KR20190137060A - 1-단계 발효에 의한 (r)-3-하이드록시부티르산 또는 이의 염의 제조 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비병원성 미생물에 의한 1-단계 발효를 통해 (R)-3-하이드록시부티르산 또는 이의 염을 제조하는 방법에 관한 것이다. (R)-3-하이드록시부티르산의 발효는 특정 탄소원 및 질소원을 공급함으로써 수행되었다. 이러한 미생물은 글루탐산 박테리움 HR057 균주 또는 유전자 조작된 코린박테리움 글루타미큠의 한 종류를 포함한다.

Description

1-단계 발효에 의한 (R)-3-하이드록시부티르산 또는 이의 염의 제조
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은, 그 내용이 본원에 전체로서 참조로서 포함되어 있는 미국 특허출원 제62/481,476호(2017년 4월 4일 출원)에 대한 우선권을 주장하고 있다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 생물공학 분야, 구체적으로 미생물 발효에 의해 (R)-3-하이드록시부티르산 및 이의 염을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다.
(R)-3-하이드록시부티레이트(3-HB)는 CAS No. 625-72-9인 광학 키랄 화합물이다. (R)-3-하이드록시부티르산은 포유동물의 간에서 장쇄 지방산 대사에 의해 생산된다. 이는 혈장 및 말초 조직에서는 주요 케톤으로서 존재하고, 체내 대부분의 조직에서는 에너지원으로서 사용될 수 있다.
(R)-3-하이드록시부티르산은 다수의 질환을 치료함에 있어서뿐만 아니라 영양 기능에도 긍정적인 효과를 보인다. (R)-3-하이드록시부티르산은, 예를 들어 케톤 수준 상승으로 말미암는 다수의 질환(예컨대 뇌전증 및 근육간대경련을 비롯한 신경 장애와, 알츠하이머(Alzheimer)병 및 치매를 비롯한 신경퇴행성 질환)을 치료하는데 사용될 수 있고; 코엔자임 Q를 산화함으로써 유리 라디칼에 의한 손상(예컨대 허혈증)을 줄일 수 있으며; 훈련 효율 및 운동 능력을 개선함으로써 부적절한 지탱(inadequate support), 협심증, 심근경색 등의 치료를 달성하기 위해 대사 효율을 증진시킬 수 있고; 또한 암 관련 질환, 예컨대 뇌암(성상세포종 등)을 치료하는데 사용될 수 있다. 게다가 (R)-3-하이드록시부티르산은 글루코스 대사 장애(예컨대 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 저혈당 케톤병 등)의 치료에서 우수한 효과를 보인다. (R)-3-하이드록시부티르산은 골감소증(뼈감소증), 골다공증, 중증 골다공증 및 관련 골절을 억제하는데 사용될 수 있다. 이러한 기능과 치료 효과 및 영양학적 효과를 바탕으로 하였을 때, (R)-3-하이드록시부티르산 및 이의 염은 건강상 및 의료적 가치가 큰 식품 첨가물 및 약물로서 사용될 수 있다.
(R)-3-하이드록시부티르산은 주로 화학 방법에 의해 제조되어 왔다. 이는 직접적인 화학적 합성으로부터 제조될 수 있거나, 또는 폴리-3-하이드록시부티레이트를 폴리-3-하이드록시부티르산 해중합효소로 효소 분해함으로써 제조될 수 있다. (R)-3-하이드록시부티르산의 화학적 합성은 고온, 고압 및 값 고가의 키랄 금속 촉매를 필요로 한다. 폴리-3-하이드록시부티르산의 효소 분해 방법은 다량의 유기 용매와 출발 물질로서 매우 순수한 폴리-3-하이드록시부티레이트를 필요로 한다. 오랜 반응 시간 이외에도, 반응 후 생성물의 라세미화를 조절하는 것은 어려운 일이다. 게다가 이 방법은 비용이 많이 들고 효율이 낮기 때문에, 실험실에서는 산업적 규모의 상업화에 대한 매우 까다로운 요구조건을 충족시키기 위하여 더욱 철저한 최적화가 이루어져야 한다.
