CN102816812A - 低分子量右旋糖酐的一步法发酵生产工艺 - Google Patents
低分子量右旋糖酐的一步法发酵生产工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了低分子量右旋糖酐的一步法发酵生产工艺，包括以下步骤：将肠膜明串珠菌接种到蔗糖培养基，发酵至16-24h，合成含右旋糖酐粗产品的发酵液；向上述发酵液中加入右旋糖酐酶，使其终浓度为0.05-5U/mL，继续发酵，反应2-8h结束；结束反应后，灭活，得到右旋糖酐粗产物发酵液；对上述粗产物发酵液进行后处理，得到右旋糖酐成品。与传统方法相比，本工艺技术难度小，设备简单，工艺流程简化，且很好的控制了低分子量右旋糖酐的合成。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程和生物催化技术领域，尤其涉及一种低分子量右旋糖酐的生产方法。
背景技术
右旋糖酐(dextran)是一种由若干葡萄糖聚合而成的高分子聚合物，也称葡聚糖，它可由某些细菌例如明串珠菌（Leuconoto mesenteroides）发酵蔗糖产生，其机理是细菌分泌的右旋糖酐蔗糖酶催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并聚合葡萄糖生成右旋糖酐。右旋糖酐是最早发现的也是世界上第一个工业化生产的微生物多糖。
医药上右旋糖酐的应用很普遍，如低分子质量右旋糖酐被用作主要的血浆代用品，这是右旋糖酐商业化后最初的用途，临床上常用的有dextran-70、dextran-40、dextran-20三种，分子量分别为70000、40000、20000Da左右。分子量为5000-7500Da的微分子右旋糖酐目前主要用作右旋糖酐铁的原料，用以治疗缺铁性贫血（Iron Deficiency Anaemia, IDA）。缺铁性贫血是一种常见的营养性疾病。治疗IDA的传统药物是硫酸亚铁，但硫酸亚铁有刺激胃肠导致呕吐和不利于铁的消化吸收等缺陷；新一代的硫酸亚铁缓释胶囊和缓释片剂比硫酸亚铁效果更好且副作用较小，但二价铁易产生内源性自由基，导致细胞膜脂质过氧化而造成细胞膜损伤。自从多糖类物质的免疫调节作用被全面揭示之后，以三价铁为核心、多糖为配合物的多糖铁络合物成为新型补铁剂。多糖铁络合物具有副作用小、络合稳定、水溶性好、含铁量高等优点。20世纪90年代以来，以右旋糖酐铁为代表的多糖铁复合物制剂迅速进入临床应用阶段。
根据《中华人民共和国药典》二部2010版要求，生产右旋糖酐铁的右旋糖酐的重均分子量须为5000-7500Da，国际上对右旋糖酐铁也有类似的要求。但国内对分子量为5000-7500Da的微分子右旋糖酐研究不多，产量很少而需求很大。目前国内很多右旋糖酐铁的兽药厂家使用的右旋糖酐分子量均大大超过5000-7500Da，造成动物吸收不良，严重的引发过敏反应。因此研制微分子右旋糖酐可解决右旋糖酐铁生产原料质量问题，保证产品质量达到药典标准。
目前国内主要是以蔗糖为主要成分的培养基，经肠膜明串珠菌发酵生成高分子量的产物，发酵液通过酸解和乙醇分级沉淀的方法得到不同分子量的药用右旋糖酐产物，不仅乙醇用量大，而且存在工艺难以控制、沉降时间长等缺点。国内对生产药用低分子量右旋糖酐的新工艺研究方向主要为采用膜技术分级分离，虽然取得一定的进展，但该方法生产工艺复杂、对生产人员的技术素养要求高、设备成本高，因此工业化规模实施不经济。
发明内容
