CN107746862A - 利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法，包括以下步骤：1)、将酪丁酸梭菌制备成种子悬浮培养液；2)、在发酵罐(1)内，将种子悬浮培养液加入至发酵培养基中在厌氧条件下于37±0.5℃预培养直至菌体OD600达到8.0；利用蠕动泵(2)以30‑100mL/min的速度将经扩大培养的培养液泵入纤维床生物反应器(3)内，培养液中的菌体被固定于内置式纤维床固定化装置(3)内，其他液体通过纤维床生物反应器(3)的出口流回至发酵罐(1)中，从而达到循环状态；当发酵罐(1)内的发酵液中碳源耗尽时，将上述培养液更换为新鲜发酵培养基进行批次发酵、补料发酵和反复批次发酵，得到丁酸。

Description

利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法
技术领域
本发明涉及利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的工艺，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
丁酸(butyric acid)又称酪酸，是一种具有刺激性气味的短链低级脂肪酸，常以酯的形式或游离状态存在于自然界中。丁酸及其衍生物作为一种重要的精细化学品，被广泛应用于食品、化学、医药、饲料等领域。在食品工业中，丁酸可作为食品添加剂用于配制糖果、饮料调味剂，并且能起到调节食品酸味和抑制食品中细菌生长的作用；在工业合成中，丁酸可作为一种重要的化工原料，如丁酸丁酯常用于配漆、抽丝等，是涂料、硝化纤维素及虫胶等的常用溶剂，丁酸纤维素在抗老化、耐水、收缩等方面均优于醋酸纤维素，并且其衍生物具有良好的耐热、耐光和防潮性，可用于喷漆和成型；在医药领域，丁酸是哺乳动物体内肠道菌群利用膳食纤维发酵产生的短链脂肪酸，能够为肠黏膜提供原始能量，促进肠黏膜修复，提高机体免疫机能。此外，丁酸可以抑制人胃癌细胞的增殖，诱导癌细胞发生凋亡，具有预防胃肠疾病的功能；在饲料工业中，丁酸钠可作为替代抗生素的潜在饲料添加剂，在促进动物生长、提高饲料转化率、抑制肠道病原菌繁殖以及提高机体免疫力等方面发挥着重要作用。
目前，丁酸的生产工艺以化学合成和生物发酵为主，化学合成法包括正丁醛氧化法、丙烯羰基化法等。其中正丁醛氧化法因具有工艺路线简单、生产易于控制、原料单一、产品收率高等优点，在工业上得到广泛的应用，是目前工业上生产丁酸的主要方法，但由于生产过程造成的环境污染问题也日益突出。丙烯羰基化法的生产投资大，并且反应过程中产生较多的副产物，在工业上应用具有局限性，因而该方法已逐步被淘汰。微生物发酵法生产丁酸是指利用微生物代谢生产丁酸。目前虽然生物法生产丁酸由于反应器生产率低、终产物浓度及产量低而未实现真正的产业化，但由于该方法产丁酸具有耗能低、反应条件温和、原料可再生等优点，已受到人们越来越多的重视。
微生物发酵法利用的产丁酸菌多为专性厌氧菌，主要包括梭菌属(Clostridium)、丁酸杆菌属(Butyribacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、真杆菌属(Eubacterium)、巨球型菌属(Megasphaera)、八叠球菌属(Sarcina)以及不解糖消化链球菌(Peptostreptococcusasaccharolyticus)等。其中，梭菌属(Clostridium)是使用最多的菌种，能利用底物种类广泛，包括己糖、戊糖以及各种生物质原料中的寡糖和多聚糖。酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)是梭菌属产丁酸细菌的一种，是一种专性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，能利用葡萄糖、木糖和果糖合成丁酸、乙酸、氢气和二氧化碳。由于利用酪丁酸梭菌生产丁酸具有产量高、纯度高、得率高且稳定性好，并且能促进廉价生物质资源的利用，具有广阔的商业应用前景。