현재 상업적으로 이용 가능한 3-하이드록시부티르산 대부분은, (R)-3-하이드록시부티르산 대 (S)-3-하이드록시부티르산의 비가 약 1:1인 라세미 혼합물이다. 비록 연구가, (S)-3-하이드록시부티르산이 생리학적 활성을 보이지 않지만, 라세미 3-하이드록시부티르산과 이의 염, 특히 나트륨 염은 여전히 주력 상품으로서의 위치를 점유하고 있으며, 대부분의 소비자에 의해 인정되고 있다. 단일 광학 (R)-3-하이드록시부티르산 및 이의 염은 라세미 3-하이드록시부티르산 및 이의 염을 대체하면서 앞으로 대중에게 각광받게 될 것으로 예상된다.
일반적으로, 천연 화합물 또는 생물학적 화합물은 화학적으로 제조된 화합물보다 더 안전하다(그리고 무독성이다). 대중은 약, 식품 및 화장품 성분의 공급원의 "천연" 또는 "생물학적" 특징을 선호한다. 약, 식품 및 화장품 제조업자들은 마케팅의 목적으로 약, 식품 및 화장품을 제조함에 있어서 화학적 방법이 아닌 생물학적 방법을 사용하고자 하는 의지가 강하다. 그러므로 주로 사용되고 있는 방법인 화학적 방법 대신에 생물학적 방법으로 (R)-3-하이드록시부티르산을 제조하고자 하는 목표가 있어 왔다.
본 발명자들은 생물학적 방법으로 "안전하고 무독성인" (R)-3-하이드록시부티르산을 제조하고자 다양한 생물학적 방법들을 연구하여 예상외로 숙주로서의 비병원성 미생물에 의한 발표 절차에 의해 특히 효율적인 1-단계 공정으로 (R)-3-하이드록시부티르산을 생산할 수 있다는 것을 발견하였다. 최적으로 변형된 유기체를유전 공학 기술로 스크리닝하여 선택하고, 이로써 (R)-3-하이드록시부티르산의 주요 대사 경로와 연관된 유전자 발현을 향상시키고, 분지형 대사 경로는 감소시켰다. 그 결과, 발효 공정으로 (R)-3-하이드록시부티르산을 효과적으로 농축할 수 있어, 산업적 규모로의 광범위한 응용 가능성을 갖게 되었다.
그러므로 일 양태에서, 본 발명은 (R)-3-하이드록시부티르산을 효율적으로(예를 들어 1-단계 방법으로) 생산하기 위한 생물학적 방법을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 식품 등급의 (R)-3-하이드록시부티르산 및 이의 염을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 시장의 요구를 충족시켜줄 식품 등급의 라세미 3-하이드록시부티르산 및 이의 염을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 발효 배지를 발효시켜 (R)-3-하이드록시부티르산을 생산할 수 있는 세균을 추가로 제공한다.
특히 본 발명의 일 양태는 발효 액체배지(fermentation broth)를 비병원성 미생물로 발효시키는 단계를 포함하는, (R)-3-하이드록시부티르산을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법에서, 발효 액체배지는 탄소원과 질소원, 그리고 비병원성 미생물에 의해 과발현되는 효소를 포함하는데, 상기 탄소원과 질소원은 비병원성 미생물에 의한 1-단계 발효에 의해 (R)-3-하이드록시부티르산으로 직접 전환되고, 이러한 (R)-3-하이드록시부티르산은 발효 중 분비된 후 발효 액체배지로부터 회수되며, 상기 비병원성 미생물은 코린박테리움 글루타미큠(Corynebacterium glutamicum), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 디피실레(Brevibacterium difficile), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) 및 브레비박테리움 브레베(Brevibacterium breve)로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 비병원성 미생물은 하기와 같은 생물변형 능력, 즉 피루브산 및 코엔자임 A의 아세틸-CoA로의 전환 능력, 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환 능력, 아세토아세틸-CoA의 아세토아세트산으로의 전환 능력, 및 아세토아세트산의 (R)-3-하이드록시부티르산으로의 전환 능력을 갖는다.
일부 구현예에서, 비병원성 미생물에 의해 과발현된 효소는 숙시닐-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소 및 3-HB 탈수소효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 미생물은 숙시닐-CoA 전이효소와 3-HB 탈수소효소를 과발현한다.
