定：
移液管移取20mL甘油酮至250mL的锥形瓶中，用移液管移取20mL的蒸馏水，加入待测样品0.5mL。预加2mL的标准山梨糖(山梨糖含量在100mg/mL左右时加入样品0.5mL，预加山梨糖标准液7mL，含量在200mg/mL左右时加入待测样品0.25mL，预加山梨糖标准液5mL)，
加入4-7颗玻璃珠，将锥形瓶置于电炉上加热至微沸(预热时间控制在1分钟以内)。待样品微沸，加入指示剂3-5滴，并立刻慢慢滴加标准山梨糖(每秒半滴)，通过调节滴定速度滴定至由蓝色变成砖红色，则滴定完成。记录滴定所消耗的标准滴定液的体积V2。(滴定时间控制在1min以内)。
山梨糖(mg/ml)＝(V1-V2)×C÷V3
V1——空白滴定时消耗标准山梨糖滴定液的体积；
V2——加入样品后消耗标准糖的体积；
C——为标准山梨糖溶液的浓度(mg/ml)；
V3——表示吸取样品的体积；
实施例1：菌株的诱变和筛选
(1)出发菌株活化：将保藏于甘油管中的氧化葡萄糖酸杆菌(G.oxydans)CGMCCNo.17448(我司于2019年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)于固体培养基上划线，在30℃下培养24h，挑取单菌落于新鲜液体培养基，30℃、 200rpm培养12h后，按10mL/100mL接种量转接新鲜液体培养基，培养至对数期；
(2)ARTP诱变处理：将步骤(1)得到的菌液用新鲜的液体培养基稀释至OD600为0.6后，取10μL均匀涂于无菌载片上，在ARTP育种系统作用下开始诱变处理；
ARTP育种系统：所用气源为氦气，气体流量设定为30SLM(StandardLiterperMinute，公升/分钟)，功率为40W，处理时间为25s，照射距离为2mm。
(3)突变株的后培养：将诱变后的菌液均匀涂布于含有新鲜固体培养基的平板A上，30℃培养24h；
(4)温度敏感型突变株筛选：通过平板影印法将菌落复制于含有新鲜固体培养基的平板B，并将其放置于45℃培养，同时将平板A放置于30℃培养；24h后，将平板A与平板B相比，挑选出在平板A生长而在平板B不生长的单菌落，分别转接至含有新鲜固体培养基的平板C上，置于45℃培养24h；不能生长的，则认为是温度敏感型突变株；最终筛选得到5株温度敏感型突变株。
(5)温度敏感型突变株的效果验证：将(4)中得到的5株温度敏感型突变株接种至液体培养基中，在30℃培养16h，然后将培养温度提高至45℃，分别培养20min、30min、45min、60min 后均匀涂布于含有新鲜固体培养基的平板上，培养24h后观察其菌落数量。最终得到一株氧化葡糖杆菌(G.oxydans)Nhu1209-1，其在45℃下培养20min后，经微生物检测未检测到有微生物菌落产生，即100％灭活。
实施例2：诱变菌株发酵生产山梨糖
挑取实施例1筛选得到的氧化葡糖杆菌(G.oxydans)Nhu1209-1和原始菌株氧化葡糖杆菌(G.oxydans)CGMCC No.17448，分别于种子培养基上活化培养24h，以10mL/100mL的接种量，将上述活化培养好的种子液分别接种到发酵培养基中，在37℃，750rpm条件下进行发酵培养，发酵过程实时监测发酵过程中的溶氧和pH，待发酵溶氧开始回升继续培养2.5h，结束发酵，对发酵液L-山梨糖含量、山梨醇脱氢酶酶活进行检测，氧化葡糖杆菌共有三种山梨醇脱氢酶，分别为SldBA1、SldBA2和SldSLC。其中，SldBA1和SldBA2同源性很高，以吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)为辅酶，包括大小两个亚基(SldA和SldB)。 SldSLC以FAD为辅酶，包括三个亚基，分别为大亚基SldL、小亚基SldS和细胞色素C亚基SldC。据相关报道，SldBA1和SldBA2可以催化D-山梨醇生成L-山梨糖，而SldSLC 可以催化D-山梨醇生成D-果糖，结果如表1所示，与原始菌株相比，氧化葡糖杆菌 (G.oxydans)Nhu1209-1转化率提高至97.08％，生产强度提高了14.7％，果糖副产物下降了45.6％。