本发明的目的是为了克服以上不足，提供一种一步法合成低分子量右旋糖酐的生产工艺。
本发明所采取的技术方案是：
一种右旋糖酐的生产方法，包括以下工艺步骤：
（1）将肠膜明串珠菌接种到蔗糖培养基，发酵至16-24h，合成含右旋糖酐粗产品的发酵液；
（2）向上述发酵液中加入右旋糖酐酶，使其终浓度为0.05-5U/mL，继续发酵，反应2-8h结束；
（3）结束反应后，灭活，得到右旋糖酐粗产物发酵液；
（4）对上述粗产物发酵液进行后处理，得到右旋糖酐成品。
优选的，将肠膜明串珠菌接种到蔗糖培养基之前，先将其活化复苏，经过一级、二级种子培养，然后接种至发酵罐发酵，具体如下：
（1）在固体培养基上活化肠膜明串珠菌，28℃，培养2天；
（2）一级种子培养：将活化的菌株接种至三角瓶中，其中装有含磷酸氢二钠0.14g/100mL、蔗糖13g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL、磷酸二氢钾0.03g/100mL的液体培养基，转速100rpm，28℃，培养至OD600为0.7-0.9作为一级种子；
（3）二级种子培养：把一级种子以20%的接种量接入装有上述液体培养基的三角瓶中，按上述条件培养至OD600为0.7-0.9作为二级种子；
（4）把二级种子接入发酵罐中，液体培养基同（2），培养温度25℃，pH7.2，转速100rpm。
采用的肠膜明串珠菌为20074，Lm1226或GSICC 31208；
优选的，所述右旋糖酐酶的终浓度为0.5-1U/mL；
右旋糖酐酶可一次加入，也可分批多次加入。
本发明的有益效果是：与传统方法相比，本工艺技术难度小，设备简单，工艺流程简化，且很好的控制了低分子量右旋糖酐的合成。
附图说明
图1为实施例1肠膜明串珠菌发酵产右旋糖酐的液相色谱图；
图2为实施例2一步法产右旋糖酐的液相色谱图；
图3为实施例3一步法产右旋糖酐的液相色谱图；
图4为实施例4一步法产右旋糖酐的液相色谱图；
图5为实施例5一步法产右旋糖酐的液相色谱图；
图6为实施例6一步法产右旋糖酐的液相色谱图。
具体实施方式
低分子量右旋糖酐的一步法发酵生产工艺，以蔗糖为原料，采用酶解协同发酵一步法合成低分子量右旋糖酐。
将肠膜明串珠菌接种到蔗糖培养基，发酵至16-24h，优选的，发酵至16-22h，合成含右旋糖酐粗产品的发酵液；向上述发酵液中加入右旋糖酐酶，使其终浓度为0.05-5U/mL，优选的，使其终浓度为0.5-1U/mL，反应2-8h结束；结束反应后，灭活，得到右旋糖酐粗产物发酵液；对上述粗产物发酵液进行后处理，得到右旋糖酐成品。
添加右旋糖酐酶的时间为发酵至16h-24h时，此时微生物合成的右旋糖酐达到较大的分子量，但蔗糖转化尚不完全。添加右旋糖酐酶后，在微生物发酵聚合葡萄糖的同时，右旋糖酐水解酶可分解高分子量的右旋糖酐，通过调节两者作用的条件，控制产物右旋糖酐的聚合度，一步合成低分子量右旋糖酐。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例1
一种肠膜明串珠菌发酵产右旋糖酐的方法。
1) 菌种活化：肠膜明串珠菌20074斜面活化，28℃培养箱培养2天；
2) 一级种子培养：将斜面长出的肠膜明串珠菌，用接种环接一环于250mL三角瓶中，其中装有100 mL含磷酸氢二钠0.14g、蔗糖13g、蛋白胨0.2g、磷酸二氢钾0.03g的液体培养基，在转速100rpm，温度28℃条件下，培养至OD600为0.8左右作为一级种子；
3) 二级种子培养：把一级种子以20%的接种量接入装有上述液体培养基的三角瓶中，在转速100rpm，温度28℃条件下，培养至OD600为0.8左右为二级种子；
4) 把二级种子按20%的接种量接入5L全自动发酵罐中，培养温度25℃，pH 7.2，转速100rpm，液体培养基同（2），发酵24小时结束；
5) 结束发酵后发酵液用0.45μm膜过滤后进液相色谱。
色谱条件：流动相：水；流速：1ml/min；柱温：50℃；检测器：RID-10A；色谱柱：SHODEX KS-803。
以不同分子量标准右旋糖酐样本进液相色谱，根据LC-solution软件计算得到右旋糖酐标准曲线为：lgMw=-0.04480t3+1.142t2-10.40t+36.87，其中Mw为重均分子量，t为保留时间。
发酵液样本的液相色谱图见图1，由右旋糖酵标准曲线和图1可知，保留时间5.760min的峰是分子量为1965K的右旋糖酐；保留时间9.808min的峰是蔗糖；保留时间10.480min的峰是果糖。可见直接发酵的产物分子量比较大，为1965K左右，不能直接作为药用。
实施例2
酶解协同发酵一步法定向生产微分子右旋糖酐的方法1。
1) 菌种活化：肠膜明串珠菌GSICC 31208斜面活化，28℃培养箱培养2天；
2) 一级种子培养：将斜面长出的肠膜明串珠菌，用接种环接一环于250mL三角瓶中，其中装有100 mL含磷酸氢二钠0.14g、蔗糖13g、蛋白胨0.2g、磷酸二氢钾0.03g的液体培养基，在转速100rpm，温度28℃条件下，培养至OD600为0.8左右作为一级种子；
3) 二级种子培养：把一级种子以20%的接种量接入装有上述液体培养基的三角瓶中，在转速100rpm，温度28℃条件下，培养至OD600为0.8左右为二级种子；
4) 把二级种子按20%的接种量接入5L全自动发酵罐中，培养温度25℃，pH 7.2，转速100rpm，培养基同（2）；发酵至22小时，在每L发酵液中添加酶活为1000U/mL的右旋糖酐酶0.8mL，搅拌均匀，继续发酵2小时结束。结束发酵后迅速灭活，使右旋糖酐酶失去活性，不再降解右旋糖酐；
5) 灭活后，将发酵液进行膜过滤，脱色，喷雾干燥，得到成品。
第4步灭活后，取发酵液用0.45μm膜过滤后进液相色谱，色谱条件同上。色谱图见图2，由右旋糖酵标准曲线和图2可知，保留时间7.320min的峰是分子量为23.0K的右旋糖酐；保留时间9.801min的峰是蔗糖；保留时间10.465min的峰是果糖。可见在发酵过程添加右旋糖酐酶可使发酵产物右旋糖酐重均分子量降至23.0K。
实施例3
酶解协同发酵一步法定向生产微分子右旋糖酐的方法2。
1) 菌种活化：肠膜明串珠菌20074斜面活化，28℃培养箱培养2天；
2) 一级种子培养：将斜面长出的肠膜明串珠菌，用接种环接一环于250mL三角瓶中，其中装有100 mL含磷酸氢二钠0.14g、蔗糖13g、蛋白胨0.2g、磷酸二氢钾0.03g的液体培养基，在转速100rpm，温度28℃条件下，培养至OD600为0.8左右作为一级种子；
3) 二级种子培养：把一级种子以20%的接种量接入装有上述液体培养基的三角瓶中，在转速100rpm，温度28℃条件下，培养至OD600为0.8左右为二级种子；
4) 把二级种子按20%的接种量接入5L全自动发酵罐中，培养温度25℃，pH 7.2，转速100rpm，培养基同（2）；发酵至16小时，在每L发酵液中添加酶活为1000U/mL的右旋糖酐酶0.5mL，搅拌均匀，继续发酵8小时结束。结束发酵后迅速灭活，使右旋糖酐酶失去活性，不再降解右旋糖酐；
5) 灭活后，将发酵液进行膜过滤，脱色，喷雾干燥，得到成品。
第4步灭活后，取发酵液用0.45μm膜过滤后进液相色谱，色谱条件同上。色谱图见图3，由右旋糖酵标准曲线和图3可知，保留时间7.333min的峰是分子量为22.4K的右旋糖酐；保留时间9.800min的峰是蔗糖；保留时间10.465min的峰是果糖。可见在发酵过程添加右旋糖酐酶可使发酵产物右旋糖酐重均分子量降至20K左右，符合《中华人民共和国药典》二部2010版中右旋糖酐20的分子量要求。
实施例4
酶解协同发酵一步法定向生产微分子右旋糖酐的方法3。
1) 菌种活化：肠膜明串珠菌Lm1226斜面活化，28℃培养箱培养2天；
2) 一级种子培养：将斜面长出的肠膜明串珠菌，用接种环接一环于250mL三角瓶中，其中装有100 mL含磷酸氢二钠0.14g、蔗糖13g、蛋白胨0.2g、磷酸二氢钾0.03g的液体培养基，在转速100rpm，温度28℃条件下，培养至OD600为0.8左右作为一级种子；
3) 二级种子培养：把一级种子以20%的接种量接入装有上述液体培养基的三角瓶中，在转速100rpm，温度28℃条件下，培养至OD600为0.8左右为二级种子；
4) 把二级种子按20%的接种量接入5L全自动发酵罐中，培养温度25℃，pH 7.2，转速100rpm，培养基同（2）；发酵至18小时，在每L发酵液中添加酶活为1000U/mL的右旋糖酐酶0.8mL，搅拌均匀，继续发酵6小时结束。结束发酵后迅速灭活，使右旋糖酐酶失去活性，不再降解右旋糖酐；
5) 灭活后，将发酵液进行膜过滤，脱色，喷雾干燥，得到成品。
第4步灭活后，取发酵液用0.45μm膜过滤后进液相色谱，色谱条件同上。色谱图见图4，由右旋糖酵标准曲线和图4可知，保留时间7.629min的峰是分子量为12.6K的右旋糖酐；保留时间9.808min的峰是蔗糖；保留时间10.477min的峰是果糖。可见在发酵过程添加右旋糖酐酶可使发酵产物右旋糖酐重均分子量降至12.6K。
实施例5
酶解协同发酵一步法定向生产微分子右旋糖酐的方法4。
1) 菌种活化：肠膜明串珠菌GSICC 31208斜面活化，28℃培养箱培养2天；
2) 一级种子培养：将斜面长出的肠膜明串珠菌，用接种环接一环于250mL三角瓶中，其中装有100 mL含磷酸氢二钠0.14g、蔗糖13g、蛋白胨0.2g、磷酸二氢钾0.03g的液体培养基，在转速100rpm，温度28℃条件下，培养至OD600为0.8左右作为一级种子；
3) 二级种子培养：把一级种子以20%的接种量接入装有上述液体培养基的三角瓶中，在转速100rpm，温度28℃条件下，培养至OD600为0.8左右为二级种子；
4) 把二级种子按20%的接种量接入5L全自动发酵罐中，培养温度25℃，pH 7.2，转速100rpm，培养基同（2）；发酵至16小时，在每L发酵液中添加酶活为1000U/mL的右旋糖酐酶1.0mL，搅拌均匀，继续发酵8小时结束。结束发酵后迅速灭活，使右旋糖酐酶失去活性，不再降解右旋糖酐；
5) 灭活后，将发酵液进行膜过滤，脱色，喷雾干燥，得到成品。
第4步灭活后，取发酵液用0.45μm膜过滤后进液相色谱，色谱条件同上。色谱图见图5，由右旋糖酵标准曲线和图5可知，保留时间8.134min的峰是分子量为5.3K的右旋糖酐；保留时间9.798min的峰是蔗糖；保留时间10.479min的峰是果糖。可见在发酵过程添加右旋糖酐酶可使发酵产物右旋糖酐重均分子量降至5.3K，符合《中华人民共和国药典》2010版中右旋糖酐铁的要求。
实施例6
酶解协同发酵一步法定向生产微分子右旋糖酐的方法5。
1) 菌种活化：肠膜明串珠菌GSICC 31208斜面活化，28℃培养箱培养2天；
2) 一级种子培养：将斜面长出的肠膜明串珠菌，用接种环接一环于250mL三角瓶中，其中装有100 mL含磷酸氢二钠0.14g、蔗糖13g、蛋白胨0.2g、磷酸二氢钾0.03g的液体培养基，在转速100rpm，温度28℃条件下，培养至OD600为0.8左右作为一级种子；
3) 二级种子培养：把一级种子以20%的接种量接入装有上述液体培养基的三角瓶中，在转速100rpm，温度28℃条件下，培养至OD600为0.8左右为二级种子；
4) 把二级种子按20%的接种量接入5L全自动发酵罐中，培养温度25℃，pH 7.2，转速100rpm，培养基同（2）；发酵至16小时，在每L发酵液中添加酶活为1000U/mL的右旋糖酐酶0.5mL，搅拌均匀；发酵至20小时，在每L发酵液中添加酶活为1000U/mL的右旋糖酐酶0.3mL，搅拌均匀；继续发酵4小时结束。结束发酵后迅速灭活，使右旋糖酐酶失去活性，不再降解右旋糖酐；
5) 灭活后，将发酵液进行膜过滤，脱色，喷雾干燥，得到成品。
第4步灭活后，取发酵液用0.45μm膜过滤后进液相色谱，色谱条件同上。色谱图见图6，由右旋糖酵标准曲线和图6可知，保留时间8.089min的峰是分子量为5.7K的右旋糖酐；保留时间9.798min的峰是蔗糖；保留时间10.478min的峰是果糖。可见在发酵过程添加右旋糖酐酶可使发酵产物右旋糖酐重均分子量降至5.7K，符合《中华人民共和国药典》2010版中右旋糖酐铁的要求。
Claims (5)
1.一种右旋糖酐的生产方法，包括以下工艺步骤：
（1）将肠膜明串珠菌接种到蔗糖培养基，发酵至16-24h，合成含右旋糖酐粗产品的发酵液；
（2）向上述发酵液中加入右旋糖酐酶，使其终浓度为0.05-5U/mL，继续发酵，反应2-8h结束；
（3）结束反应后，灭活，得到右旋糖酐粗产物发酵液；
（4）对上述粗产物发酵液进行后处理，得到右旋糖酐成品。
2.根据权利要求1所述的右旋糖酐的生产方法，其特征在于：所述将肠膜明串珠菌接种到蔗糖培养基之前，先将其活化复苏，经过一级、二级种子培养，然后接种至发酵罐发酵，具体如下：
（1）在固体培养基上活化肠膜明串珠菌，28℃，培养2天；
（2）一级种子培养：将活化的菌株接种至三角瓶中，其中装有含磷酸氢二钠0.14g/100mL、蔗糖13g/100mL、蛋白胨0.2g/100mL、磷酸二氢钾0.03g/100mL的液体培养基，转速100rpm，28℃，培养至OD600为0.7-0.9作为一级种子；
（3）二级种子培养：把一级种子以20%的接种量接入装有上述液体培养基的三角瓶中，转速100rpm，28℃，培养至OD600为0.7-0.9作为二级种子；
（4）把二级种子接入发酵罐中，液体培养基同（2），培养温度25℃，pH7.2，转速100rpm。
3.根据权利要求1或2所述的右旋糖酐的生产方法，其特征在于：采用的肠膜明串珠菌为20074，Lm1226或GSICC 31208。
4.根据权利要求1或2所述的右旋糖酐的生产方法，其特征在于：所述右旋糖酐酶的终浓度为0.5-1U/mL。
5.根据权利要求1或2所述的右旋糖酐的生产方法，其特征在于：所述右旋糖酐酶一次加入，或分批加入。
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