일부 구현예에서, 비병원성 미생물은 코린박테리움 글루타미큠, 글루탐산 박테리움 HR057, 바실러스 서브틸리스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀, 브레비박테리움 디피실레, 브레비박테리움 플라붐 또는 브레비박테리움 브레베를 포함한다. 일부 바람직한 구현예에서, 미생물은 코린박테리움 글루타미큠 또는 글루탐산 박테리움 HR057을 포함한다. 더욱 바람직한 일부 구현예에서, 미생물은 코린박테리움 글루타미큠(예컨대 중국 일반 미생물 배양 보존 센터(China General Microbiological Culture Collection Center)에 승인 번호 CGMCC No. 13111로 기탁된 미생물)이다.
일부 구현예에서, 탄소원은 글루코스, 수크로스, 말토스, 당밀, 전분 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함한다. 일부 다른 구현예에서, 질소원은 유기 질소원과 무기 질소원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함한다. 적합한 유기 질소원의 예로서는 옥수수 침지액, 겨 가수분해생성물, 대두 묵 가수분해생성물, 효모 추출물, 효모 분말, 펩톤 및 우레아를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며; 적합한 무기 질소원의 예로서는 황산암모늄, 질산암모늄 및 수성 암모니아를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 (R)-3-하이드록시부티르산은 세균의 내독소를 함유하지 않으며, 순도가 95% 이상이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 (R)-3-하이드록시부티르산은 (R)-3-하이드록시부티레이트 나트륨 염, (R)-3-하이드록시부티레이트 칼륨 염, (R)-3-하이드록시부티레이트 마그네슘 염 또는 (R)-3-하이드록시부티레이트 칼슘 염의 형태이다.
본 발명의 또 다른 양태는 본 발명의 방법에 따라 제조된 (R)-3-하이드록시부티르산 또는 (R)-3-하이드록시부티레이트 염의 라세미화 처리에 의해 제조된 라세미 3-하이드록시부티르산을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 코린박테리움 글루타미큠, 글루탐산 박테리움 HR057, 바실러스 서브틸리스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀, 브레비박테리움 디피실레, 브레비박테리움 플라붐 및 브레비박테리움 브레베로 이루어진 군으로부터 선택된 비병원성 미생물을 제공한다.
일부 구현예에서, 비병원성 미생물은 코린박테리움 글루타미큠 균주 또는 글루탐산 박테리움 HR057 균주이다. 예를 들어, 코린박테리움 글루타미큠 균주는 중국 일반 미생물 배양 보존 센터에 승인 번호 CGMCC No. 13111로 기탁되어 있는 것이다.
일부 바람직한 구현예에서, 비병원성 미생물은 본 발명의 1-단계 발효 공정으로 (R)-3-하이드록시부티르산을 생산할 수 있다.
본 발명은 하기의 기술 계획을 포함한다:
(R)-3-하이드록시부티르산의 발효는 비병원성 미생물을 사용하여 수행하며, 상기 비병원성 미생물은 탄소원과 질소원을 (R)-3-하이드록시부티르산으로 직접 전환시키며, 상기 (R)-3-하이드록시부티르산은 발효 액체배지로 분비되어 직접 회수할 수 있다. 상기 미생물은 코린박테리움 글루타미큠, 바실러스 서브틸리스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀, 브레비박테리움 디피실레, 브레비박테리움 플라붐 및 브레비박테리움 브레베로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 이러한 미생물은 하기와 같은 생물변형 기능, 즉 피루브산 및 코엔자임 A의 아세틸-CoA로의 전환 기능; 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환 기능; 아세토아세틸-CoA의 아세토아세트산으로의 전환 기능; 및 이후 아세토아세트산의 (R)-3-하이드록시부티르산으로의 전환 기능을 갖는다.
바람직하게, 상기 미생물은 숙시닐-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소 및 3-HB 탈수소효소(BDH)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 과발현시킨다.
더욱 바람직하게, 상기 미생물은 숙시닐-CoA 전이효소 또는 3-HB 탈수소효소를 과발현시킨다.
바람직하게, 상기 미생물은 β-케토티올라제의 발현을 억제하거나 하향 조절시킨다.