表1菌株生产山梨糖发酵结果
实施例3：山梨糖发酵液的低温灭菌及灭菌效果验证
各取实施例2中发酵得到的山梨糖发酵液10mL，分别置于37℃、45℃下保温20min。然后各取1mL保温处理后的一步山梨糖发酵液于盛装9mL无菌生理盐水的试管中，梯度稀释至10-7，然后取200μL稀释液均匀涂布至固体培养基中，分别置于30℃中培养48h，每组 10个平行样。培养结束后对平板进行菌落计数，其致死率结果如表2所示，温度提高至45℃以上，其致死率为100％，对该菌株的灭活具有良好效果。
表2山梨糖发酵液中菌株在不同温度下的灭活情况
实施例4：山梨糖发酵液在古龙酸发酵中的应用
(1)混合种液的制备
将普通生酮古龙酸菌CGMCC No.17446和巨大芽孢杆菌CGMCC No.17447分别接种在固体培养基上，28℃下培养30h。然后，将固体培养基上的小菌和伴生菌分别制成菌悬液，各取1mL混合接入种子培养基，三角瓶装液量25mL/250mL，28℃、摇床转速180～200rpm 下培养18h即得所述的混合种液。
(2)古龙酸发酵
将实施例2中制备得到的山梨糖醇发酵液取2份相同的量，分别在80℃下灭菌处理30 分钟，在45℃灭菌处理20分钟。将在80℃和45℃处理后的山梨糖发酵液分别作为二步发酵培养基中的碳源，配置初始山梨糖浓度为120g/L的二步发酵培养基。在10L搅拌发酵罐(装液量为7.5L)中，将普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌混合种液(混菌OD600为6.5)，按10mL/100mL接种量接种至发酵培养基中，控制通气比为1:1，搅拌转速500rpm，温度32℃，当残糖浓度降低至1g/L以下时终止发酵，发酵后测定古龙酸浓度与其摩尔转化率，结果如表3所示，以45℃处理后的山梨糖发酵液的发酵周期缩短12.5％，古龙酸浓度略有提高，生产强度可达到3.45g/(L*h)，摩尔转化率能达到93.5％，而37℃处理(未灭菌)的一步发酵糖液用于二步发酵时，虽然周期与45℃灭菌处理相近，但摩尔转化率明显降低，仅为81.4％。综上所述，45℃低温灭菌处理的一步发酵液对二步发酵具有明显促进作用。
表3古龙酸的发酵结果
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)，已于2020年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21196。
2.一种生产L-山梨糖的方法，其特征在于，利用权利要求1所述氧化葡糖杆菌，以D-山梨醇为原料发酵生产L-山梨糖，发酵温度为35-37℃。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将氧化葡糖杆菌在培养体系中培养20-30h后以5-15 mL/100mL的量加入发酵体系中。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，转速为600-750 rpm。
5.一种生产2-酮基-L-古龙酸的方法，其特征在于，包含权利要求 2-4任一项所述方法，然后以权利要求2-4任一所述方法制备得到的包含权利要求1所述的氧化葡糖杆菌的山梨糖发酵液为碳源；将所述山梨糖发酵液在45℃处理不低于20min，将处理后的发酵液加入发酵体系中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，利用普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌转化山梨糖生成古龙酸。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，普通生酮古龙酸菌和巨大芽孢杆菌等比例进行发酵。
8.权利要求1所述氧化葡糖杆菌在以D-山梨醇为原料制备山梨糖、古龙酸和/或维生素C中的应用。
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