CN113249261B - 一种枯草芽孢杆菌及其在生产核黄素中的应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌及其在生产核黄素中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113249261B
CN113249261B CN202110579808.XA CN202110579808A CN113249261B CN 113249261 B CN113249261 B CN 113249261B CN 202110579808 A CN202110579808 A CN 202110579808A CN 113249261 B CN113249261 B CN 113249261B
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus subtilis
fermentation
riboflavin
seed
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110579808.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN113249261A (zh
Inventor
何琦阳
王巧河
马然静
陈召峰
李伟锋
朱永强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Heilongjiang Xinhecheng Biotechnology Co ltd
Zhejiang NHU Co Ltd
Original Assignee
Heilongjiang Xinhecheng Biotechnology Co ltd
Zhejiang NHU Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Heilongjiang Xinhecheng Biotechnology Co ltd, Zhejiang NHU Co Ltd filed Critical Heilongjiang Xinhecheng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110579808.XA priority Critical patent/CN113249261B/zh
Publication of CN113249261A publication Critical patent/CN113249261A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113249261B publication Critical patent/CN113249261B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P25/00—Preparation of compounds containing alloxazine or isoalloxazine nucleus, e.g. riboflavin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其在生产核黄素中的应用，属于生物技术领域。本发明通过诱变筛选到了一株枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌在较低的溶氧条件(5％～15％)下发酵后，发酵液中维生素B2产量提高了25.6％。与对照菌株相比，本发明所述枯草芽孢杆菌对溶氧的需求显著降低，副产物含量下降，维生素B2产生量显著提高，提高了生产效率和转化率，适于工业化生产。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在生产核黄素中的应用
技术领域
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌及其在生产核黄素中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
维生素B2又名核黄素，为体内黄酶类辅基的组成部分(黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用)，当缺乏时，就影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍。主要用于防治核黄素缺乏症，如口角炎、唇炎、舌炎和眼结膜炎等。近年来，也有研究表明，核黄素还具有利尿、降血脂和改善心脏功能等作用。
核黄素的合成主要有化学合成法和微生物发酵法，由于化学合成法较为复杂而且生产成本较高，目前核黄素主要采用微生物发酵法进行生产，比如枯草芽孢杆菌。但是目前的发酵法存在以下问题：(1)发酵过程对溶氧要求高，搅拌和空压机的能耗高；(2)菌株的糖转化率不高，发酵后期易生成乙酸等副产物，影响核黄素产量。
专利CN110699413A公开了一种利用氧载体提高核黄素产量的方法，通过添加一定量的正十二烷或正己烷作为氧载体，从而增加培养基溶氧能力。但这一方法会增加额外的生产成本和后处理环节，在实际生产过程中难以应用。
发明内容
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已于2021年03月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.21870。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌是由诱变筛选得到的：将出发菌株枯草芽孢杆菌CGMCC NO.21228(2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)，经ARTP诱变后，通过底物类似物和贫氧环境的复合筛选方法，最终筛选得到一株对溶氧要求低、糖转化率高的枯草芽孢杆菌菌株NHU-HWS591。