运用传统发酵工艺生产丁酸时，终产物的抑制作用常导致丁酸浓度和得率低、丁酸产率低、细胞生长对丁酸的选择性低，因而使得丁酸不易从发酵液中分离出来，造成了丁酸分离难度大和成本高等问题。纤维床生物反应器(FBB)是由美国俄亥俄州立大学的杨尚天教授等人在改进传统的填充床反应器性能的基础上设计出的一种简单、高效的生物反应器，适用于厌氧微生物固定化发酵。FBB选用棉纤维织物等纤维材料作为固定细胞的载体，具有以下优点：①材料化学惰性，对细胞不具有毒害作用，也不会被细胞降解，不影响微生物的生长代谢；②纤维材料具有高比表面积(﹥40m2/m3)和高孔隙率(﹥95％)，因此具有更高的传质效率；③具有较高的载体活性，固定化细胞的活性回收率高。此外，以纤维材料为载体的FBB相对于其他类型的反应器，其工作周期长、制作简单、性能稳定、产物收率高、底物耐受性高、易于工业放大。目前，FBB已广泛应用于丁酸、丙酸、乳酸等有机酸的生产，是一种理想的细胞固定载体。
随着化石性资源日渐枯竭，人们对生物基化学品和生物能源需求快速增加，非粮原料和废弃生物质已成为当前生物炼制工程的热点。利用植物基淀粉、木质纤维素等生物质资源生产丁酸、乙醇等化学物质，已越来越受到关注。玉米皮是玉米深加工的一种副产品，其产量一般占玉米总量的14％-20％，主要由淀粉、纤维素和半纤维素组成，是一种潜在的廉价生物质资源。目前我国的玉米皮利用率较低，大多应用于饲料行业，附加值比较低，造成了资源的极度浪费。而酪丁酸梭菌能够利用葡萄糖、木糖、果糖、乳糖、蔗糖等糖源生产丁酸，而且能够利用多种非粮作物(如木薯)及工农业废弃物(如乳清、甘蔗糖蜜、木薯渣水解液和玉米浆等)生产丁酸，表明丁酸发酵能够充分利用多种可再生资源转化的可发酵性糖，是生物炼制工程中最有前景的方向之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的工艺。一方面，可以降低微生物发酵法生产丁酸的成本，提高丁酸发酵的产率和得率，另一方面，可以实现玉米皮等农业废弃物的资源化利用，减少环境污染。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法，包括以下步骤：
1)、将酪丁酸梭菌制备成种子悬浮培养液；
2)、在发酵罐(1)内，将种子悬浮培养液加入至发酵培养基中在厌氧条件下于37±0.5℃预培养直至菌体OD600达到8.0(培养时间约为48h)，以此作为扩大培养的培养液；
利用蠕动泵(2)以30-100mL/min的速度将经扩大培养的培养液泵入纤维床生物反应器(3)内，培养液中的菌体被固定于内置式纤维床固定化装置(3)内，其他液体通过纤维床生物反应器(3)的出口流回至发酵罐(1)中，从而达到循环状态；
当发酵罐(1)内的发酵液中碳源耗尽时，将上述培养液更换为新鲜发酵培养基进行批次发酵、补料发酵和反复批次发酵，得到丁酸；
发酵过程中，发酵罐(1)的搅拌转速控制在150±20r/min，温度设定为37±0.5℃，用30％(质量％)的氨水维持pH在6.0±0.1；
所述发酵培养基为：碳源50～60g/L、酵母提取物2g/L、蛋白胨4g/L、(NH4)2SO4 2g/L、K2HPO4 1g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.015g/L、CaCl2·2H2O0.015g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、CoCl2·6H2O 0.02g/L、ZnSO4·7H2O 0.002g/L，余量为水。
作为本发明的利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法的改进：
所述碳源为葡萄糖、木糖或者玉米皮水解液；
所述玉米皮水解液中总还原糖含量为45.06g/L～56.04g/L，葡萄糖与木糖含量比值为1～1.3:1，所述总还原糖含量为葡萄糖含量和木糖含量之和。