바람직한 구현예에서, 상기 미생물은 코린박테리움 글루타미큠이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 코린박테리움 글루타미큠은 중국 일반 미생물 배양 보존 센터에 승인 번호 CGMCC No. 13111로 기탁되어 있다.
발효 공정에서는 상이한 미생물을 위한 다른 배지가 사용될 수 있다. 탄소원은 글루코스, 수크로스, 말토스, 당밀, 전분 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 유기 또는 무기 질소원이 발효 배지에 사용될 수 있다. 유기 질소원은 옥수수 침지액, 겨 가수분해생성물, 대두 묵 가수분해생성물, 효모 추출물, 효모 가루, 펩톤 및 우레아로 이루어진 군으로부터 유래할 수 있고; 무기 질소원은 황산암모늄, 질산암모늄 및 수성 암모니아로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 발효 배지는 코린박테리움 글루타미큠이 사용되는 경우 글루코스 75 g/L, 옥수수 침지액 25 g/L 내지 30 g/L, (NH4)2SO4 20 g/L, KH2PO4 1.5 g/L, MgSO4·7H2O 0.5g/L, 우레아 1.0 g/L, 히스티딘 30 mg/L, 당밀 25 g/L, 바이오틴 100 μg/L 및 소포제 0.2 g/L를 포함한다.
회분식 공급 발효가 수행되는 경우, 공급 배지는 황산암모늄 500 g/L 및 글루코스 650 g/L를 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 발효 방법에 의해 제조된 (R)-3-하이드록시부티르산의 순도는 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 또는 심지어 99%를 초과해야 한다.
이렇게 제조된 순수 (R)-3-하이드록시부티르산은 세균 내독소를 함유하지 않으며, 화학적 냄새, 예컨대 쓴맛이 없다.
(R)-3-하이드록시부티르산은 염기를 갖는 염을 형성하는 산이다. 대안적으로, 본 발명에 의해 제조된 (R)-3-하이드록시부티르산은 염, 예컨대 나트륨 염, 칼륨 염, 마그네슘 염 또는 칼슘 염의 형태, 바람직하게는 나트륨 염의 형태로 존재할 수 있다. 이러한 염은 모두 광학적으로 활성 화합물일 수 있다.
라세미 3-하이드록시부티르산과 이의 나트륨 염은 통상적으로 식품 제조업자, 제약업자 및 소비자가 채택하고 있으므로, (R)-3-하이드록시부티르산과 이의 염을 라세미 처리하여, 라세미 3-하이드록시부티르산과 이의 염을 제조할 수 있다. 예를 들어, 알칼리 용액, 예컨대 수산화나트륨 용액에서 (R)-3-하이드록시부티르산을 특정 시간 동안 가열함으로써 라세미화를 획득할 수 있다.
라세미 3-하이드록시부티레이트 염은 3-하이드록시부티레이트 나트륨, 3-하이드록시부티레이트 칼륨, 3-하이드록시부티레이트 마그네슘 또는 3-하이드록시부티레이트 칼슘일 수 있다.
본 발명에 의해 제조된 (R)-3-하이드록시부티르산과 이의 염은 세균 내독소와 독성 화학물질을 함유하지 않으므로, 식품 안전성이 보장된다. 또한, (R)-3-하이드록시부티르산은 화학 잔류물 또는 화학 반응 불순물이 없고, 화학적 냄새, 예컨대 쓴맛도 없으므로, 제약품 및 건강 제품을 제조하는데 직접 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 조작 미생물은 발효 공정 중 발효 액체배지에 (R)-3-하이드록시부티르산을 효과적으로 생산 및 농축시킬 수 있고, 가공 처리(downstream process)에 의해 식품 등급(R) 수준으로 등급을 올릴 수 있으며, 이로 인해 광범위한 산업적 응용 가능성을 갖는다.
