CN114395590A - 一种微生物发酵生产左旋多巴的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了通过微生物发酵生产左旋多巴的方法。该方法主要通过提高微生物中4‑羟苯乙酸3‑单加氧酶B(hpaB)的作用,以更高效率和更高产量生产左旋多巴。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产左旋多巴基因工程大肠杆菌菌株及其构建方法,以及使用该菌株发酵生产左旋多巴的方法。本发明还涉及用于从发酵过程中回收左旋多巴的方法。属于医药、食品和饲料领域。
背景技术
左旋多巴(L-DOPA),化学名称为:3-羟基-L-酪氨酸。中文同义词:L-3-(3,4-二羟基苯)丙氨酸;L-B-(3,4-二羟基苯)丙氨酸;L-β-(3,4-二羟基苯)丙氨酸;左多巴;3-(3,4-二羟苯)-L-丙氨酸;L-3-(3,4-二羟苯基)丙氨酸。左旋多巴是一种白色或类白色结晶性粉末,易溶于稀酸,微溶于水,不溶于乙醇、乙醚或氯仿,无臭,无味,在空气中变黑。
左旋多巴是生物体内一种重要的生物活性物质,是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。左旋多巴是治疗常见老年病--帕金森病的主要药物。据统计,普通人群帕金森病的发病率为0.1%,60岁以上老人的发病率为1%,80岁以上的发病率为2%。随着人口老龄化速度的加快,对左旋多巴的需求将不断增加。
60年代末,国外一些学者开始致力于微生物酶法合成左旋多巴的研究。70年代初,日本学者Yamada等对微生物酶法合成左旋多巴进行了深入的研究,通过菌种选育及发酵条件的优化于1993年在味之素公司投入工业化生产。国内学者也先后开展了微生物法合成左旋多巴的研究,但至今开展工业化的报道不多。虽然现在国内有多家制药厂生产左旋多巴及其药剂,但大都是来自植物中提取或化学合成。
目前,左旋多巴的生产有化学合成、从天然植物中提取以及微生物酶转化法三条主要途径,各条生产途径的概述如下:
1、化学合成L-DOPA
1911年人们首次利用3,4-碳酰二氧苯甲醛为原料化学合成多巴,后来人们还利用胡椒醛、香草醛、儿茶酚、酪氨酸来合成L-DOPA。国内还有人用D-麻黄碱拆分N-乙酰-3-(3,4-二甲氧基苯)-DL-丙氨酸来合成L-DOPA。虽用化学法合成多巴的途径有许多,但遇到一个主要的困难是合成出来的产品是D-型和L-型的混合物,将二者分开较困难,工艺复杂。由于L-DOPA会引起毒性反应,因此医学上需控制它的旋光度。
2、从植物中提取L-DOPA
植物中的天然DOPA都是L-型的。1913年就有人从蚕豆籽苗种豆荚中提取天然L-DOPA,1949年从野生植物藜豆中提取L-DOPA。国内于1972年从豆科植物藜豆种子中提取L-DOPA获得成功,1974年商品L-DOPA投放市场。目前主要从猫豆中提取。从植物中提取L-DOPA的缺点是受到原料来源的限制,产量小,质量以及产品收率低,生产成本高,产量不稳定。
3、利用微生物酶转化法合成L-DOPA
90年代初人们开始运用基因工程的手段获取酪氨酸酚解酶(TPL)的基因片段,然后连接到不同的载体中让其在宿主细胞中高效表达。Kurusu.Y等人构建了pGRY30-TPL1质粒,此质粒含有来自大肠杆菌的酪氨酸酚解酶(I)基因。后来有学者构建了pHTD I质粒,能高效地表达产生酪氨酸酚解酶;从C freundii中提取出TPL基因并构建质粒;对Erwiniaherbicola AJ2982的TPL基因克隆到E.coli中进行表达,再将培养的细胞转入多巴合成体系中,反应30h后,反应液中多巴含量为105mM(20.7mg/ml)。利用微生物酶生物转化法生产左旋多巴,较化学合成、猫豆提取方法,具有生产成本低、工艺相对比较简单等优点,但仍然存在起始原料用量大、原料残留的问题。
发明内容
本发明针对左旋多巴的代谢途径,采用新的遗传修饰方法改造微生物,并利用该微生物以更高效率和更高产量生产左旋多巴。
具体而言,本发明通过提高微生物中4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的作用,增加葡萄糖代谢流,大大提高L-DOPA发酵生产产量。
根据本发明的一个实施方案,本发明涉及一种通过微生物发酵生产左旋多巴的方法,该方法包括:
A)在发酵培养基中培养微生物,所述微生物包含至少一种能提高微生物中4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)作用的遗传修饰;和
B)收集从培养步骤A)中产生的左旋多巴。
在本发明中,提高微生物中4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)作用的遗传修饰选自a)微生物中4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的酶活性增加;和/或b)微生物中4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)被过量表达;
本领域技术人员可以理解,为提高微生物中4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的作用,可以通过筛选编码具有4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的酶活性增加的基因突变体来实现。筛选hpaB基因突变体可以通过易错PCR技术得到高频突变基因来完成。为提高微生物中hpaB的作用,也可以通过增加其基因拷贝数、更换比天然启动子有更高表达水平的启动子等方式过量表达hpaB来实现。
在具体的实施方案中,微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
在一个优选的实施方案中,微生物用至少一种包含编码4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的核酸序列的重组核酸分子转化。