作为本发明的利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法的进一步改进：步骤1)的种子悬浮培养液包括以下步骤：
①、用接种针蘸取酪丁酸菌菌液，在琼脂平板上划线，置37±0.5℃厌氧培养72±2h；
②、将步骤①培养好的单菌落接种于生长培养基(50mL)中，置37±0.5℃厌氧培养72±2h，得到一级种子液；
③、取一级种子液接种于生长培养基(50mL)中，接种量为5％(体积％)，置37±0.5℃厌氧培养72±2h，传代2-3次，从而分别得到二级种子液和三级种子液，并以三级种子液作为发酵母液；
上述步骤②、步骤③中所用的装置均为100mL厌氧血清瓶；
④、取三级种子液接种于生长培养基中，接种量为5％，置37±0.5℃下厌氧培养至菌液OD600为5.0，得到种子悬浮培养液；
所述生长培养基成分包括：葡萄糖20g/L、酵母提取物2g/L、蛋白胨4g/L、(NH4)2SO4 2g/L、K2HPO4 1g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.015g/L、CaCl2·2H2O0.015g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、CoCl2·6H2O 0.02g/L、ZnSO4·7H2O 0.002g/L，余量为水。
上述步骤④中所用的装置为200mL厌氧血清瓶。
作为本发明的利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法的进一步改进：厌氧环境通过85％N2、10％H2和5％CO2混合气得到。
作为本发明的利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法的进一步改进：玉米皮水解液的最佳制备工艺为：将烘干后的玉米皮粉(水分含量≤5％，粒径为50-100μm)与0.4mol/L稀硫酸以质量比1:10混合，于110～120℃下水解6h，过滤离心后取上清，与活性炭以体积质量比100:1混合，于30℃脱色30min。
作为本发明的利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法的进一步改进：所述纤维床生物反应器为内置式纤维床反应器，具体制作方法是：裁剪大小完全相同的棉质纤维毛巾和不锈钢丝网，将作为织物层的棉质纤维毛巾铺放在等面积的不锈钢丝网上，二者共同以短边为轴垂直卷成圆筒状，形成织物层和钢丝网层交替分布的螺旋体，置于反应器柱内，为了使流体分布均匀，在玻璃柱底部填充弹簧，最后两端加盖密封，从而形成内置式纤维床反应器。
纤维床固定化装置，即fibrous bed bioreactor(FBB)。其最重要的作用是1、固定菌体；2、使通过纤维床固定装置的流体均匀分布。其参数取决于蠕动泵的泵入速度，当菌体OD600达到8.0时，打开蠕动泵，将培养基泵入FBB内，此时泵的速度为30mL/min，菌体将固定在FBB内的毛巾上，其他液体通过FBB玻璃柱上端的出口流回发酵罐中，从而达到循环状态。当发酵液中的碳源耗尽时，更换新鲜发酵液，并将FBB内流入培养基的速度提高至100mL/min，开始进行FBB固定化发酵动力学研究。
在本发明中，酪丁酸梭菌(标号ATCC 25755)，拉丁文学名为Clostridiumtyrobutyricum。
在本发明中，首先探索玉米皮水解液制备的最适条件，具体如下：
通过正交试验等，摸索玉米皮酸水解处理的最适条件(酸浓度、固液比、时间、温度)，确定了玉米皮酸水解的条件是酸浓度0.4M，温度120℃，时间6h，固液比1:10(w：v)，在以上条件下，总还原糖含量最高，为50.67g/L。由于温度过高会产生更多有毒有害物质，因而考察了温度(105℃、110℃、115℃和120℃)对总还原糖含量的影响，结果表明，110℃条件下，总还原糖含量升高更快，最终含量为48.81g/L。脱色反应后，总还原糖含量为45.06g/L。后期发酵时，再通过水解和脱色，所得葡萄糖及木糖含量约为31.8g/L、24.24g/L，比值为1.3:1，总还原糖含量为45.06～56.04g/L。