코린박테리움 글루타미큠은 (R)-3-하이드록시부티르산을 고수율로 생산하도록 조작되었다. 이러한 미생물 균주는 중국 100101 베이징시 차오양구 베이징 웨스트 로드 1번가 3번 빌딩인 중국과학원 미생물 연구소에 소재하는 중국 일반 미생물 배양 보존 센터(www.cgmee.net)에 2016년 10월 14일 승인 번호 CGMCC No. 13111로 기탁되었다(the accession number CGMCC No. 13111 on October 14, 2016, at China General Microbiological Culture Collection Center, located in Institution of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Building 3, No. 1 Beicheng West Road, Chaoyang District, Beijing, China 100101 (www.cgmee.net)).
여기에 사용되는 "1-단계 발효"라는 용어는 하나 이상의 발효제(예컨대, 미생물)를 발효 배지에 첨가하는 단계를 포함하는 발효 공정을 말하며, 상기 발효 배지를 발효시켜 목적하는 생성물을 수득하며, 상기 발효 공정은 제2 라운드의 발효제를 첨가하지 않고, 제2 라운드의 발효 공정을 거칠 필요가 없다.
여기서 사용되는 "비병원성 미생물"이라는 용어는 일반적으로 또 다른 미생물, 유기체 또는 인간에게 질환 또는 해를 유발하지 않거나, 이를 사멸시키지 않는 미생물을 말한다.
본 발명은 특정 구현예로 추가로 상세하게 기술된다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것이지, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
본 발명에서 달리 제공, 기술 또는 정의되지 않는 한, 예컨대 다수 성분의 첨가량, 함량 및 농도는 질량 백분율로 나타낸다.
본 발명에 제공된 구현예들에서, 실온이란 달리 제공, 기술 또는 정의되지 않는 한, 기본적으로 15℃ 내지 30℃를 나타낸다.
본 발명에서, 발효에 의해 (R)-3-하이드록시부티르산을 생산할 수 있는 미생물 균주로서는 "코린박테리움 글루타미큠", "코린박테리움 글루타미큠 균주 CGMCC No. 13111", 또는 "글루탐산 박테리움 HR057"이 예시되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 미생물에 의한 (R)-3-하이드록시부티르산의 발효를 연구하여 소비자, 제약업자 및 식품 제조업자에게 (R)-3-하이드록시부티르산 및 이의 염, 3-하이드록시부티르산 및 이의 염의 "자생(naturalized)" 공급원 또는 "생체(biogenic)" 공급원을 제공하였다.
본 발명자들은 유전자 조작용 균주를 생성하기 위해 종을 스크리닝하고, 선택하였다. 잠재적으로 병원성 특징을 갖는 일반 균주, 예컨대 대장균(Escherichia coli)은 고려하지 않는다. 비병원성 미생물을 선택하고, 코린박테리움 글루타미큠, 바실러스 서브틸리스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀, 브레비박테리움 디피실레, 브레비박테리움 브레베 및 브레비박테리움 브레비카와 같은 발효 균주로서 비병원성 미생물을 유전자 조작하였다. 발효에 의해 (R)-3-하이드록시부티르산을 생산할 수 있는 몇몇 균주를 스크리닝을 통해 획득하였다. 대부분의 사람에게 해를 줄 수 있는 내독소는 발효 중 전혀 생산되지 않았다. 따라서 무독성이면서, 무해한 것으로 간주된다.
발효 중 (R)-3-하이드록시부티르산의 수율을 높이기 위해서는 몇몇 매개변수, 예컨대 용존 산소량, 온도, pH 등을 조정하고 조절하는 것이 필요하다.
상수 dO2는 발효 도중 15% 내지 25%로 조절된다. 발효는 하기와 같은 조건에서 실행될 수 있다: 약 1 vvm의 공기 흐름(여기서, vvm은 탱크 내 분당 통기량 대 액체의 실제 부피의 비로서, 예를 들어 발효 액체배지 30 리터가 담긴 발효조의 경우 1 vvm은 30 L/분과 같고, 발효 액체배지 5 리터가 담긴 발효조의 경우 1 vvm은 5 L/분과 같음).
바람직하게, 온도는 발효의 초기 단계 중에는 30℃ 내지 32℃로 우선 조절되고, 이후 발효의 이후 단계에서는 34℃ 내지 37℃(즉 (R)-3-하이드록시부티르산의 미생물에 의한 합성 및 분비를 촉진하는 온도)로 올린다.
pH는 일반적으로 발효의 초기 단계 중에는 pH 6.0 내지 8.0, 바람직하게 pH 6.5 내지 7.0으로 조절된다. 이후 발효의 이후 단계에서의 pH는 6.8 내지 7.0으로 조정될 수 있으며, 이는 발효 액체배지로부터의 (R)-3-하이드록시부티르산의 합성과 배출을 촉진하는 pH이다.