在本发明的一种实施方式中，所述的ARTP诱变条件为；所用气源为氦气，气体流量设定为30SLM(StandardLiterperMinute，公升/分钟)，功率为50W，处理时间为20s，照射距离为2mm。
在本发明的一种实施方式中，所述底物类似物为8-氮鸟嘌呤，浓度为50mg/L；
在本发明的一种实施方式中，所述贫氧环境，氧气浓度为5％～10％。
本发明提供了一种生产核黄素的方法，利用所述枯草芽孢杆菌NHU-HWS591发酵生产核黄素。
在本发明的一种实施方式中，将所述枯草芽孢杆菌NHU-HWS591在种子培养基中培养得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
在本发明的一种实施方式中，将所述枯草芽孢杆菌NHU-HWS591的单菌落先接种至新鲜种子培养基培养20～28h；然后将培养后的菌液以1～5mL/100mL的量转接至新鲜种子培养基培养20～28h后得到种子液。
在本发明的一种实施方式中，在种子培养基中的培养温度为35～39℃，转速为180～220rpm。
在本发明的一种实施方式中，所述种子培养基的组分为蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0。
在本发明的一种实施方式中，将种子液以1～5mL/100mL的量接种至发酵培养基中。
在本发明的一种实施方式中，发酵培养的温度为35～42℃。
在本发明的一种实施方式中，发酵过程中控制溶氧量为5％～15％。
在本发明的一种实施方式中，反应时转速为200～900rpm，体系中pH为6～8，发酵时间为48～72h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的组分为葡萄糖10～50g/L，生物氮素5～30g/L，蛋白胨2～10g/L，玉米浆5～40g/L，硫酸镁0.5～5g/L，磷酸盐0.5～5g/L。
本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌NHU-HWS591在制备核黄素，或核黄素衍生物，或含有核黄素的产品中的应用。
本发明的有益效果：本发明所述枯草芽孢杆菌在较低的溶氧条件(5～15％)下发酵后，发酵液中维生素B2产量提高了25.6％。与对照菌株相比，本发明所述枯草芽孢杆菌对溶氧的需求显著降低，副产物含量下降，维生素B2产生量大幅提高，即本发明所述枯草芽孢杆菌提高了维生素B2生产效率，降低了生产成本，适合于维生素B2大规模工业化生产。
生物材料保藏
本发明中所提供的枯草芽孢杆菌(NHU-HWS591)，分类学命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2021年03月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.21870，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明中所使用的出发菌株枯草芽孢杆菌CGMCC NO.21228，分类学命名为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，已于2020年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.21228，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
(1)残糖测定
使用高效液相色谱仪测定残糖，条件为：
色谱柱：Carbomix-Ca-NP5：8(5μm,7.8x 300mm)；
流动相：纯水；
柱温：80℃；
进样量：20μL；
流速：0.5mL/min。
(2)核黄素含量测定
取适量发酵液，用0.05mol/L NaOH将其稀释50倍后，混匀，12000rpm转速下离心5min，取上清液用水稀释适当倍数后以水做空白在444nm下测定吸光度(显示值控制在0.2～0.8之间)。(注：避光操作)按以下公式计算核黄素的含量：FB(mg/L)＝(稀释倍数*吸光度)/0.0321。
(3)种子培养基的组分：蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0。固体培养基/斜面培养基在种子培养基的组分基础上再加20g/L的琼脂。
(4)发酵培养基的组分：葡萄糖50g/L，生物氮素30g/L，蛋白胨6g/L，玉米浆10g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，pH 7.0。
实施例1：菌株的诱变筛选
(1)出发菌株活化：将保藏于甘油管中的枯草芽孢杆菌CGMCC NO.21228于固体培养基上划线，在37℃下培养24h，挑取单菌落于新鲜种子培养基，37℃培养20h后，按10％接种量转接新鲜种子培养基，37℃培养20h；
(2)ARTP诱变处理：用无菌生理盐水洗涤菌体3次后再重悬菌体，适当稀释菌体浓度至106～109个/mL，取15μL均匀涂于无菌载片上，置于处理源下2mm，进行诱变处理；(条件如下：所用气源为氦气，气体流量设定为30SLM(StandardLiterperMinute，公升/分钟)，功率为50W，处理时间为20s，照射距离为2mm。)
(3)突变株的后培养：将诱变后的菌液均匀涂布于含有50mg/L的8-氮鸟嘌呤底物类似物的新鲜固体培养基的平板上，置于三气培养箱(德国Binder)中，调节氧气浓度为5～10％，37℃培养20h；
(4)96孔板初筛：分别挑取平板上的单菌落接种于含有500uL种子培养基的96孔板中(每个孔板上包含6株原始菌株)，37℃、800rpm、80％湿度振荡培养18h后，按10％(v/v)接种量转接含有450uL发酵培养基的96孔板中，37℃、800rpm、80％湿度条件下振荡培养24h后检测核黄素产量。
