CN114958625B - 一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法，1)取一支土曲霉甘油冷冻管，采用无菌划线法接种至平板培养基上，然后培养，获取单菌落；2)挑选单菌落至无菌试管中，然后加入已灭菌的氯化钠溶液和无菌玻璃珠，然后振荡粉碎；3)吸取菌悬液至斜面培养基上，将菌悬液涂布均匀，然后培养；4)向成熟后的菌种斜面加入无菌水，然后转移至甘油溶液中，然后涡旋混匀，得到甘油菌悬液；5)分装至冷冻管中；6)冷冻保存；对平板培养基与斜面培养基的配方和菌种保存进行优化，土曲霉发酵能力提高了40%‑60%，菌种稳定，甘油菌悬液的均一性良好，操作简易，成本低，原材料与设备来源广泛，适合大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于医药生产技术领域，尤其是涉及一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法。
背景技术
洛伐他汀是由土曲霉(Aspexgillus terrrus)发酵而得到，是一种羟甲基戊二酸辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，最早由默克公司在20世纪初从美国的土壤中分离制得，它能显著降低低密度脂蛋白胆固醇，也比较适合于甘油三脂轻中度升高的患者，并具有较好的安全性，因而于1987年获得FDA批准上市的新型调整血脂药，被誉为治疗心血管系统疾病的里程碑。
发明内容
本发明的目的是提供一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法，包括以下依次进行的步骤：
1)取一支土曲霉甘油冷冻管，采用无菌划线法接种至平板培养基上，然后培养，获取单菌落；
2)挑选单菌落至无菌试管中，然后加入已灭菌的氯化钠溶液和无菌玻璃珠，然后振荡粉碎；
3)吸取菌悬液至斜面培养基上，将菌悬液涂布均匀，然后培养；
4)向成熟后的菌种斜面加入无菌水，然后转移至甘油溶液中，然后涡旋混匀，完成后制备成甘油菌悬液；
5)分装至冷冻管中；
6)冷冻保存。
优选的，步骤1)中，平板培养基的配制方法为：配制1000mL培养基，加酵母提取物1g～3g，麦芽提取物5g～10g，蛋白胨2g～5g，甘油2g～5g，葡萄糖3g～6g，琼脂20g-30g，然后调节pH至6.5±0.5，然后湿热灭菌15分钟～30分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa,灭菌温度为121℃～124℃。
优选的，酵母提取物为酵母粉和/或酵母浸膏。
优选的，步骤1)中，土曲霉在平板培养基上培养的温度为25℃～30℃，培养时间为7天～12天。
优选的，步骤2)中，挑选单菌落的标准为：菌落中央为浅黄色至浅棕色，直径2cm～3cm；
加入2mL已灭菌的质量百分数0.9％的氯化钠溶液和3～4粒无菌玻璃珠。
优选的，步骤3)中，斜面培养基的配制方法为：配制1000mL培养基，加酵母提取物1g～3g，麦芽提取物5g～10g，蛋白胨2g～5g，甘油2g～5g，葡萄糖3g～6g，琼脂20g-30g，然后调节pH至6.5±0.5，然后湿热灭菌15分钟～30分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa,灭菌温度为121℃～124℃；
吸取0.5mL菌悬液至60mL斜面培养基上。
优选的，步骤3)中，土曲霉在斜面培养基上培养的温度为25℃～30℃，培养时间为7天～12天。
优选的，步骤4)中，每一支成熟的菌种斜面加20mL～30mL无菌水，甘油溶液的体积浓度为40％～60％，无菌水和甘油溶液的体积比为1:1。
优选的，40％～60％的甘油溶液的配制方法为：向40mL～60mL甘油中，加入40mL～60mL纯化水，然后湿热灭菌15分钟～30分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa,灭菌温度为121℃～124℃。
优选的，步骤6)中，冷冻保存的温度为-70℃～-90℃。
与现有技术相比，本发明取得了以下的有益的技术效果：
(1).本发明对平板培养基与斜面培养基的配方进行了优化，得到产洛伐他汀的能力更强的土曲霉，发酵水平可达15g/L，部分批次可达到16g/L，比现有水平提高了40％～60％。
(2).本发明技术暂时没有相关记载，操作简易、成本低，适合大规模工业化生产，具有良好的经济效益和社会效益。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本申请提供了一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法，包括以下依次进行的步骤：
1)取一支土曲霉甘油冷冻管，采用无菌划线法接种至平板培养基上，然后培养，获取单菌落；
2)挑选单菌落至无菌试管中，然后加入已灭菌的氯化钠溶液和无菌玻璃珠，然后振荡粉碎；
3)吸取菌悬液至斜面培养基上，将菌悬液涂布均匀，然后培养；
4)向成熟后的菌种斜面加入无菌水，然后转移至甘油溶液中，然后涡旋混匀，完成后制备成甘油菌悬液；
5)分装至冷冻管中；
6)冷冻保存。
在本申请的一个实施例中，步骤1)中，平板培养基的配制方法为：配制1000mL培养基，加酵母提取物1g～3g，麦芽提取物5g～10g，蛋白胨2g～5g，甘油2g～5g，葡萄糖3g～6g，琼脂20g-30g，然后调节pH至6.5±0.5，然后湿热灭菌15分钟～30分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa,灭菌温度为121℃～124℃。
在本申请的一个实施例中，酵母提取物为酵母粉和/或酵母浸膏。
在本申请的一个实施例中，步骤1)中，土曲霉在平板培养基上培养的温度为25℃～30℃，培养时间为7天～12天。
在本申请的一个实施例中，步骤2)中，挑选单菌落的标准为：菌落中央为浅黄色至浅棕色，直径2cm～3cm；
加入2mL已灭菌的质量百分数0.9％的氯化钠溶液和3～4粒无菌玻璃珠。
在本申请的一个实施例中，步骤3)中，斜面培养基的配制方法为：配制1000mL培养基，加酵母提取物1g～3g，麦芽提取物5g～10g，蛋白胨2g～5g，甘油2g～5g，葡萄糖3g～6g，琼脂20g-30g，然后调节pH至6.5±0.5，然后湿热灭菌15分钟～30分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa,灭菌温度为121℃～124℃；
吸取0.5mL菌悬液至60mL斜面培养基上。
在本申请的一个实施例中，步骤3)中，土曲霉在斜面培养基上培养的温度为25℃～30℃，培养时间为7天～12天。
在本申请的一个实施例中，步骤4)中，每一支成熟的菌种斜面加20mL～30mL无菌水，甘油溶液的体积浓度为40％～60％，无菌水和甘油溶液的体积比为1:1。
在本申请的一个实施例中，40％～60％的甘油溶液的配制方法为：向40mL～60mL甘油中，加入40mL～60mL纯化水，然后湿热灭菌15分钟～30分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa,灭菌温度为121℃～124℃。
在本申请的一个实施例中，步骤6)中，冷冻保存的温度为-70℃～-90℃。
本申请中，斜面培养基是固体培养基的一种形式；制作时应趁热定量分装于茄瓶内，并凝固成斜面的称为斜面培养基，用于菌种扩大转管及菌种保藏。
本发明未详尽描述的方法和装置均为现有技术，不再赘述。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法，包括以下依次进行的步骤：
1)配制100mL固体培养基，加酵母提取物0.2g，麦芽提取物0.6g，蛋白胨0.5g，甘油0.4g，葡萄糖0.3g，琼脂2g，加水溶解至100mL，调节pH至6.5，然后湿热灭菌15分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa，灭菌温度为121℃～124℃，然后冷却，制备空白的平板培养基；
取一支土曲霉甘油冷冻管，采用无菌技术划线法接种至平板培养基上，28℃培养10天获取单菌落；
2)目视挑选单菌落，应选择中央浅黄色至浅棕色，直径2cm-3cm的菌落，转移至无菌试管中，加入2mL的已灭菌的0.9％氯化钠溶液和3～4粒无菌玻璃珠，然后振荡粉碎；
3)配制100mL固体培养基，加酵母提取物0.2g，麦芽提取物0.6g，蛋白胨0.5g，甘油0.4g，葡萄糖0.3g，琼脂2g，加水溶解至100mL，调节pH至6.5，量取60mL至250mL茄瓶中，湿热灭菌15分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa，灭菌温度为121℃～124℃，然后摆斜面，冷却，制备斜面培养基；
吸取0.5mL菌悬液至斜面培养基上，将菌悬液涂布均匀，28℃培养10天；
4)向成熟后的菌种斜面加入30mL无菌水，转移至30mL的40％甘油溶液中，涡旋混匀，制备成甘油菌悬液；
5)用灭菌吸管，分装1mL甘油菌悬液至2mL冷冻管中；
6)-70℃～-90℃冷冻长期保存。
从制备的冷冻管中随机取3支，进行发酵能力考察；考察方法如下：接种每1支冷冻管菌悬液至已灭菌30mL发酵培养基中，摇床振荡培养10天，用高效液相法检测洛伐他汀含量。
实施例2
一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法，包括以下依次进行的步骤：
1)配制100mL固体培养基，加酵母提取物0.3g，麦芽提取物0.7g，蛋白胨0.4g，甘油0.4g，葡萄糖0.5g，琼脂2.5g，加水溶解至100mL，调节pH至7.0，湿热灭菌15分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa，灭菌温度为121℃～124℃，然后冷却，制备空白培养基平板；
取一支土曲霉甘油冷冻管，采用无菌技术划线法接种至平板培养基上，28℃培养10天获取单菌落；
2)目视挑选单菌落，应选择中央浅黄色至浅棕色，直径2cm～3cm的菌落，转移至无菌试管中，加入2mL的已灭菌的0.9％氯化钠溶液和3～4粒无菌玻璃珠，然后振荡粉碎；
3)配制100mL固体培养基，加酵母提取物0.3g，麦芽提取物0.7g，蛋白胨0.4g，甘油0.4g，葡萄糖0.5g，琼脂2.5g，加水溶解至100mL，调节pH至7.0，量取60mL至250mL茄瓶中，湿热灭菌15分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa，灭菌温度为121℃～124℃，然后摆斜面，冷却，制备斜面培养基；
吸取0.5mL菌悬液至斜面培养基上，将菌悬液涂布均匀，28℃培养10天；
4)向成熟后的菌种斜面加入30mL无菌水，转移至30mL的50％甘油溶液中，然后涡旋混匀，制备成甘油菌悬液；
5)用灭菌吸管，分装1mL甘油菌悬液至2mL冷冻管中；
6)-70℃～-90℃冷冻长期保存。
从制备的冷冻管中随机取3支，进行发酵能力考察；考察方法如下：接种每1支冷冻管菌悬液至已灭菌30mL发酵培养基中，摇床振荡培养10天，用高效液相法检测洛伐他汀含量。
结果分析：土曲霉的发酵能力稳定，冷冻管的制备及贮存方式满足了生产要求。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法，其特征在于，包括以下依次进行的步骤：
1) 取一支土曲霉甘油冷冻管，采用无菌划线法接种至平板培养基上，然后培养，获取单菌落；平板培养基的配制方法为：配制1000mL培养基，加酵母提取物1g～3g，麦芽提取物5g～10g，蛋白胨2g～5g，甘油2g～5g，葡萄糖3g～6g，琼脂20g-30g，然后调节pH至6.5±0.5，然后湿热灭菌15分钟～30分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa, 灭菌温度为121℃～124℃；
2) 挑选单菌落至无菌试管中，然后加入已灭菌的氯化钠溶液和无菌玻璃珠，然后振荡粉碎；
3) 吸取菌悬液至斜面培养基上，将菌悬液涂布均匀，然后培养；斜面培养基的配制方法为：配制1000mL培养基，加酵母提取物1g～3g，麦芽提取物5g～10g，蛋白胨2g～5g，甘油2g～5g，葡萄糖3g～6g，琼脂20g-30g，然后调节pH至6.5±0.5，然后湿热灭菌15分钟～30分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa, 灭菌温度为121℃～124℃；吸取0.5mL菌悬液至60mL斜面培养基上；
4) 向成熟后的菌种斜面加入无菌水，然后转移至甘油溶液中，然后涡旋混匀，完成后制备成甘油菌悬液；每一支成熟的菌种斜面加20mL～30mL无菌水，甘油溶液的体积浓度为40％～60％，无菌水和甘油溶液的体积比为1:1；其中，40%～60%的甘油溶液的配制方法为：向40mL～60mL甘油中，加入40mL～60mL纯化水，然后湿热灭菌15分钟～30分钟，灭菌压力为0.12±0.02MPa, 灭菌温度为121℃～124℃；
5) 分装至冷冻管中；
6) 冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法，其特征在于，酵母提取物为酵母粉和/或酵母浸膏。
3.根据权利要求1所述的一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法，其特征在于，步骤1)中，土曲霉在平板培养基上培养的温度为25℃～30℃，培养时间为7天～12天。
4.根据权利要求1所述的一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法，其特征在于，步骤2)中，挑选单菌落的标准为：菌落中央为浅黄色至浅棕色，直径2cm～3cm；
加入2mL已灭菌的质量百分数0.9%的氯化钠溶液和3～4粒无菌玻璃珠。
5.根据权利要求1所述的一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法，其特征在于，步骤3)中，土曲霉在斜面培养基上培养的温度为25℃～30℃，培养时间为7天～12天。
6.根据权利要求1所述的一种发酵生产洛伐他汀的土曲霉的培养与保存方法，其特征在于，步骤6)中，冷冻保存的温度为-70℃～-90℃。
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