상기 "발효의 이후 단계"라는 용어는 미생물 성장의 지수 단계로부터 정지 단계까지를 나타낸다. 예를 들어, OD600nm 값으로 세포 밀도가 모니터링되는 경우에는 OD600nm 값은 더 이상 증가하지 않으며, 감소하는 경향을 보인다.
잔당(residual sugar)은 발효 공정 중에 1.0% 내지 3.0%, 보다 정확하게는 1.5% 내지 2.5%로 조절된다.
발효가 종료된 후, 발효 액체배지는 회수되어야 하고, 이러한 발효 액체배지로부터 (R)-3-하이드록시부티르산을 추출한다. 예를 들어, 발효 액체배지의 상청액은 원심분리로 수득한다. 필요하다면, 상기 상청액을 농축하고; (R)-3-하이드록시부티르산은 정제 및 건조와 같은 후처리에 의해 분리한다.
발효 배지 중 세포 및 거대분자는 여과(예컨대, 한외여과, 나노여과 등)에 의해 제거할 수 있다. (R)-3-하이드록시부티르산을 분리하기 위해, 필요하다면 농축 여과와, 기타 후가공 방법, 예컨대 건조, 정제 및 기타 방법이 사용될 수 있다. 대안적으로, (R)-3-하이드록시부티르산은 발효 액체배지의 상청액을 수득하는 원심분리에 의해 분리될 수 있으며, 이후 거대분자를 제거하기 위한 한외여과, 나노여과 및 기타 방법, 또는 필요하다면 농축 여과를 수행하고, 이후에는 건조, 정제 및 기타 후가공 방법을 수행할 수 있다.
(R)-3-하이드록시부티레이트, 예컨대 나트륨 염, 칼륨 염, 마그네슘 염, 칼슘 염을 제조하기 위해, 동량의 (R)-3-하이드록시부티르산을 상응하는 염기 또는 금속 산화물, 예컨대 수산화나트륨과 반응시킨다. 반응 온도는 라세미 반응이 가능한 많이 일어나지 않을 수 있는 온도인 30℃ 이하, 바람직하게 25℃ 이하, 더욱 바람직하게 20℃ 이하로 조절된다.
전체 제조 방법이 유기 용매를 필요로 하지 않거나 이를 수반하지 않으므로, 생성물인 (R)-3-하이드록시부티르산으로부터는 쓴맛과 같은 화학적 냄새가 검출되지 않고, 이로 인해 이러한 (R)-3-하이드록시부티르산은 제약품 및 건강 관리 제품을 제조하는데 직접 사용될 수 있다.
실시예 1: 전배양 및 발효
-80℃에 보관되었던 CGMCC No.13111의 글리세롤 보존액을 해동하여, 500 mL 종자 배지(seed medium)(글루코스 75 g/L, 옥수수 침지액 25 g/L 내지 30 g/L, (NH4)2SO4 20 g/L, KH2PO4 1.5 g/L, MgSO4·7H2O 0.5 g/L, 우레아 1.0 g/L, 히스티딘 30 mg/L, 당밀 25 g/L, 바이오틴 100 μg/L, pH 7.0)가 담긴 5000 mL들이 플라스크에 접종하고, 18시간 동안 30℃에서 배양하였다. OD가 0.4 내지 0.5에 이르렀을 때, 종자 배양액의 배양을 종료하였다.
종자 배양액 500 mL를 배지 5 리터로 채워진 7 리터들이 발효조에 접종하였다. 발효 배지의 조성은 상기 기술된 종자 배지의 조성과 동일하였으며, pH는 살균후 6.4 내지 6.7로 조절하였다. 공급 배지에는 황산암모늄 500 g/L 및 글루코스 650g/L가 포함되었다. 발효 온도는 30℃로 설정하였으며, 탱크내 압력은 0.05 Mpa로 유지하였고, 초기 통기율은 1 vvm이었다. 교반 속도는 600 rpm이었다. 발효시 pH는 약 pH 6.5였다.
발효 이후 단계의 pH는 6.7로 조절하였고, 온도는 35℃로 상승시켰다. 용존 산소 상수(dO2)는 통기 및 교반 속도를 조정함으로써 15% 내지 25%로 조절하였다. 잔당 수준을 조절하기 위해, 당의 원래 농도를 약 3.0%로 떨어뜨린 채 당을 천천히 공급하여, 잔당 농도를 1.5% 내지 2.0%로 조절하였다. 72시간 경과 후 (R)-3-하이드록시부티르산은 11.8 g/L로 축적되었다.
실시예 2: 발효 액체배지의 분리 및 (R)-3-하이드록시부티르산의 추출
실시예 1에서 수득한 발효 액체배지 5.2 리터를 4500 rpm에서 원심분리하고, 세포는 폐기하였다. 상청액을 1% 규조토로 여과하였다. 1% 활성탄을 혼합한 다음 30분 동안 교반하여 투명한 여과액을 회수하였다.
나노여과 막을 통해 여과액을 농축한 다음, 이로부터 수득된 여과액을 732 양이온 교환 수지에 통과시켜 농축된 여과액 1000 g/L를 얻었다. 농축된 수집물은 유질이고, 이를 뜨거운 상태로 수집하여 (R)-3-하이드록시부티르산 56.8 g을 수율 92.5%로 획득하였다. (R)-3-하이드록시부티르산의 순도를 고성능 액체 크로마토그래피로 측정하였다. 크로마토그래피 컬럼은 Shim-팩 Vp-ODSC18 컬럼(150 L × 4.6)이다. 이동상은 15:85(v/v)의 아세토니트릴:물로 구성되며, UV 검출 파장은 210 nm이고, 주입 부피는 20 μL이며, 유속은 1 mL/분이고, 컬럼 온도는 10℃로 하였다. (R)-3-하이드록시부티르산의 순도는 98%였고, 특정 광학 값[α] D20은 -25°(C = 6%, H2O)였다.
실시예 3: (R)-3-하이드록시부티레이트 나트륨의 제조
실시예 2에서 수득한 (R)-3-하이드록시부티르산 5 g과 동량의 2.0 N 수산화나트륨 용액을 25℃ 이하에서 혼합하여 중화 반응을 수행하였다. 회전 농축 후 2시간 동안 방치한 다음, 흡인 여과로 수집하고, 60℃에서 건조하여 최종적으로 (R)-3-하이드록시부티레이트 나트륨 분말 4.9 g을 수율 81%로 수득하였다. 상기 염의 용융점은 152℃였고, 특정 광학 값[α] D20은 -14.1°(C = 10%, H2O)였다.
실시예 4: (R)-3-하이드록시부티르산의 라세미화
(R)-3-하이드록시부티르산 10 g을 2.0 N 수산화나트륨 용액 100 mL에 천천히 첨가한 다음, 혼합물을 4 시간 동안 60℃로 가열하였다. 생성물의 광학 값은 실온에서 0°였다. 염산을 첨가하여 혼합물의 pH를 7.0으로 조정함으로써 중화 반응을 수행하였다. 고체가 관찰될 때까지 회전 증발을 수행한 다음, 2 시간 동안 방치하고 나서 여과함으로써 3-하이드록시부티레이트 나트륨 분말 10.3 g을 수율 85%로 수득하였다. 결과는 라세미 3-하이드록시부티레이트가 수득되었음을 보여주었다.
요약하면, 본 발명은 유전자 변형으로 조작된 코린박테리움 글루타미큠이 (R)-3-하이드록시부티르산을 1-단계 공정으로 고 수율로 발효시킬 수 있고, 이로부터 얻어진 (R)-3-하이드록시부티르산은 안전하고 무독성인 식품 등급의 것임이 판명되었음을 개시하였다. 본 발명에 개시된 조작된 균주 및 제조 방법은 광범위한 산업적 응용 가능성을 갖는다.

Claims (20)

  1. (R)-3-하이드록시부티르산의 제조 방법으로서,
    상기 방법은 비병원성 미생물로 발효 액체배지를 발효시키는 단계를 포함하며,
    상기 발효 액체배지는 탄소원, 질소원 및 상기 비병원성 미생물에 의해 과발현되는 효소를 포함하고, 상기 탄소원 및 질소원은 상기 비병원성 미생물에 의한 1-단계 발효에 의해 (R)-3-하이드록시부티르산으로 직접 전환되며, 상기 (R)-3-하이드록시부티르산은 발효 중 분비된 후 발효 액체배지로부터 회수되고, 상기 비병원성 미생물은 코린박테리움 글루타미큠, 바실러스 서브틸리스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀, 브레비박테리움 디피실레, 브레비박테리움 플라붐 및 브레비박테리움 브레베로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    상기 비병원성 미생물은 하기와 같은 생물변형 능력를 갖는 방법:
    피루브산 및 코엔자임 A의 아세틸-CoA로의 전환 능력, 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 전환 능력, 아세토아세틸-CoA의 아세토아세트산으로의 전환 능력, 및 아세토아세트산의 (R)-3-하이드록시부티르산으로의 전환 능력.
  2. 제1항에 있어서, 비병원성 미생물에 의해 과발현되는 효소는 숙시닐-CoA 전이효소, 아세토아세틸-CoA 합성효소 및 3-HB 탈수소효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 미생물은 숙시닐-CoA 전이효소 및 3-HB 탈수소효소를 과발현하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 비병원성 미생물은 코린박테리움 글루타미큠, 글루탐산 박테리움 HR057, 바실러스 서브틸리스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀, 브레비박테리움 디피실레, 브레비박테리움 플라붐, 또는 브레비박테리움 브레베인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 코린박테리움 글루타미큠 또는 글루탐산 박테리움 HR057인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물은 코린박테리움 글루타미큠인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 코린박테리움 글루타미큠은 중국 일반 미생물 배양 보존 센터에 승인 번호 CGMCC No. 13111로 기탁되어 있는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 탄소원은 글루코스, 수크로스, 말토스, 당밀, 전분 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 질소원은 유기 질소원과 무기 질소원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 질소원은 옥수수 침지액, 겨 가수분해생성물, 대두 묵 가수분해생성물, 효모 추출물, 효모 분말, 펩톤 및 우레아로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 무기 질소원은 황산암모늄, 질산암모늄 및 수성 암모니아로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나를 포함하는 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, (R)-3-하이드록시부티르산은 세균 내독소를 함유하지 않고, 순도가 95% 이상인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, (R)-3-하이드록시부티르산은 (R)-3-하이드록시부티레이트 나트륨 염, (R)-3-하이드록시부티레이트 칼륨 염, (R)-3-하이드록시부티레이트 마그네슘 염 또는 (R)-3-하이드록시부티레이트 칼슘 염의 형태로 제조되는 방법.
  14. 제12항의 (R)-3-하이드록시부티르산의 라세미화 처리에 의해 제조된 라세미 3-하이드록시부티르산.
  15. 제13항의 (R)-3-하이드록시부티레이트 염의 라세미화 처리에 의해 제조된 라세미 3-하이드록시부티르산.
  16. 코린박테리움 글루타미큠, 글루탐산 박테리움 HR057, 바실러스 서브틸리스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀, 브레비박테리움 디피실레, 브레비박테리움 플라붐 및 브레비박테리움 브레베로 이루어진 군으로부터 선택된 비병원성 미생물.
  17. 제16항에 있어서, 비병원성 미생물은 코린박테리움 글루타미큠 균주 또는 글루탐산 박테리움 HR057 균주인 비병원성 미생물.
  18. 제17항에 있어서, 비병원성 미생물은 코린박테리움 글루타미큠 균주인 비병원성 미생물.
  19. 제18항에 있어서, 코린박테리움 글루타미큠 균주는 중국 일반 미생물 배양 보존 센터에 승인 번호 CGMCC No. 13111로 기탁되어 있는 것인 비병원성 미생물.
  20. 제16항에 있어서, 미생물은 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 1-단계 발효 공정으로 (R)-3-하이드록시부티르산을 생산할 수 있는 비병원성 미생물.
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