本发明以葡萄糖、木糖和玉米皮水解液为碳源，利用纤维床生物反应器进行固定化发酵。若玉米皮水解液仅批次发酵得到的丁酸浓度较低，会给后续分离带来较大困难。为了进一步提高丁酸产量，在发酵过程中，当糖浓度接近0时，可采用补充葡萄糖进行补料发酵生产丁酸工艺。为了反复利用纤维床生物反应器进行固定化发酵，以玉米皮水解液为碳源，反复进行批次发酵，形成以玉米皮水解液为碳源的固定化反复批次发酵工艺。通过实现固定化发酵生产丁酸的连续性，从而降低生产成本。
本发明具有如下技术优势：
从环境保护和资源利用角度，研究农业废弃物—玉米皮水解液发酵生产丁酸的生物炼制工艺。玉米皮水解液的预处理操作条件温和，设备简单，易于工业生产，对丁酸产量的提高效果明显。利用纤维床生物反应器进行固定化发酵，可以实现玉米皮等废弃物的资源化利用，降低发酵法生产丁酸的成本，提高丁酸发酵产率和得率，同时省去反复接种，并连续长期稳定运行，易于进行工业放大。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为发酵产丁酸的生物发酵系统的示意图；
图1上为系统的整体示意图；图1下为内置式纤维床固定化装置3的制备过程示意图；
图1中：1.发酵罐(机械搅拌式发酵罐)；2.蠕动泵；3.内置式纤维床固定化装置；4.pH电极；5.pH检测器；6.尾气吸收装置；7.储碱瓶；8.氮气补入装置；9.取样注射器。
图2是纤维床固定化批次发酵葡萄糖生产丁酸的动力学图；图2中：
图3是纤维床固定化批次发酵木糖生产丁酸的动力学图；图3中：
图4是纤维床固定化补料发酵玉米皮水解液和葡萄糖生产丁酸的动力学图；图4中：
图5是纤维床固定化反复批次发酵玉米皮水解液生产丁酸的动力学图；图5中：
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
图1给出了一种生物发酵系统，包括发酵罐1，发酵罐1为机械搅拌式发酵罐、蠕动泵2(泵入及泵出培养基)、内置式纤维床反应器3(固定菌体)、pH电极4(检测发酵过程pH变化)、pH检测器5(检测发酵过程pH变化)、尾气吸收装置6(吸收CO2、H2)、储碱瓶7(储存氨水，调节pH)、氮气补入装置8(通入氮气，维持发酵罐1中的厌氧环境)、取样注射器9(固定时间取样检测丁酸、乙酸产量、OD600以及葡萄糖余量)。
纤维床固定化装置3，即fibrous bed bioreactor(FBB)。
在进行纤维固定化发酵前，机械搅拌式发酵罐1、内置式纤维床反应器3及所有管路需要在121℃下灭菌30min。
发酵罐1通过蠕动泵2与内置式纤维床反应器3的进口相连通，内置式纤维床反应器3的出口通过管路返回至发酵罐1；储碱瓶7与发酵罐1相连通；在储碱瓶7与发酵罐1相连的管路上设有由pH检测器5来控制通/断的开关，pH检测器5上的pH电极4用于检测发酵罐1内物料的pH值；氮气补入装置8与发酵罐1相连通；发酵罐1的尾气出口与尾气吸收装置6相连；在发酵罐1上设置有取样注射器9。
内置式纤维床反应器3的制备方法为：裁剪大小完全相同的织物(例如为棉质毛巾)和不锈钢丝网分别作为织物层和不锈钢丝网层，所述织物层和不锈钢丝网层均呈长方形；将织物层铺放在等面积的不锈钢丝网层上，二者共同以短边为轴垂直卷成圆筒状，形成织物层和钢丝网层交替分布的螺旋体，置于玻璃柱体内，在玻璃柱体内腔的底部填充设置弹簧，织物层和钢丝网层交替分布的螺旋体被置于弹簧之上；设置弹簧的目的是为了使流体分布均匀。
最后在玻璃柱的两端设置带孔的盖体。玻璃柱体外设有循环水浴锅，从而形成内置式纤维床生物反应器3。该循环水浴锅的作用是控制内置式纤维床生物反应器3中玻璃柱的温度。
蠕动泵2的作用是1、将扩大后的培养液泵入发酵罐1中，菌体附着在内置式纤维床反应器3的毛巾上，其他液体通过FBB玻璃柱上端出口流回发酵罐，从而达到一种循环状态；2、将发酵培养基泵入FBB中；3、更换新的发酵培养基时，将旧发酵培养基泵出。
其工作过程如下：
1、首先，经氮气补入装置8通入30min无菌氮气使系统达到厌氧状态。
然后，在发酵罐1内，将种子悬浮液加入至发酵培养基中于37℃预培养直至菌体OD600达到8.0(培养时间约为48h)，以此作为扩大培养的培养液(即，发酵液)。
将上述扩大培养的培养液经由橡皮管泵入内置式纤维床反应器3内，泵的速度为30mL/min，此时发酵液中的菌体慢慢固定在内置式纤维床反应器3的毛巾上，而其他液体则通过内置式纤维床反应器3玻璃柱上端的出口流回发酵罐1中，当发酵液中碳源耗尽时，通过蠕动泵2将发酵液以100mL/min泵出，然后以100mL/min将新鲜发酵液泵入。
实施例1、纤维床固定化酪丁酸梭菌补料发酵生产丁酸的方法，以葡萄糖为碳源，依次进行如下步骤：
1)、用接种针蘸取酪丁酸梭菌的菌液，在琼脂平板上划线，置37℃厌氧培养72h；酪丁酸梭菌(标号ATCC 25755)的分类命名：中文名为酪丁酸梭菌，拉丁文学名为Clostridiumtyrobutyricum，酪丁酸梭菌由美国俄亥俄州立大学杨尚天教授提供；
2)、将步骤1)培养好的单菌落接种于含50mL生长培养基的100mL厌氧血清瓶中，置37℃厌氧培养72h，得到一级种子液；
3)、取一级种子液接种于含50mL生长培养基的100mL厌氧血清瓶中，接种量为5％(2.5mL)，置37℃厌氧培养72h，传代2-3次，分别得到二级种子液和三级种子液，并以三级种子液作为发酵母液；
4)、取三级种子液接种于含100mL生长培养基200mL厌氧血清瓶中，接种量为5％(5mL)，置37℃下厌氧培养至菌液OD600为5.0，得到种子悬浮培养液；
上述的生长培养基成分包括：葡萄糖20g/L、酵母提取物2g/L、蛋白胨4g/L、(NH4)2SO42g/L、K2HPO4 1g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.015g/L、CaCl2·2H2O0.015g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、CoCl2·6H2O 0.02g/L、ZnSO4·7H2O 0.002g/L，余量为水。
5)、取种子悬浮液于含2L发酵培养基的5L发酵罐1中，置37℃预培养48h后，菌体OD600达到8.0，以此作为扩大培养的培养液；
利用蠕动泵2以30-100mL/min的速度将扩大培养的培养液泵入如图1所示的内置式纤维床固定化反应器3内，实现葡萄糖的批次发酵，得到丁酸。发酵过程中，搅拌转速控制在150r/min，温度设定为37℃，用30％的氨水维持机械搅拌式发酵罐1中发酵体系的pH在6.0；
上述的发酵培养基成分包括：葡萄糖50.97g/L、酵母提取物2g/L、蛋白胨4g/L、(NH4)2SO4 2g/L、K2HPO4 1g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.015g/L、CaCl2·2H2O 0.015g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、CoCl2·6H2O 0.02g/L、ZnSO4·7H2O 0.002g/L，余量为水。
6)、发酵过程中，每4-10h通过取样注射器进行一次取样，检测菌体生长、底物消耗和产物生成浓度变化；可利用高效液相色谱检测产物组分。
当检测发酵液中碳源耗尽时，结束此次的发酵生产丁酸。此步骤中，当发酵48h后，丁酸浓度不再增加，为13.51g/L。
此时，可分成以下两种后处理方式：
方式一、发酵后产物，可按照常规的萃取法进行后处理。
具体操作如下：
①菌体去除：取发酵液在15000g下离心50min，收集上清液；
②蛋白质去除：
加酸沉淀法：盐酸调节去除菌体后pH值为1、2、3、4，于15000g下离心50min，测定上清液蛋白质含量，计算去除率；
超滤法：选择孔径为3KDa、10KDa、30KDa的超滤离心管，在4000g下离心10min，对去除菌体后的发酵液进行超滤，并测定透过液中蛋白质含量，计算去除率；