(5)核黄素产量的检测：发酵液混匀，用0.05mol/L NaOH将其稀释50倍后，混匀，12000rpm转速下离心5min，取上清液用水稀释适当倍数后以水做空白在444nm下测定吸光度(显示值控制在0.1～0.8之间)。将ARTP诱变后，与原始菌株相比核黄素产量提升最高的前10株菌进行摇瓶发酵复筛。
(6)摇瓶发酵复筛：分别挑取新鲜活化的单菌落接种斜面培养基，37℃培养48h。刮取1/3斜面上的菌苔接种含有70mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中(每株菌3个平行)，37℃、200rpm振荡培养41h。
发酵液混匀，用0.05mol/L NaOH将其稀释50倍后，混匀，12000rpm转速下离心5min，取上清液用水稀释适当倍数后以水做空白在444nm下测定吸光度(显示值控制在0.2～0.8之间)，按以下公式计算核黄素的含量：FB(mg/L)＝(稀释倍数*吸光度)/0.0321。发酵结果如下表所示，NHU-HWS591菌株核黄素产量为7.9g/L，较原始菌株产量提高了21.5％。
表1突变菌株的核黄素产量
菌株 核黄素产量(g/L)
原始菌株 6.5
NHU-HWS087 6.6
NHU-HWS112 6.8
NHU-HWS179 6.7
NHU-HWS295 7.0
NHU-HWS345 6.9
NHU-HWS367 6.8
NHU-HWS384 6.6
NHU-HWS426 7.1
NHU-HWS548 7.2
NHU-HWS591 7.9
实施例2：溶氧(DO)条件对NHU-HWS591菌株核黄素合成量的影响
挑取枯草芽孢杆菌NHU-HWS591单菌落接种至种子液培养基中，37℃、200rpm培养24h，以5mL/100mL的量转接至500mL种子液培养基中，转速为200rpm，37℃培养24h，得种子液；然后把上述方法制得的四份种子液分别接种至四个相同含有5L无菌发酵培养基的10L发酵罐中，培养温度为37℃，通过控制转速和通气量控制四个发酵罐的溶氧量分别为1％、5％、15％和25％，发酵48h后取样检测，发酵液核黄素含量分别为30.2g/L，35.3g/L，34.6g/L，31.9g/L。实验结果显示5％DO条件下NHU-HWS591菌株发酵核黄素含量最高，说明NHU-HWS591菌株能够在较低DO条件下合成核黄素。
实施例3：NHU-HWS591菌株与原始菌株在相同溶氧条件(DO)下发酵生产核黄素
采用实施例2的种子扩大培养方法和发酵工艺，用NHU-HWS591菌株和原始菌株分别培养在5％溶氧和原始溶氧(25％)条件下发酵生产核黄素，发酵48h后取样检测，结果发现NHU-HWS591菌株在5％溶氧和原始溶氧(25％)条件下的发酵液核黄素产量分别为35.3g/L和31.9g/L，乙酸含量分别为0.51g/L和0.84g/L，原始菌株分别培养在5％溶氧和原始溶氧(25％)条件下发酵液核黄素产量分别为20.2g/L和28.1g/L，乙酸含量分别为3.37g/L和1.85g/L，从中可以发现NHU-HWS591菌株比原始菌株在5％较低的DO条件下合成核黄素能力更强，而且副产物乙酸少，糖酸转化率高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已于2021年03月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21870。
2.一种生产核黄素的方法，其特征在于，利用权利要求1所述枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素；发酵过程中控制溶氧量为5～15％；用于发酵的培养基的组分为葡萄糖10～50g/L，生物氮素5～30g/L，蛋白胨2～10g/L，玉米浆5～40g/L，硫酸镁0.5～5g/L，磷酸盐0.5～5g/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述枯草芽孢杆菌在种子培养基中培养得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述枯草芽孢杆菌的单菌落接种至种子培养基培养20～28h；然后将培养后的菌液以1～5mL/100mL的量转接至种子培养基培养20～28h后得到种子液。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，在种子培养基中的培养温度为35～39℃，转速为180～220rpm。
6.根据权利要求5所述的方法，将种子液以1～5mL/100mL的量接种至发酵培养基中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵培养的温度为35～42℃。
8.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在制备核黄素，或核黄素衍生物，或含有核黄素的产品中的应用。
CN202110579808.XA 2021-05-26 2021-05-26 一种枯草芽孢杆菌及其在生产核黄素中的应用 Active CN113249261B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110579808.XA CN113249261B (zh) 2021-05-26 2021-05-26 一种枯草芽孢杆菌及其在生产核黄素中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110579808.XA CN113249261B (zh) 2021-05-26 2021-05-26 一种枯草芽孢杆菌及其在生产核黄素中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113249261A CN113249261A (zh) 2021-08-13
CN113249261B true CN113249261B (zh) 2023-03-24

Family

ID=77184685