在一个方面,编码4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的核酸序列含有至少一种增加4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的酶活性的遗传修饰;进一步优选,所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQ ID NO:3的下述位置处的取代中的一种或多种:第123位半胱氨酸被甘氨酸取代、第295位甘氨酸被天冬氨酸取代和第323位丝氨酸被脯氨酸取代;更优选,编码4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
在另一个方面,所述的4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约30%相同,优选至少约50%相同,进一步优选至少约70%相同,进一步优选至少约80%相同,更进一步优选至少约90%相同,最优选至少约95%相同的氨基酸序列,其中所述的4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)具有酶活性;进一步优选,所述的4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在另一个方面,重组核酸分子中编码4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的基因拷贝数增加。
在另一个方面,重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选,具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选,具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。
在另一个优选的实施方案中,微生物包括至少一种对编码4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的基因的内源性天然启动子的遗传修饰;优选,编码4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选,具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选,具有更高表达水平的启动子为trc启动子。
在本发明中,重组核酸分子转化微生物,选自游离型(即重组核酸分子被装入质粒中)和整合型(即重组核酸分子被整合到微生物的基因组中)。优选,重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。
在上述任意实施方案的一个方面中,所述重组核酸分子的表达是可诱导的,包括但不限于被乳糖诱导。例如,通过在培养液中添加乳糖等可实现被乳糖诱导表达。
本领域技术人员可以理解,本发明中可以使用本领域已知的各种常规发酵培养基。在一个方面中,发酵培养基中包含碳源。在另一个方面中,发酵培养基中包含氮源。在另一个方面中,发酵培养基中包含碳源和氮源。在另一个方面中,发酵培养基中包含碳源、氮源和无机盐。
本领域技术人员可以理解,本领域已知的各种碳源均可用于本发明,包括有机碳源和/或无机碳源。优选,碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或多种。优选,碳源的浓度维持在约0.1%-约5%。本领域技术人员可以理解,本领域已知的各种氮源均可用于本发明,包括有机氮源和/或无机氮源。优选,氮源选自氨水、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、硝酸钠、尿素、酵母浸膏、肉类浸膏、蛋白胨、鱼粉、豆粉、麦芽、玉米浆和棉籽粉中的一种或多种。
优选,本发明采用补料发酵法。根据本发明的一个方面,补糖液包含葡萄糖,优选,葡萄糖浓度为10%-85%(w/v),进一步优选,葡萄糖浓度为55%-75%(w/v)。
在优选的实施方案中,在约20℃-约45℃进行所述培养步骤,进一步优选,在约33℃-约37℃进行所述培养步骤。
在优选的实施方案中,在约pH4.5-约pH8.5进行所述培养步骤。进一步优选,在约pH6.7-pH7.2进行所述培养步骤。
本领域技术人员可以理解,本发明中可以使用本领域已知的各种常规方法收集左旋多巴。优选,可以从发酵培养基中的胞外产物中收集左旋多巴。进一步优选,该收集步骤包括选自如下的步骤:(a)从去除微生物的发酵液中沉淀左旋多巴;和/或(b)从去除微生物的发酵液中结晶左旋多巴。
根据本发明,收集步骤进一步包括将发酵液脱色的步骤。脱色步骤可以包括但不限于在对发酵液进行沉淀或结晶之前、在对发酵液进行一次或多次沉淀或结晶重溶解之后进行,脱色包括活性炭处理和/或色谱脱色。所述色谱脱色包括使所述发酵液与离子交换树脂接触的步骤,离子交换树脂包括但不限于阴离子交换树脂和/或阳离子交换树脂,例如使发酵液与阴离子和阳离子交换树脂的混合床接触。
在本发明中,微生物可以是任意的微生物(例如细菌、原生生物、藻类、真菌或其它微生物)。在优选的实施方案中,微生物包括但不限于细菌、酵母或真菌。优选,所述的微生物选自细菌或酵母。进一步优选,细菌包括但不限于选自埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)的属的细菌;更优选,细菌包括但不限于选自大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的种的细菌。进一步优选,酵母包括但不限于选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)和红法夫属(Phaffia)的酵母;更优选,酵母包括但不限于选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharo mycespombe)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)、加拿大毕赤酵母(Pichia canadensis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或红法夫酵母(Phaffia rohodozyma)。优选,所述的微生物为真菌;进一步优选,真菌包括但不限于选自曲霉属(Aspergillus)、犁头霉属(Absidia)、根霉属(Rhizopus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、脉孢霉属(Neurospora)或木霉属(Trichoderma)的属的真菌;更优选,真菌包括但不限于选自黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、米根霉(Rhizopus oryzae)、劳肯诺温斯金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、间型脉孢霉(Neurospora intermedia)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。特别优选的大肠杆菌菌株包括K-12、B和W,最优选K-12。尽管大肠杆菌作为优选的微生物且用作本发明各种实施方案的实例,但是应理解在本发明方法中可以使用产生左旋多巴且可以通过遗传修饰以提高左旋多巴产量的任意其它微生物。用于本发明的微生物也可以称作生产生物体。
在本发明中,术语左旋多巴化学名称为:3-羟基-L-酪氨酸。可以称作L-3-(3,4-二羟基苯)丙氨酸;L-B-(3,4-二羟基苯)丙氨酸;L-β-(3,4-二羟基苯)丙氨酸;左多巴;3-(3,4-二羟苯)-L-丙氨酸;L-3-(3,4-二羟苯基)丙氨酸。
术语提高微生物中酶的作用是指微生物中该酶的活性增加和/或该酶被过量表达,从而提高了微生物中由该酶所催化的底物生成产物的量。
术语降低微生物中酶的作用是指微生物中该酶的活性降低和/或该酶的表达减少,从而降低了微生物中由该酶所催化的底物生成产物的量。
术语酶活性增加是指酶催化一定化学反应的能力增加。其涵盖了在酶受产物抑制作用和酶对底物亲合力不变的情况下酶自身催化化学反应的能力增加,和/或由于酶受产物抑制作用降低导致和/或酶对底物亲合力增加所导致的酶催化化学反应的能力增加。术语酶受产物抑制作用降低是指催化反应的酶的活性受其终产物特异抑制作用而降低。术语酶对底物亲合力增加是指酶对所催化的底物的亲合力增加。
图1以大肠杆菌为例解释了本发明公开的用于大规模生产左旋多巴代谢途经中遗传修饰的主要方面。本领域技术人员可以理解,其它微生物具有类似的糖代谢途经,且在这类途经中基因和蛋白质具有类似的结构和功能。因此,本发明所讨论的除适用于大肠杆菌外同样适用于其它微生物且其它微生物显然包括在本发明中。
本领域中已知具有相同生物活性的酶可以具有不同的名称,这取决于该酶来源于什么样的微生物。下面是本文涉及的许多酶的可选名称和来自一些生物体的编码这类酶的具体基因名称。这些酶的名称可以互换使用或如果合适用于给定的序列或生物体,但本发明意图包括来自任意生物体的指定功能的酶。
本发明的有益效果在于:本发明证实可通过微生物引入4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)高效突变体,构建L-DOPA合成新途径,增加葡萄糖代谢流,大大提高L-DOPA发酵生产产量。
将本文引述或描述的各公开文献和参考文献的全部内容引入本文作为参考。
附图说明
图1为大肠杆菌中左旋多巴合成改造策略图。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明,而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明,实施例中使用的原料和试剂均为市售商品。
实施例1
本实施例描述大肠杆菌4-羟苯乙酸3-单加氧酶B基因的获得。
根据Pubmed公开的NCBI Reference Sequence:NC_012971.2:Escherichia coliBL21(DE3)野生型4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,核苷酸序列如SEQ ID N O:4所示)的核苷酸序列SEQ ID NO:4设计引物。
正向引物(T7hpaB-F)SEQ ID NO:5:
5’-GGGAATTCCATATGAAACCAGAAGATTTCCGC-3’,
反向引物(T7hpaB-R)SEQ ID NO:6:
5’-CGGAATTCATTATTTCAGCAGCTTATCCAGCAT-3’;其中,斜体字母部分分别为酶切位点NdeI和EcoRI。PCR反应在50μl总体系中进行,反应条件为:94℃变性5min;94℃变性30s,58℃退火1min,72℃延伸2min,共30个循环;72℃延伸10min。取5μl PCR扩增产物做琼脂糖凝胶电泳验证。目标产物大小约1.6kb。
实施例2
本实施例描述构建野生型4-羟苯乙酸3-单加氧酶B基因表达载体。
将实施例1中的PCR产物做琼脂糖凝胶电泳,按照胶回收试剂盒的说明回收目的片段。取100μl PCR产物经限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切消化后,与用NdeI和EcoRI内切酶消化的hpaC/pET-24a载体连接(hpaC为4-羟苯乙酸3-单加氧酶C,之前已插入pET-24a载体),连接产物混合物转化大肠杆菌Top10,挑20个克隆,用引物T7hpaB-F和T7hpaB-R做PCR鉴定。选择PCR鉴定阳性克隆进行序列测定,保存测序正确的载体,命名为:pET-hpaBC。
实施例3
本实施例描述易错PCR扩增大肠杆菌4-羟苯乙酸3-单加氧酶B基因。
利用Taq DNA聚合酶不具有3'-5'校对功能的性质,在高镁离子浓度(8mmol/L)和不同浓度dNTP的浓度下(其中dATP和dGTP浓度为1.5mmol/L,dTTP和dCTP浓度为3.0mmol/L),来控制随机突变的频率,向目的基因中引入随机突变,构建突变库。模板浓度A260值为1000ng/mL,酶浓度为5U/μL,引物浓度为100μM。
易错PCR反应体系(50μl):10×PCR反应缓冲液5μl,dNTP(2.5nM)5μl,MgCl25μl,正向引物(T7hpaB-F)1μl,反向引物(T7hpaB-R)1μl,DNA模板(实施例1的PCR产物)1μl,TaqDNA聚合酶0.5μl,ddH2O 31.5μl。
PCR程序:96℃预变性4min;94℃变性1min,56℃退火1min,75℃延伸2min,45个循环;最后75℃延伸15min。采用胶回收方法回收PCR产物。取5μl产物1%琼脂糖凝胶电泳检验,-20℃保存备用。
实施例4
本实施例描述构建4-羟苯乙酸3-单加氧酶B突变体库。
将实施例3中的PCR产物(DNA改组后的混合物)经限制性内切酶NdeI和EcoRI双酶切消化后,与用NdeI和EcoRI内切酶消化的pET-24a质粒进行连接反应,然后用连接产物混合物转化大肠杆菌BL21(DE3),获得大量克隆转化子,构建转化菌体突变库。
实施例5
本实施例描述筛选高酶活突变体。
从转化菌体突变库中,随机挑取突变克隆4000株,分别接种至含50μg/mL卡拉霉素(Kan)的5ml LB培养基中,37℃、150rpm培养,待OD600值达0.6-0.8,加入IPTG(终浓度1.0mmol/L),继续培养12h后,10000rpm,5mim离心收集菌体。弃上清后,在4℃下重悬于1mlPBS(pH值7.5,10mmol/L)溶液中,在冰浴条件下选取300V电压,超声3s间歇6s对其进行超声破碎10min,离心取上清作为酶粗提液,进行酶活测定。检测酶活性最高的菌株,并挑选其克隆,并提取质粒,命名为pET-hpaBCM。测序。该4-羟苯乙酸3-单加氧酶B突变体核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,对应的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。与野生型的4-羟苯乙酸3-单加氧酶B基因测序比对,该突变体基因较原基因发生了4处碱基点突变:367T/G,884G/A,967T/C,1311G/A,致氨基酸3处错义突变。本发明的4-羟苯乙酸3-单加氧酶B突变体发生改变的氨基酸序列为:C123G(第123位半胱氨酸变为甘氨酸),G295D(第295位甘氨酸变为天冬氨酸),S323P(第323位丝氨酸变为脯氨酸)。
4-羟苯乙酸3-单加氧酶的酶活检测:
以5ml反应体系为酶活测定体系,其中含500mmol/L L-酪氨酸、5mmol/L葡萄糖、100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)及100μl粗酶液。酶活反应在37℃水浴中进行,保温4h,然后将酶解液在70℃下10min终止反应。3000rpm离心10min,取上清液。HPLC测定L-DOPA含量。
HPLC检测条件如下:
色谱柱:Phenomenex C18柱(250mm×4.60mm,5μm);
流动相:0.1mol/L冰醋酸溶液-甲醇(95∶5);
流速:1.0mL/min;
波长:280nm;
进样量:20μL。
保留时间:4.6min。
酶活单位定义:在酶促反应条件下,每分钟产生相当于1μmol L-DOPA所需的酶量,定义为一个酶活力单位(IU)。
结果:最高突变体菌株的最高酶活为224.6IU/ml,野生型菌株的酶活为32.5IU/ml。
结果表明,通过易错PCR对hpaB进行改造,获得酶活力提高了6.9倍的突变株。
实施例6
本实施例描述突变体hpaBM的碱基优化。
对实施例5筛选到的最高酶活4-羟苯乙酸3-单加氧酶B突变体hpaBM,根据其氨基酸序列,使用Escherichia coli偏爱密码子进行碱基优化,碱基优化后的4-羟苯乙酸3-单加氧酶B基因序列,如SEQ ID NO:7所示。按碱基优化序列,合成4-羟苯乙酸3-单加氧酶B基因,并插入hpaC/pET24a质粒中,命名为pET-hpaBCM2。
实施例7
本实施例描述突变体hpaBM2诱导表达、纯化与应用。
将4-羟苯乙酸3-单加氧酶B突变体表达质粒pET-hpaBCM2转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞;挑取阳性克隆,分别接种于含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃振荡培养至约为0.6-0.8时,加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG,37℃诱导12h。接种上述转化后的大肠杆菌BL21(DE3)于1000mL LB培养基,待OD600值约达2.0时,诱导与上述相同。离心收集菌体,以50mmol/L、pH8.0Tris-HCl(含lmmol/L咪唑)缓冲液悬浮(湿菌体与缓冲液的比例为1g湿菌体:5mL缓冲液),在冰浴中以超声波破碎菌体,离心后收集上清,冻干、保存备用。
取L-酪氨酸100g,加入含5mmol/L葡萄糖、100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液1000L中,再加入1000IU 4-羟苯乙酸3-单加氧突变酶。37℃下进行酶解反应。在酶解开始后第1h、2h、3h、4h、5h取样,70℃下10min终止反应。3000rpm离心10min,取上清液。测定反应产物中L-DOPA含量。结果见表1。
表1反应产物中生成L-DOPA的量与转化率
反应时间 | L-DOPA(g/L) | 转化率(%) |
1 | 67.6 | 63.1% |
2 | 77.0 | 71.8% |
3 | 94.8 | 88.4% |
4 | 100.5 | 93.7% |
5 | 101.5 | 94.7% |
结果表明,4-羟苯乙酸3-单加氧酶B突变体hpaBM2对L-酪氨酸羟化反应4h可接近反应完全,产物为L-DOPA。
实施例8
本实施例描述突变体hpaBM2重组菌制备。
1、感受态制备
以先前构建的大肠杆菌工程菌种ZXDB-01为宿主菌,制备感受态细胞。首先,将保存于-20℃的ZXDB-01冻存菌液,按1:50-100接种于10ml LB液体培养基中,37℃,225rpm,振荡培养2-3小时。再将培养液加入到10ml离心管中,4000g×5min,弃去上清,用冰浴的0.1MCaCl2 5ml悬浮5min。最后,4000g×5min离心,弃去上清,用冰浴的0.1M CaCl25ml悬浮。-4℃静置12小时,自然沉降。
2、质粒转化
取自然沉降的菌体250μl,加入5μl pET-hpaBCM2质粒,-4℃,30min。然后,42℃水浴1.5min,加入SOC培养基0.7ml,30℃摇2小时。取0.2ml菌液,涂青霉素平板。30℃过夜(12-16小时)培养。挑单克隆,加入5ml LB液体培养基中培养,抽质粒鉴定。保存阳性菌种备用。得到重组菌pET-hpaBCM2,命名为:ZXDB-02。
3、重组菌ZXDB-02摇瓶发酵试验
1)发酵培养液制备
5×M9培养基配制:将在约800ml双蒸水(ddH2O)中加入64gNa2HPO4·7H2O、15gKH2PO4、2.5g NaCl、5.0g NH4Cl,溶解后,加水至1000ml。121℃灭菌30分钟。再分别配制1MMgSO4、1M CaCl2、20%葡萄糖,并单独灭菌。然后按表2配制M9培养液,其中,1000×微量元素溶液按表3配制。
表2 M9培养液成分
成分 | 用量(ml/L) |
5×M9 | 200 |
1M MgSO<sub>4</sub> | 2 |
1M CaCl<sub>2</sub> | 0.1 |
20%葡萄糖 | 20 |
1000×微量元素溶液 | 1 |
ddH<sub>2</sub>O | 至1000 |
pH | 6.9 |
表3 1000×微量元素溶液成分
成分 | 用量(g/L) |
CoCl<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O | 0.01 |
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O | 0.01 |
MnSO<sub>4</sub>·H<sub>2</sub>O | 0.033 |
Fe SO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.50 |
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O | 0.38 |
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> | 0.01 |
NaMoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O | 0.01 |
pH | 3 |
2)摇瓶发酵试验
分别挑取LB平板培养基上新鲜培养的重组菌ZXDB-02与对照亲本ZXDB-01单克隆菌株,接种于3ml的LB液体培养基试管(13×150mm)中,30℃,225rpm,培养约8小时。LB液体培养基成分:5g/l酵母粉,10g/l蛋白胨,10g/l NaCl。然后取种子培养液,3%接种于含50ml的发酵基础培养液(M9培养液)250ml摇瓶中,在发酵基础培养液按10g/L加入预先碱溶的L-酪氨酸。起始OD600约0.5,37℃下,225rpm培养,发酵周期72小时。在第24小时、48小时,用10MNaOH调节发酵液pH至7.0。根据发酵液糖耗情况,分次加入65%葡萄糖液维持葡萄糖浓度在10g/L。发酵结束,取1ml发酵液,离心。用HPLC法测定L-DOPA含量。
摇瓶发酵产量情况见表4。结果表明:对照亲本菌株ZXDB-01产量未检出,而重组菌ZXDB-02左旋多巴产量明显提高。
表4重组菌ZXDB-02摇瓶发酵左旋多巴产量
菌种 | 左旋多巴(g/L) |
重组菌ZXDB-02 | 8.9±0.5 |
对照亲本菌株ZXDB-01 | 未检出 |
实施例9
本实施例描述发酵产物L-DOPA提取与纯化。
1、将发酵液调酸,加热80℃,30min,菌体灭活。
2、陶瓷膜过滤,菌液分离。过滤液减压(21.3kPa)浓缩,析出结晶,在0-10℃静置过夜,过滤,得左旋多巴粗品。
3、粗品用1N盐酸溶解,加活性炭过滤,滤液加少量维生素C用2N氨水中和至pH3.5,析出大量结晶。0-10℃静置4h,过滤。
4、滤饼用含少量维生素C的蒸馏水洗2次,丙酮淋洗脱水1次。
5、60-70℃干燥,得左旋多巴。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 南京寿柏生物科技有限公司
<120> 一种微生物发酵生产左旋多巴的方法及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 520
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
Met Lys Pro Glu Asp Phe Arg Ala Ser Thr Gln Arg Pro Phe Thr Gly
1 5 10 15
Glu Glu Tyr Leu Lys Ser Leu Gln Asp Gly Arg Glu Ile Tyr Ile Tyr
20 25 30
Gly Glu Arg Val Lys Asp Val Thr Thr His Pro Ala Phe Arg Asn Ala
35 40 45
Ala Ala Ser Val Ala Gln Leu Tyr Asp Ala Leu His Lys Pro Glu Met
50 55 60
Gln Asp Ser Leu Cys Trp Asn Thr Asp Thr Gly Ser Gly Gly Tyr Thr
65 70 75 80
His Lys Phe Phe Arg Val Ala Lys Ser Ala Asp Asp Leu Arg Gln Gln
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Arg Asp Ala Ile Ala Glu Trp Ser Arg Leu Ser Tyr Gly Trp Met Gly
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Arg Thr Pro Asp Tyr Lys Ala Ala Phe Gly Gly Ala Leu Gly Ala Asn
115 120 125
Pro Gly Phe Tyr Gly Gln Phe Glu Gln Asn Ala Arg Asn Trp Tyr Thr
130 135 140
Arg Ile Gln Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Asn His Ala Ile Val Asn Pro
145 150 155 160
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165 170 175
Lys Leu Glu Lys Glu Thr Asp Ala Gly Ile Ile Val Ser Gly Ala Lys
180 185 190
Val Val Ala Thr Asn Ser Ala Leu Thr His Tyr Asn Met Ile Gly Phe
195 200 205
Gly Ser Ala Gln Val Met Gly Glu Asn Pro Asp Phe Ala Leu Met Phe
210 215 220
Val Ala Pro Met Asp Ala Asp Gly Val Lys Leu Ile Ser Arg Ala Ser
225 230 235 240
Tyr Glu Met Val Ala Gly Ala Thr Gly Ser Pro Tyr Asp Tyr Pro Leu
245 250 255
Ser Ser Arg Phe Asp Glu Asn Asp Ala Ile Leu Val Met Asp Asn Val
260 265 270
Leu Ile Pro Trp Glu Asn Val Leu Ile Tyr Arg Asp Phe Asp Arg Cys
275 280 285
Arg Arg Trp Thr Met Glu Asp Gly Phe Ala Arg Met Tyr Pro Leu Gln
290 295 300
Ala Cys Val Arg Leu Ala Val Lys Leu Asp Phe Ile Thr Ala Leu Leu
305 310 315 320
Lys Lys Pro Leu Glu Cys Thr Gly Thr Leu Glu Phe Arg Gly Val Gln
325 330 335
Ala Asp Leu Gly Glu Val Val Ala Trp Arg Asn Thr Phe Trp Ala Leu
340 345 350
Ser Asp Ser Met Cys Ser Glu Ala Thr Pro Trp Val Asn Gly Ala Tyr
355 360 365
Leu Pro Asp His Ala Ala Leu Gln Thr Tyr Arg Val Leu Ala Pro Met
370 375 380
Ala Tyr Ala Lys Ile Lys Asn Ile Ile Glu Arg Asn Val Thr Ser Gly
385 390 395 400
Leu Ile Tyr Leu Pro Ser Ser Ala Arg Asp Leu Asn Asn Pro Gln Ile
405 410 415
Asp Gln Tyr Leu Ala Lys Tyr Val Arg Gly Ser Asn Gly Met Asp His
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Val Gln Arg Ile Lys Ile Leu Lys Leu Met Trp Asp Ala Ile Gly Ser
435 440 445
Glu Phe Gly Gly Arg His Glu Leu Tyr Glu Ile Asn Tyr Ser Gly Ser
450 455 460
Gln Asp Glu Ile Arg Leu Gln Cys Leu Arg Gln Ala Gln Ser Ser Gly
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Asn Met Asp Lys Met Met Ala Met Val Asp Arg Cys Leu Ser Glu Tyr
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Asp Gln Asn Gly Trp Thr Val Pro His Leu His Asn Asn Asp Asp Ile
500 505 510
Asn Met Leu Asp Lys Leu Leu Lys
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<210> 2
<211> 1560
<212> DNA
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
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cataaattct tccgcgtggc gaaaagtgcc gacgacctgc gccagcaacg cgacgccatc 300
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actcactaca acatgattgg cttcggctcg gcacaagtga tgggcgaaaa cccggacttc 660
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gatgagaatg atgcgattct ggtgatggat aacgtgctga tcccatggga aaacgtactg 840
atctaccgcg atttcgatcg ctgccgtcgc tggacgatgg aagacggttt tgcccgtatg 900
tatccgctgc aagcctgtgt gcgcctggca gtgaaactag acttcattac ggcactgctg 960
aaaaaaccac tcgaatgtac cggcaccctg gagttccgtg gtgtgcaggc cgatctcggt 1020
gaagtggtgg cgtggcgcaa caccttctgg gcattgagtg actcgatgtg ttcagaagcg 1080
acaccatggg tcaacggtgc ttatttaccg gatcatgccg cactgcaaac ctatcgcgta 1140
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ctgatctatc tcccttccag tgcccgtgac ctgaacaatc cgcagatcga ccagtatctg 1260
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<211> 520
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<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 3
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165 170 175
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<400> 7
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Claims (14)
1.一种通过微生物发酵生产左旋多巴的方法,该方法包括:
A)在发酵培养基中培养微生物,所述微生物包含至少一种能提高微生物中4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)作用的遗传修饰;和
B)收集从培养步骤A)中产生的左旋多巴。
2.如权利要求1所述的方法,其中,提高微生物中4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)作用的遗传修饰选自a)微生物中4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的酶活性增加;和/或b)微生物中4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)被过量表达;
优选,微生物用至少一种包含至少一种能提高微生物中4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)作用的遗传修饰的重组核酸分子转化。
3.如权利要求2所述的方法,其中,微生物用至少一种包含编码4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的核酸序列的重组核酸分子转化;
优选,编码4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的核酸序列含有至少一种增加4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的酶活性的遗传修饰;进一步优选,所述遗传修饰包括在对应于氨基酸序列SEQ ID NO:3的下述位置处的取代中的一种或多种:第123位半胱氨酸被甘氨酸取代、第295位甘氨酸被天冬氨酸取代和第323位丝氨酸被脯氨酸取代;更优选,编码4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的核酸序列为SEQ ID NO:2;
优选,所述的4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)具有与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少约30%相同,优选至少约50%相同,进一步优选至少约70%相同,进一步优选至少约80%相同,更进一步优选至少约90%相同,最优选至少约95%相同的氨基酸序列,其中所述的4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)具有酶活性;进一步优选,所述的4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列;
进一步优选,重组核酸分子中编码4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的基因拷贝数增加;
进一步优选,重组核酸分子中包含内源性天然启动子或具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子;优选,具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;进一步优选,具有比内源性天然启动子更高表达水平的启动子为trc启动子。
4.如权利要求2所述的方法,其中,微生物包括至少一种对编码4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的基因的内源性天然启动子的遗传修饰;优选,编码4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的基因的内源性天然启动子被具有更高表达水平的启动子替换;进一步优选,具有更高表达水平的启动子选自HCE启动子、gap启动子、trc启动子、T7启动子;最优选,具有更高表达水平的启动子为trc启动子。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法,其中,重组核酸分子被装入质粒中或重组核酸分子被整合到微生物的基因组中。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中,所述重组核酸分子的表达是可诱导的;优选,所述重组核酸分子的表达可由乳糖诱导。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其中,所述培养步骤A)在约20℃-约45℃进行;优选,在约33℃-约37℃进行;
优选,所述培养步骤A)在约pH4.5-约pH8.5进行;优选在约pH6.7-约pH7.2进行;
优选,所述培养步骤A)采用常规发酵培养基;
进一步优选,发酵培养基中包含碳源;进一步优选,发酵培养基中包含氮源。进一步优选,发酵培养基中包含碳源和氮源;进一步优选,发酵培养基中包含碳源、氮源和无机盐;
更进一步优选,各种碳源包括有机碳源和/或无机碳源;优选,碳源选自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或多种;优选,碳源的浓度维持在约0.1%-约5%;更进一步优选,各种氮源包括有机氮源和/或无机氮源;优选,氮源选自氨水、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、硝酸钠、尿素、酵母浸膏、肉类浸膏、蛋白胨、鱼粉、豆粉、麦芽、玉米浆和棉籽粉中的一种或多种;
优选,所述培养步骤A)采用补料发酵法;
进一步优选,补糖液包含葡萄糖,优选,葡萄糖浓度为10%-85%(w/v),进一步优选,葡萄糖浓度为55%-75%(w/v)。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法,其中,所述收集步骤B)包括(a)从去除微生物的发酵液中沉淀左旋多巴;和/或(b)从去除微生物的发酵液中结晶左旋多巴;
优选,所述收集步骤B)进一步包括将发酵液脱色的步骤;进一步优选,所述脱色步骤在对发酵液进行沉淀或结晶之前、在对发酵液进行一次或多次沉淀或结晶重溶解之后进行;更优选,所述脱色步骤包括活性炭处理和/或色谱脱色。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法或者任一项所述的微生物,其中,所述微生物为细菌、酵母或真菌;
优选,所述的微生物选自细菌或酵母;
进一步优选,细菌选自埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)的属的细菌;进一步优选,细菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)的种的细菌;更优选,细菌为大肠杆菌;更进一步优选,大肠杆菌选自K-12、B和W菌株;最优选大肠杆菌为K-12菌株;
进一步优选,酵母选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、克鲁维酵母属(Kluveromyces)和红法夫属(Phaffia)的酵母;更优选,酵母包括但不限于选自酿酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、白色念珠菌(Candida albicans)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)、加拿大毕赤酵母(Pichia canadensis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)或红法夫酵母(Phaffia rohodozyma);
优选,所述的微生物为真菌;进一步优选,真菌选自曲霉属(Aspergillus)、犁头霉属(Absidia)、根霉属(Rhizopus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、脉孢霉属(Neurospora)或木霉属(Trichoderma)的属的真菌;更优选,真菌选自黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、米根霉(Rhizopus oryzae)、劳肯诺温斯金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、间型脉孢霉(Neurospora intermedia)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。
10.一种具有更高酶活性的4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB),所述酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
11.一种编码如权利要求10所述4-羟苯乙酸3-单加氧酶B(hpaB)的核酸分子,所述核酸分子具有SEQ ID NO:2所示的核酸序列。
12.一种包含如权利要求11所述核酸分子的载体。
13.一种包含如权利要求12所述载体的微生物。
14.一种基因组中包含如权利要求11所述核酸分子的微生物。
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