③一定量的络合剂TOA(三辛胺)和稀释剂混合，形成一定TOA浓度的萃取剂，将其与预处理后的丁酸发酵液按一定的比例比加入具塞三角瓶中，于25℃、180r/min的条件下于恒温振荡器中震荡3h，再将混合液离心10min，使两相迅速分离平衡。取上相(有机相)和下相(水相)进行分析测定萃取前后丁酸和乙酸的浓度。
8)、随后进行第一次葡萄糖补料发酵，补加葡萄糖浓度至39.32g/L，发酵92h后，丁酸浓度不再增加，为34.77g/L。接着进行第三次葡萄糖补料发酵，补加葡萄糖浓度至33.06g/L，发酵140h后，发酵液中葡萄糖浓度接近0时即停止发酵，高效液相色谱测得丁酸终浓度为54.12g/L。葡萄糖批次发酵的动力学如图2所示。
实施例2、一种纤维床固定化酪丁酸梭菌补料发酵生产丁酸的方法，与实施例1的区别在于以葡萄糖为碳源，即，将发酵培养基中的“葡萄糖50.97g/L”改成“52.58g/L木糖”，其余等同于实施例1。
当发酵60h后，丁酸浓度不再增加，为22.17g/L。随后进行第一次木糖补料发酵，补加木糖浓度至40.33g/L，发酵108h后，丁酸浓度不再增加，为42.54g/L。接着进行第三次木糖补料发酵，补加木糖浓度至31.54g/L，发酵150h后，当发酵150h后，发酵产物丁酸的终浓度不再增加，发酵液中木糖浓度接近0时即停止发酵，高效液相色谱测得丁酸终浓度为50.43g/L。木糖批次发酵的动力学如图3所示。
实施例3、一种纤维床固定化酪丁酸梭菌批次发酵生产丁酸的方法，与实施例1的区别在于以下两点；其余等同于实施例1：
1、是以玉米皮水解液和葡萄糖为碳源，即，首先以含葡萄糖31.8g/L和含木糖24.24g/L的玉米皮水解液作为碳源，进行第一批纤维固定化发酵；当玉米皮水解液中糖浓度接近0时，泵出发酵液，进行第二批发酵。第二批纤维固定化发酵是以55.25g/L葡萄糖为碳源，当糖浓度接近0时，停止发酵。
2、发酵过程有区别，即，具体为：
当发酵56h后，发酵产物丁酸的终浓度不再增加，发酵液中糖浓度接近0时，此时高效液相色谱测得丁酸浓度为21.8g/L。将发酵液泵出，进行第二批发酵，以55.25g/L葡萄糖为碳源，发酵112h后，高效液相色谱测得丁酸浓度为23.64g/L。玉米皮水解液和葡萄糖批次发酵的动力学如图4所示。
根据上述实施例3可以得知，玉米皮水解液能够稳定地用于纤维固定化发酵产丁酸，该结果表明玉米皮水解液具有作为发酵底物的潜能。产丁酸量低于葡萄糖为底物时的发酵，是因为玉米皮水解液中含有部分酚类物质，而该物质会一定程度上抑制丁酸的产生。
实施例4、一种纤维床固定化酪丁酸梭菌反复批次发酵生产丁酸的方法，与实施例1的区别在于以下两点；其余等同于实施例1：
1、以玉米皮水解液为碳源，即，将实施例1的发酵培养基中的葡萄糖50.97g/L换成总还原糖含量为45.06g/L～56.04g/L的玉米皮水解液，作为玉米皮水解液发酵培养基。
2、发酵过程有区别，即，具体为：
发酵过程中，当糖浓度接近0时，更换新的玉米皮水解液发酵培养基，共进行3批纤维固定化发酵，第一批发酵过程中，玉米皮水解液中总还原糖的初始浓度为55.15g/L，发酵56h后，丁酸浓度不再增加，为20.44g/L；接着进行第二批发酵，玉米皮水解液中总还原糖的初始浓度为53.84g/L，发酵100h后，丁酸浓度不再增加，为21.5g/L；最后进行第三批发酵，玉米皮水解液中总还原糖的初始浓度为49.59g/L，发酵150h后，丁酸浓度不再增加，为20.31g/L。丁酸平均终浓度为20.75g/L。玉米皮反复批次发酵的动力学如图5所示。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (6)

1.利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法，其特征是包括以下步骤：
1)、将酪丁酸梭菌制备成种子悬浮培养液；
2)、在发酵罐(1)内，将种子悬浮培养液加入至发酵培养基中在厌氧条件下于37±0.5℃预培养直至菌体OD600达到8.0，以此作为扩大培养的培养液；