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110579808.XA Active CN113249261B (zh) 2021-05-26 2021-05-26 一种枯草芽孢杆菌及其在生产核黄素中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113249261B (zh)

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100422305B1 (ko) * 2002-12-05 2004-03-10 씨제이 주식회사 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한리보플라빈의 생산방법
KR100422307B1 (ko) * 2002-12-05 2004-03-10 씨제이 주식회사 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한리보플라빈의 생산방법
KR100542565B1 (ko) * 2003-12-05 2006-01-11 씨제이 주식회사 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈의 생산방법
KR100542563B1 (ko) * 2003-12-05 2006-01-11 씨제이 주식회사 리보플라빈을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 리보플라빈의 생산방법
CN100430471C (zh) * 2006-05-17 2008-11-05 天津大学 产核黄素的工程菌株及其生产核黄素的方法
CN102816823B (zh) * 2012-09-18 2014-10-22 江南大学 利用多阶段转速调控策略提高Bacillus subtilis发酵生产核黄素产量的方法
CN107475344A (zh) * 2016-06-07 2017-12-15 上海希迈医药科技有限公司 一种利用枯草芽孢杆菌发酵生产维生素b2的方法
CN106434819A (zh) * 2016-12-22 2017-02-22 广济药业（孟州）有限公司 一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的产量的方法
CN108277189A (zh) * 2017-01-05 2018-07-13 上海创诺医药集团有限公司 一种生产核黄素的工程菌株及其应用
CN108913747A (zh) * 2018-07-28 2018-11-30 广济药业（孟州）有限公司 一种高密度发酵维生素b2的方法
CN110564804B (zh) * 2019-09-12 2021-05-04 河南巨龙生物工程股份有限公司 一种用于生产核黄素的清液发酵培养基及发酵方法
CN110777184B (zh) * 2019-11-27 2023-03-03 河北圣雪大成制药有限责任公司 一种发酵核黄素的发酵培养基及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113249261A (zh) 2021-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017071529A1 (zh) 基于在线氧消耗速率和电导率协同控制的辅酶q10发酵生产工艺
JP6444419B2 (ja) スポロラクトバチルス・テラエおよびその使用
CN108660082B (zh) 一种海洋曲霉来源氧杂蒽醌类化合物及其制备方法和在制备抗菌剂中的应用
CN109082448B (zh) 一种大肠杆菌及其在发酵生产1,5-戊二胺中的应用
CN112239738B (zh) 一株产琥珀酸的大肠杆菌及其应用
CN101486976B (zh) 一种吸水链霉菌及其应用
CN103451133A (zh) 一种环状芽孢杆菌及其在制备阿魏酸脱羧酶中的应用
CN108410918B (zh) 一种色氨酸发酵培养基及色氨酸发酵方法
CN104277989B (zh) 一株面包酵母及其在发酵生产辅酶i中的应用
CN113249261B (zh) 一种枯草芽孢杆菌及其在生产核黄素中的应用
CN110257449B (zh) 一种发酵生产茴香霉素的方法及培养基
CN113337432B (zh) 一种产吡咯喹啉醌的食甲基菌及其应用
CN103468606B (zh) 一株产酸克雷伯氏菌及其在生产蒜糖醇中的应用
CN113604390B (zh) 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-鸟氨酸中的应用
WO2008092297A1 (fr) Nouveau procédé de préparation d'acide abscissique naturel
CN112746026B (zh) 一株维斯假丝酵母及其应用
DK201970421A1 (en) Method for Fermentative Production of Oxidized Coenzyme Q10 and High-content Oxidized Coenzyme Q10 Prepared therefrom
CN105296379A (zh) 一株假诺卡氏菌及其应用
CN113337433B (zh) 一种产吡咯喹啉醌的假单胞菌及其应用
CN110951794A (zh) 一种提高酿酒酵母工程菌生产葡萄糖二酸的发酵方法
CN116004467B (zh) 一株耐高温的大肠杆菌及其在生产d-乳酸中的应用
CN113215064B (zh) 一株产美沙达唑类化合物的黏细菌及其应用
CN116144516B (zh) 一株产丁二酸的酿酒酵母及其应用
CN112175889B (zh) 一株高产维生素k2的菌株及其应用
CN117603835A (zh) 产6-羟基烟酸的杀鲑气单胞菌hd531及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant