CN110257449B - 一种发酵生产茴香霉素的方法及培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及了一种发酵法生产茴香霉素的方法，所述方法包括：a.菌种斜面培养，制备孢子悬液；b.菌种摇瓶种子培养，制备摇瓶种子液；c.将所述摇瓶种子液接入种子罐培养基中，制备种子罐种子液；d.对所述种子罐种子液进行发酵培养；本发明的生产茴香霉素的方法和在发酵过程中配置的多种培养基，能够有效提高发酵法生产茴香霉素的效价，缩短茴香霉素的发酵周期，有利于茴香霉素的大规模产业化生产。

Description

一种发酵生产茴香霉素的方法及培养基
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，特别涉及种发酵生产茴香霉素的方法及培养基。
背景技术
茴香霉素(Anisomycin)是由浅灰链霉菌(Streptomycesgriseus)等放线菌产生的一种含氮杂环类芳香族抗生素，具有很好的抗真菌、抗原虫和和抗肿瘤作用。目前广泛应用于细胞与分子遗传学领域研究，同时具有作为免疫抑制药物开发的巨大潜力。
茴香霉素化学结构中含有4个手性中心，包括3个手性碳原子和1个手性氮原子，采用化学合成的方法进行茴香霉素生产存在手性催化剂成本昂贵、反应条件苛刻、对映体分离困难、环境污染严重等诸多难题。虽然目前有浅灰链霉菌等多株链霉菌可以产生茴香霉素，但茴香霉素的发酵水平均很低，且发酵液代谢产物复杂、化学结构相近，导致茴香霉素提取精制工艺复杂、收率低、成本高，严重束缚了茴香霉素的生产和应用。目前国内外文献报道的茴香霉素的发酵水平很低，尚无茴香霉素大规模发酵生产的报道与专利。通过菌种改良和发酵工艺优化提高茴香霉素的发酵水平，具有很高的经济应用价值。但是菌种的改良主要通过诱变育种、基因工程育种等方法进行，但育种过程存在随机性大、开发周期长等缺陷，因此需要一种对培养基进行优化和对发酵工艺进行改进的方法来提高茴香霉素发酵水平。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种发酵生产茴香霉素的方法及培养基。
一种发酵法生产茴香霉素的方法，所述方法包括：
a.菌种斜面培养，制备孢子悬液：
将梯度稀释后的所述菌种涂布于含孢子培养基的平板上，挑取所述平板上的单菌落接种于含孢子培养基的斜面上，待孢子成熟丰满后加无菌水制备含菌种孢子的孢子悬液；
b.进行菌种摇瓶种子培养，制备摇瓶种子液：
将所述孢子悬液接入摇瓶种子培养基中；
在温度28～30℃、摇床转速为200～250rpm的条件下培养20～24小时，得摇瓶种子培养液；
c.将所述摇瓶种子液接入种子罐培养基中，制备种子罐种子液：
将所述摇瓶种子液转接至装有无菌种子罐培养基中，在温度为28～30℃、搅拌转速为250～350rpm、通气量为40～80m3/h、罐压为40～60KPa的条件下培养20～24小时，制得种子罐种子液；
d.对所述种子罐种子液进行发酵培养：
将所述种子罐种子液接种至装有无菌发酵培养基的发酵罐中，在温度为28～30℃、搅拌转速为100～200rpm、通气量为150～300m3/h、罐压为40～60KPa、pH为6.0～8.0的条件下发酵培养30～36小时，制得含茴香霉素的发酵液。
进一步地，所述菌种为冻干管保藏的浅灰色链霉菌ATCC11796型菌种。
进一步地，含孢子培养基的所述平板和所述斜面的培养温度均为28～30℃、培养时间均为6～7天。
进一步地，所述种子罐内部的种子培养物质的体积占所述种子罐体积的60％～80％，所述摇瓶种子液按所述种子罐培养基体积的0.75～1.5‰接种量接种至所述种子罐培养基中。
进一步地，所述发酵培养基的体积占所述发酵罐体积的60％～80％，所述种子罐种子液按所述发酵培养基体积的5～10％接种量接种于所述发酵罐中。
进一步地，步骤d中所述发酵培养还包括通过补加生理碱性物质控制所述发酵罐内发酵液pH：
在发酵前10～15小时，不对所述发酵罐内的发酵液pH进行控制；
发酵过程中所述发酵罐内发酵液的pH逐渐下降，当所述发酵罐内发酵液pH低于6.0时，通过流加生理碱性物质控制发酵液pH在6.0～6.5；
发酵后期停止流加生理碱性物质。
进一步地，所述生理碱性物质为氨水。
进一步地，所述培养基包括孢子培养基、摇瓶种子培养基、种子罐培养基和发酵培养基；
所述孢子培养基，用于培养菌种孢子；
所述摇瓶种子培养基，用于培养摇瓶种子；
所述种子罐培养基，用于培养种子罐种子；
所述发酵培养基，用于菌种进行发酵培养。
进一步地，所述孢子培养基由以下组分制成：
可溶性淀粉15～25g/L、黄豆饼粉25～35g/L、轻质碳酸钙5～15g/L、七水硫酸镁2.5～7.5g/L和琼脂粉15～25g/L；
所述孢子培养基的pH为7.0～7.5。
进一步地，所述摇瓶种子培养基由以下组分制成：
葡萄糖2.5～7.5g/L、酵母粉2.5～7.5g/L、玉米浆7.5～15g/L和硫酸镁2.5～7.5g/L；
所述摇瓶种子培养基的pH为7.0～7.3。
进一步地，所述种子罐培养基由以下组分制成：
葡萄糖2.5～7.5g/L、酵母粉2.5～7.5g/L、玉米浆7.5～15g/L、硫酸镁2.5～7.5g/L和聚乙二醇5～10g/L；
所述种子培养基pH为7.0～7.5，所述种子培养基放置于种子罐中。
进一步地，所述发酵培养基由以下组分制成：
甘油15～25g/L、黄豆粉20～40g/L、硫酸镁2.5～7.5g/L、硫酸锰2.5～7.5g/L和聚乙二醇5～10g/L；
所述发酵培养基pH为7.0～7.5，所述发酵培养基放置于发酵罐中。
本发明的发酵法生产茴香霉素的方法和在发酵过程中配置的多种培养基，能够有效提高发酵法生产茴香霉素的效价，使茴香霉素最终效价达到479ug/ml以上，缩短茴香霉素的发酵周期，发酵周期不超过40小时，显著降低了发酵成本，有利于茴香霉素的大规模产业化生产。本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1示出了根据本发明实施例发酵法生产茴香霉素的流程示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种发酵法生产茴香霉素的方法，如图1所示，本方法包括以下步骤：
步骤一：菌种斜面培养，制备孢子悬液。
对菌种进行培养前，需准备孢子培养基，进行孢子培养，制备孢子悬液。孢子悬液制备过程为：取冻干保藏的浅灰色链霉菌ATCC11796菌种，进行梯度稀释后，取最小浓度的菌液涂布于孢子培养基的平板上，28～30℃恒温培养6～7天，挑取单菌落接种于上述10支装有孢子培养基的斜面上，28～30℃继续恒温培养6～7天，待孢子成熟丰满后取1支斜面加入20ml无菌水制备孢子悬液。
步骤二：进行菌种摇瓶种子培养，制备摇瓶种子液。
对孢子悬液继续培养前，取制备好的摇瓶种子培养基，确保菌种孢子的稳定生长。
摇瓶种子培养过程：将步骤一中培养的孢子悬液接入摇瓶种子培养基中，在温度28～30℃，摇床转速为200～250rpm的条件下培养20～24小时，得摇瓶种子培养液。其中，温度优选为28℃，摇床转速优选为220rpm，培养时间优选培养22小时。
步骤三：将摇瓶种子液接入种子罐培养基中，培养种子罐种子液。
在种子罐种子培养前，制备种子培养物质，并将种子培养物质放置于种子罐中，形成种子罐培养基。
种子培养基装入种子罐中时，种子培养物质体积与种子罐体积的比范围为0.6：1～0.8:1，即种子培养基占种子罐体积的60％～80％，若种子罐的体积为1.0m3，则种子培养基的体积为0.6～0.8m3。其中，种子培养基体积与种子罐体积的比优选为0.7～0.8。
种子罐种子培养过程：将培养好的摇瓶种子液按0.75～1.5‰的接种量转接至装有种子培养基的种子罐中，即摇瓶种子液的接种量占种子培养基体积的0.75～1.5‰。在温度为25～30℃，搅拌转速为250～350rpm，通气量为40～80m3/h，罐压为40～60KPa的条件下培养20～24小时，得到种子罐种子培养液。其中，摇瓶种子液优选用1‰的接种量进行接种，培养过程中的温度优选用28℃。
步骤四：对种子罐种子液进行发酵培养。
制备含有发酵培养基的发酵罐，便于提供良好的发酵环境。发酵培养基的体积为发酵罐体积的60％～80％，若发酵罐的体积为1m3，则发酵培养基的体积为6～8m3。其中，发酵培养基的体积优选为发酵装置体积的70％。
发酵培养的过程：将步骤三中培养好的种子罐种子培养液全部转移至装有发酵培养基的发酵罐中，在温度为28～30℃，搅拌转速为100～200rpm，通气量为150～300m3/h，罐压为40～60KPa，pH为6.5～7.5的条件下培养25～30小时。在发酵前10～12小时，培养液pH不进行控制，在此过程中pH逐步下降，当培养液pH低于6.0时，通过流加氨水控制培养液pH在6.0～6.5，确保培养液的pH维持在菌种最有利于合成茴香霉素的生长环境下。
本发明还包括一种用于发酵法生产茴香霉素的培养基，发酵法生产茴香霉素的培养基包括：孢子培养基、摇瓶种子培养基、种子培养基和发酵培养基。
孢子培养基由以下成分组成：可溶性淀粉15～25g/L、黄豆饼粉25～35g/L、轻质碳酸钙5～15g/L、七水硫酸镁2.5～7.5g/L和琼脂粉15～25g/L。且孢子培养基的PH为7.0～8.0，给予孢子生长最佳酸碱环境。其中，可溶性淀粉优选为10g/L、黄豆饼粉优选为10g/L、轻质碳酸钙优选为10g/L、七水硫酸镁优选为5g/L、琼脂粉优选为25g/L，孢子培养基的pH优选为7.3。
孢子培养基的制备过程为：将琼脂粉倒入蒸馏水中加热融化，在加入剩余组份，搅拌至混合均匀。趁热取部分混合物装入多支试管内，剩余部分混合物装入三角瓶中，将试管与三角瓶在适宜温度下灭菌一段时间，试管倾斜冷却、三角瓶平放冷却，制成斜面和平板。
摇瓶种子培养基由以下组份制成：葡萄糖2.5～7.5g/L、酵母粉2.5～7.5g/L、玉米浆7.5～15g/L和硫酸镁2.5～7.5g/L。摇瓶种子培养基的pH为7.0～8.0，灭菌后使用。其中，葡萄糖优选为5g/L、酵母粉优选为5g/L、玉米浆优选为10g/L、硫酸镁优选为5g/L，摇瓶种子培养基的pH优选为7.3。
种子培养基由以下组分制成：葡萄糖2.5～7.5g/L、酵母粉2.5～7.5g/L、玉米浆7.5～15g/L、硫酸镁2.5～7.5g/L和聚乙二醇5～10g/L，发酵种子培养基的pH为7.0～7.5，灭菌后使用。其中，葡萄糖优选为5g/L、酵母粉优选为5g/L、玉米浆优选为10g/L、硫酸镁优选为5g/L和聚乙二醇优选为7.5g/L，发酵种子培养基的pH优选为7.3。
发酵培养基由以下成分组成：甘油15～25g/L、黄豆粉20～40g/L、硫酸镁2.5～7.5g/L、硫酸锰2.5～7.5g/L和聚乙二醇5～10g/L，pH为7.0～8.0，灭菌后使用。其中，甘油优选为20g/L、黄豆粉优选为24g/L、硫酸镁优选为5g/L、硫酸锰优选为5g/L和聚乙二醇优选为7.5g/L，pH优选为7.3。
通过上述培养步骤和培养基成分，对孢子培养基、种子培养基和发酵培养基进行组份规定，能够得到含有茴香霉素含量较高的发酵液。
以下通过制备例对发酵法生产茴香霉素的过程进行示例性说明：
在本制备例中，孢子培养基的可溶性淀粉优选用20g/L、黄豆饼粉优选用30g/L、轻质碳酸钙优选用10g/L、硫酸镁优选用5g/L、琼脂粉优选用20g/L、pH为优选为7.5，培养温度优选28℃。
摇瓶种子培养基的葡萄糖优选10g/L、酵母粉优选10g/L、玉米浆干粉优选20g/L和硫酸镁优选5g/L，摇瓶种子培养基的pH优选7.5。
发酵培养基选用10g/L的葡萄糖、30g/L的甘油、20g/L的玉米浆干粉、30g/L的黄豆饼粉、5g/L的硫酸镁、5g/L的硫酸锰和2g/L的聚醚消泡剂，发酵培养基的PH为7.5。
制备例1
1)孢子培养
孢子培养基的制备：孢子培养基的配置量为1L，依次称量可溶性淀粉20g、黄豆饼粉30g、轻质碳酸钙10g、硫酸镁5g和琼脂粉20g，孢子培养基的pH为7.3。
具体为：量取1L的蒸馏水，将琼脂粉倒入后，在50℃～60℃的水浴，搅拌至琼脂融化后，依次加入可溶性淀粉、黄豆饼粉、轻质碳酸钙和硫酸镁，趁热混合均匀。取18cm*15mm规格的试管10支，每只试管中加入80ml的混合物，剩余混合物装入三角瓶内，将试管和三角瓶放入灭菌箱中，121℃下灭菌30min。拿出灭菌箱后，试管倾斜放置，冷却至管内物质凝固，形成10支斜面培养基。三角瓶竖直放置，冷却后，形成平板培养基。
孢子的培养：取冻干保藏的浅灰色链霉菌ATCC11796菌种1g采用梯度稀释法至10- 7mg/ml，将稀释后的菌液涂布于三角瓶内的平板培养基中，在28℃的恒温箱中培养6～7天，挑取平板培养基上的单菌菌落，接种于10支试管斜面培养基中，继续在28℃的恒温箱中培养6～7天，待孢子成熟丰满后取1支试管斜面培养基加入200ml无菌水制备孢子悬液。
2)种子培养
摇瓶种子培养基：摇瓶种子培养基的配置质量为800ml，按葡萄糖10g/L、酵母粉10g/L、玉米浆干粉20g/L和硫酸镁5g/L的比例配置，且配置后pH为7.3。分装于10个三角瓶中，在115℃下保温30min灭菌，制得摇瓶种子培养基备用；
配置种子培养液:采用1.0m3不锈钢发酵罐作为种子罐进行种子培养，种子罐有效体积0.8m3，同样依照葡萄糖10g/L、酵母粉10g/L、玉米浆干粉20g/L和硫酸镁5g/L的比例配置种子罐内的摇瓶种子培养基，且内部配置的培养液pH为7.5。按摇瓶种子培养基实消后0.8m3的总体积配置，实消温度121℃下灭菌30min，灭菌后冷却并通入无菌空气保压。
摇瓶种子培养过程：将制备例1中制备好的浅灰色链霉菌ATCC11796孢子悬液接入10个摇瓶种子培养基中，在温度28℃、摇床转速为220rpm的条件下培养22小时，得摇瓶种子液800ml；
将制得的摇瓶种子液按1‰的接种量接种于1.0m3装有摇瓶种子培养基的种子罐中，罐温控制为28℃，罐压维持40～60KPa，搅拌转速为250～350rpm的条件下培养20～24小时，得种子培养液。培养结束后，镜检菌丝形态良好、无杂菌污染，菌体浓度在25～30％之间。
3)发酵培养
发酵培养液的配置：采用10m3不锈钢发酵罐进行发酵培养，种子罐有效体积8.0m3，按如下比例配置发酵培养基：甘油20g/L、黄豆粉24g/L、硫酸镁5g/L、硫酸锰5g/L、聚乙二醇7.5g/L、pH为7.3。配置好的发酵培养液按实消后7.2m3配置，发酵培养液实消温度121℃下灭菌30min。灭菌后冷却并通入无菌空气保压。
发酵培养过程为：将制备例2中培养好的种子液以10％的接种量接种于所配置的10m3发酵罐中。发酵过程中温度维持28℃，根据溶氧状况控制转速、通气量和罐压，发酵过程中搅拌转速在100～200rpm，通气量在150～300m3/h，罐压在40～60KPa范围内调节，确保溶氧在30％以上(发酵初始溶氧为100％)。
为了使发酵培养液的pH维持在菌种处于最有利于茴香霉素合成的生长环境，在发酵前10～12小时，对培养液pH不进行控制，在此过程中pH逐步上升至7.5～7.8再逐渐下降至5.5～6.5，当培养液pH低于6.0时，通过流加氨水控制培养液pH在6.0～6.5，发酵过程中每两小时取样进行茴香霉素效价检测，发酵24小时后停止流加氨水，当pH上升至7.5以上且溶氧上升至70％以上即可放罐。
发酵周期30～36小时，发酵完成放罐时发酵液中茴香霉素效价通过HPLC法检测达到528mg/L。
对制备例1中发酵液中茴香霉素发酵效价检测，具体检测过程如制备例2所示：
制备例2
样品处理：取2ml发酵液在10000rpm的转速下离心5min，取上清液用0.45μm有机微孔滤膜过滤得到待测样品。
标准曲线绘制：准确称取5.0mg、10.0mg、20.0mg、40.0mg、60.0mg和80.0mg茴香霉素标准品，分别用纯化水溶解并定容至100ml，配置成50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L和800mg/L的茴香霉素标准品溶液，每个标准品溶液重复三次进行HPLC检测，以茴香霉素浓度(mg/L)为横坐标，峰面积(mV×min)为纵坐标，求得标准曲线和相关系数，供检测样品时使用。
所用HPLC检测条件：仪器为岛津LC-5C，使用0.05M，pH6.0的磷酸盐缓冲液作为流动相(磷酸盐缓冲液：色谱纯乙腈＝87.5:12.5)，使用岛津LC-C18(5μm,460mm×250mm)分析柱，每次进样量为20μl，检测波长为225nm，流速为1.0ml/min，控制柱温30℃，出峰时间约为16.4min，根据样品峰面积代入标准曲线求得茴香霉素发酵效价。
将制备例1中HPLC检查所得的峰面积带入标准曲线中，得到制备例1所得的茴香霉素发酵效价为528mg/L。
制备例3：
1)孢子培养
浅灰色链霉菌ATCC11796斜面菌种培养的孢子培养基和孢子培养过程均与制备例1中所用的孢子培养基和孢子培养过程相同，得到孢子悬液。
2)种子培养
按如下比例配置摇瓶种子培养基：葡萄糖5g/L、酵母粉5g/L、玉米浆干粉10g/L和硫酸镁5g/L，配置后pH为7.3。培养基配质量为100ml，分装于2个三角瓶中，115℃保温30min灭菌，制备成摇瓶种子培养基。
采用5L玻璃罐作为种子罐进行种子培养，种子罐有效体积4L，按如下比例配置种子培养基：葡萄糖10g/L、酵母粉10g/L、玉米浆干粉20g/L、硫酸镁5g/L、聚醚消泡剂2g/L、pH为7.5。按实消后4L配置，实消温度121℃，时间30min进行灭菌，灭菌后冷却并通入无菌空气保压。
将本制备例步骤1)中制备好的孢子悬液接入2个250ml摇瓶种子培养基中，在温度28℃、摇床转速为220rpm的条件下培养22小时，得摇瓶种子液100ml。
将制得的摇瓶种子液取4ml按1‰的接种量接种于上述5L种子罐中，控制罐温在28℃，罐压维持20～40KPa，搅拌转速为350～450rpm的条件下培养20～24小时，得种子培养液。培养结束后，镜检菌丝形态良好、无杂菌污染，菌体浓度在25～30％之间。
3)发酵培养
采用50L不锈钢发酵罐进行发酵培养，种子罐有效体积40L，按如下比例配置发酵培养基：甘油20g/L、黄豆粉24g/L、硫酸镁5g/L、硫酸锰5g/L、聚乙二醇7.5g/L、pH为7.3。按实消后36L配置，实消温度121℃，时间30min，灭菌后冷却并通入无菌空气保压。
将本制备例步骤2)中培养好的种子液以10％的接种量接种于上述50L发酵罐中。发酵过程中温度维持28℃，根据溶氧状况控制转速、通气量和罐压，发酵过程中搅拌转速在200～400rpm，通气量在1500L～2000L/h，罐压在20～40KPa范围内调节，确保溶氧在30％以上(发酵初始溶氧为100％)。
发酵过程中通过控制培养液pH维持菌种处于最有利于茴香霉素合成的生长环境，在发酵前10～12小时，培养液pH不进行控制，在此过程中pH先逐步上升至7.5～7.8再逐渐下降至5.5～6.5，当培养液pH低于6.0时，通过流加氨水控制培养液pH在6.0～6.5，发酵过程中每两小时取样进行茴香霉素效价检测，发酵24小时停止流加氨水，当pH上升至7.5以上且溶氧上升至70％以上即可放罐，发酵周期约30～36小时。
放罐时取发酵液进行HPLC法检测，将检测峰值带入到制备例2中的标准曲线中，得到制备例3所制得发酵液的效价为479mg/L。
通过现有文献中记载的发酵培养基配方、发酵周期及PH控制方法制备出的茴香霉素与本发明实施例中制备的发酵液进行对比，对比例如下：
对比例1
浅灰色链霉菌ATCC11796斜面菌种的制备同制备例3中孢子悬液的制备过程制得孢子悬液，种子培养同制备例3中种子培养过程制得发酵种子，发酵培养步骤同制备例3中种子培养步骤。在该对比例中所采用的发酵培养基配方同制备列3中所采用的发酵培养基配方。发酵过程发酵过程中温度亦维持28℃，同样根据溶氧状况控制转速、通气量和罐压，发酵过程中搅拌转速在200～400rpm，通气量在1500L～2000L/h，罐压在20～40KPa范围内调节，确保溶氧在30％以上(发酵初始溶氧为100％)。
但发酵周期参照文献TAMAbdel-Aal,NAM Abdelwahed,G Awad,AI El Diwany andBM Haroun(2011)Improvement ofAnisomycin Production Through MutationAnd MediumOptimization For Streptomyces Griseolus.AustralianJournal ofBasic&AppliedSciences 5(12),2637-2648；ZHANGJing，CUI Yu-qiong，Xia Huan-zhang(2011)A MutantStrain ofSingle ComponentAnisomycin C Obtained by Strain Mutagenesis.JournalofShenyangPharmaceutical University 28(8),616-620中报道的96小时，发酵培养基发酵开始后96小时停止发酵，测定放罐时发酵液中茴香霉素效价，结果为204mg/L。
对比例2
浅灰色链霉菌ATCC11796斜面菌种的制备同制备例3中孢子悬液的制备，种子培养同制备例3中种子培养过程，发酵培养步骤同制备例3中种子培养步骤。但发酵培养基的配方、发酵周期及PH控制采用文献Improvement of Anisomycin Production ThroughMutation And MediumOptimization For Streptomyces Griseolus.Australian Journalof Basic&Applied Sciences 5(12),2637-2648报道的内容：即发酵培养基配方为玉米淀粉10g/L，黄豆饼粉12g/L，氯化钠2.5g/L；发酵周期为96小时；且不对培养液的PH进行调节。
在发酵过程中温度维持28～30℃，同样根据溶氧状况控制转速、通气量和罐压，发酵过程中搅拌转速在200～400rpm，通气量在1500L～2000L/h，罐压在20～40KPa范围内调节，确保溶氧在30％以上(发酵初始溶氧为100％)。
发酵培养开始后96小时停止发酵，测定放罐时发酵液中茴香霉素效价，同样利用HPLC进行检测，通过标准曲线得到发酵液中茴香霉素效价为129mg/L。
对比列3
孢子悬液、种子培养、发酵培养的步骤同对比例2，所用发酵培养基的配方同对比例2，但发酵周期为26小时，即发酵培养开始后26小时停止发酵，停止后放罐。测定放罐时发酵液中茴香霉素效价，结果为243mg/L。
对比例4
浅灰色链霉菌ATCC11796斜面菌种制备同制备例3中的孢子悬液制备过程，种子培养同制备例3种子培养过程，发酵培养步骤同制备例3中种子培养步骤。但发酵培养基配方、发酵周期及pH控制采用文献TheMutationalBreedingoftheAnisomycinHigh-yieldingProducersandOptimizationofCarbonandNitrogenSource.JournalofWuHanPolytechnicUniversity30(1),1-3所报道的过程：发酵培养基配方为：黄豆饼粉12g/L、蛋白胨2.5g/L、葡萄糖10g/L、淀粉12g/L、酵母粉2.5g/L、K2HPO4.3H2O0.1g/L、MgSO4.7H2O0.125g/L、CaCO31.0g/L和粗海盐30g/L；发酵周期120小时；发酵过程不进行PH控制。发酵过程中温度亦维持28～30℃，同样根据溶氧状况控制转速、通气量和罐压，发酵过程中搅拌转速在200～400rpm，通气量在1500L～2000L/h，罐压在20～40KPa范围内调节，确保溶氧在30％以上(发酵初始溶氧为100％)。
发酵培养开始后120小时停止发酵，HPLC法测定放罐时发酵液中茴香霉素效价，结果为146mg/L。
对比例5
孢子悬液、种子培养、发酵培养的步骤同对比例4，所用发酵培养基的配方和发酵过程中的参数同对比例4，但发酵周期为28小时，即发酵培养开始后28小时停止发酵，停止后放罐。测定放罐时发酵液中茴香霉素效价，结果为238mg/L。
由上述对比例的实验结果可知现有技术发酵产生的茴香霉素效价远低于本发明实施例制备的茴香霉素效价，本发明实施例生产的茴香霉素最终效价达到500ug/ml以上。本发明实施例中茴香霉素的生产周期不超过50小时，远小于现有技术中的生产周期。与目前报道的最优工艺相比，发酵单位提高了100％，发酵周期缩短了50％以上。以较短的时间生产了含的茴香霉素更多的发酵液，显著降低了生产成本，有利于茴香霉素的大规模产业化生产。
本发明对孢子的培养、种子的培养和发酵培养过程中所涉及培养基、培养工艺均进行详细规定，有效提高了浅灰色链霉菌进行发酵制备茴香霉素的含量，缩短发酵时间，提高了茴香霉素的生产效率，适宜进行大规模生产茴香霉素。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (2)

1.一种发酵法生产茴香霉素的方法，其特征在于，所述方法包括：
a.菌种斜面培养，制备孢子悬液：
将梯度稀释后的所述菌种涂布于含孢子培养基的平板上，挑取所述平板上的单菌落接种于含孢子培养基的斜面上，待孢子成熟丰满后加无菌水制备含菌种孢子的孢子悬液；所述菌种为冻干管保藏的浅灰色链霉菌ATCC11796型菌种；含孢子培养基的所述平板和所述斜面的培养温度均为28～30℃、培养时间均为6～7天；其中，所述孢子培养基由以下组分制成：可溶性淀粉15～25g/L、黄豆饼粉25～35g/L、轻质碳酸钙5～15g/L、七水硫酸镁2.5～7.5g/L和琼脂粉15～25g/L；所述孢子培养基的pH为7.0～7.5；
b.进行菌种摇瓶种子培养，制备摇瓶种子液：
将所述孢子悬液接入摇瓶种子培养基中；
在温度28～30℃、摇床转速为200～250rpm的条件下培养20～24小时，得摇瓶种子培养液；所述摇瓶种子培养基由以下组分制成：葡萄糖5～10g/L、酵母粉5～10g/L、玉米浆干粉10～20g/L和硫酸镁5g/L；所述摇瓶种子培养基的pH为7.3；
c.将所述摇瓶种子液接入种子罐培养基中，制备种子罐种子液：
将所述摇瓶种子液转接至装有无菌种子罐培养基中，在温度为28～30℃、搅拌转速为250～350rpm、通气量为40～80m3/h、罐压为40～60KPa的条件下培养20～24小时，制得种子罐种子液；所述种子罐内部的种子培养物质的体积占所述种子罐体积的60％～80％，所述摇瓶种子液按所述种子罐培养基体积的0.75～1.5‰接种量接种至所述种子罐培养基中；所述种子罐培养基由以下组分制成：葡萄糖10g/L、酵母粉10g/L、玉米浆干粉20g/L、硫酸镁5g/L；或者葡萄糖10g/L、酵母粉10g/L、玉米浆干粉20g/L、硫酸镁5g/L和聚醚消泡剂2g/L；所述种子培养基pH为7.5，所述种子培养基放置于种子罐中；
d.对所述种子罐种子液进行发酵培养：
将所述种子罐种子液接种至装有无菌发酵培养基的发酵罐中，在温度为28～30℃、搅拌转速为100～200rpm、通气量为150～300m3/h、罐压为40～60KPa、pH为6.0～8.0的条件下发酵培养30～36小时，制得含茴香霉素的发酵液；所述发酵培养还包括通过补加生理碱性物质控制所述发酵罐内发酵液pH：在发酵前10～15小时，不对所述发酵罐内的发酵液pH进行控制；发酵过程中所述发酵罐内发酵液的pH逐渐下降，当所述发酵罐内发酵液pH低于6.0时，通过流加生理碱性物质控制发酵液pH在6.0～6.5；发酵后期停止流加生理碱性物质；所述发酵培养基由以下组分制成：甘油15～25g/L、黄豆粉20～40g/L、硫酸镁2.5～7.5g/L、硫酸锰2.5～7.5g/L和聚乙二醇5～10g/L；所述发酵培养基pH为7.0～7.5，所述发酵培养基放置于发酵罐中；所述发酵培养基的体积占所述发酵罐体积的60％～80％，所述种子罐种子液按所述发酵培养基体积的5～10％接种量接种于所述发酵罐中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生理碱性物质为氨水。
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