利用蠕动泵(2)以30-100mL/min的速度将经扩大培养的培养液泵入纤维床生物反应器(3)内，培养液中的菌体被固定于内置式纤维床固定化装置(3)内，其他液体通过纤维床生物反应器(3)的出口流回至发酵罐(1)中，从而达到循环状态；
当发酵罐(1)内的发酵液中碳源耗尽时，将上述培养液更换为新鲜发酵培养基进行批次发酵、补料发酵和反复批次发酵，得到丁酸；
发酵过程中，发酵罐(1)的搅拌转速控制在150±20r/min，温度设定为37±0.5℃，用30％的氨水维持pH在6.0±0.1；
所述发酵培养基为：碳源50～60g/L、酵母提取物2g/L、蛋白胨4g/L、(NH4)2SO4 2g/L、K2HPO4 1g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.015g/L、CaCl2·2H2O0.015g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、CoCl2·6H2O 0.02g/L、ZnSO4·7H2O 0.002g/L，余量为水。
2.根据权利要求1所述的利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法，其特征是：
所述碳源为葡萄糖、木糖或者玉米皮水解液；
所述玉米皮水解液中总还原糖含量为45.06g/L～56.04g/L，葡萄糖与木糖含量比值为1～1.3:1，所述总还原糖含量为葡萄糖含量和木糖含量之和。
3.根据权利要求1或2所述的利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法，其特征是：步骤1)的种子悬浮培养液包括以下步骤：
①、用接种针蘸取酪丁酸菌菌液，在琼脂平板上划线，置37±0.5℃厌氧培养72±2h；
②、将步骤①培养好的单菌落接种于生长培养基中，置37±0.5℃厌氧培养72±2h，得到一级种子液；
③、取一级种子液接种于生长培养基中，接种量为5％，置37±0.5℃厌氧培养72±2h，传代2-3次，从而分别得到二级种子液和三级种子液，并以三级种子液作为发酵母液；
④、取三级种子液接种于生长培养基中，接种量为5％，置37±0.5℃下厌氧培养至菌液OD600为5.0，得到种子悬浮培养液；
所述生长培养基成分包括：葡萄糖20g/L、酵母提取物2g/L、蛋白胨4g/L、(NH4)2SO4 2g/L、K2HPO4 1g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L、FeSO4·7H2O 0.015g/L、CaCl2·2H2O0.015g/L、MnSO4·H2O 0.01g/L、CoCl2·6H2O 0.02g/L、ZnSO4·7H2O 0.002g/L，余量为水。
4.根据权利要求3所述的利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法，其特征是：厌氧环境通过85％N2、10％H2和5％CO2混合气得到。
5.根据权利要求1或2所述的利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法，其特征是：
玉米皮水解液的最佳制备工艺为：将烘干后的玉米皮粉与0.4mol/L稀硫酸以1g:10ml混合，于110～120℃下水解6h，过滤离心后取上清，与活性炭以体积质量比100:1混合，于30℃脱色30min。
6.根据权利要求5所述的利用酪丁酸梭菌发酵玉米皮水解液生产丁酸的方法，其特征是：
所述纤维床生物反应器(3)为内置式纤维床反应器，具体制作方法是：裁剪大小完全相同的棉质纤维毛巾和不锈钢丝网，将作为织物层的棉质纤维毛巾铺放在等面积的不锈钢丝网上，二者共同以短边为轴垂直卷成圆筒状，形成织物层和钢丝网层交替分布的螺旋体，置于反应器柱内，为了使流体分布均匀，在玻璃柱底部填充弹簧，最后两端加盖密封，从而形成内置式纤维床反应器。
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