CN111500617A

CN111500617A - 合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法

Info

Publication number: CN111500617A
Application number: CN202010252783.8A
Authority: CN
Inventors: 程海荣; 邹亚文
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2020-04-01
Filing date: 2020-04-01
Publication date: 2020-08-07

Abstract

本发明公开了一种合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法。以能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母菌为合成底盘，将海藻糖合成酶基因构成表面展示基因表达盒并转化能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母，构成重组解脂耶氏酵母菌。然后以该重组酵母菌先发酵葡萄糖生成赤藓糖醇，分离酵母细胞用作全细胞催化剂一步转化麦芽糖生成海藻糖。转化结束后在转化液中加入氮源和无机盐，接种酿酒酵母分解转化液中的杂质得到高纯度海藻糖。由于该方法采用酵母全细胞转化，相对于破细胞纯化酶等工艺，不但减少了步骤，而且无酶制备成本。

Description

合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，涉及一种合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法；具体是利用解脂耶氏酵母表面展示海藻糖合成酶一步转化麦芽糖合成海藻糖的方法。

背景技术

海藻糖(Trehalose)由两分子α-葡萄糖通过α-1，1糖苷键连接，属于非还原性二糖(non-reducing disaccharide)，最早在十九世纪早期从黑麦麦角中发现的，后来在各种动植物，微生物细胞中均发现海藻糖的存在，尤其是在低含水量或者脱水的细胞中含量丰富。比如，在干燥的复活草(如鳞片卷柏Selaginella lepidophylla)、休眠的线虫(nematodes)、脱水面包酵母(baker’s yeast)、干燥的地衣植物中含量丰富(Elbein etal.New insights on trehalose:a multifunctional molecule.Glycobiology,13:17-27)，这些生物细胞中失去99％的水分仍能生存若干年，而当有水存在时能迅速恢复细胞活力。在脱水面包酵母中，海藻糖的含量占据细胞干重的10～15％左右。

海藻糖在细胞中的存在，除了作为能源储存外，更多的作为抵御外界不良环境的保护剂(protectant)，使得细胞中的大分子(如酶)在极端条件下(如高温、低pH、干燥、冷冻等)仍然具有活性，能维持细胞质中大分子的结构以及维持细胞膜的完整性(Ohtani andUsui.1994.Production of trehalose by fermentation and its application.FoodChem,2:91-95；Singer and Nas-Lindquist.1998.Multiple effects of trehalose onprotein folding in vitro and in vivo.Mol Cell,1:639-648)。由于没有还原基团，海藻糖与富含氨基酸的食品配料混合后在高温下不会发生美拉德反应，能良好的保持食品的风味。海藻糖还具有良好的持水性，能与失水细胞中残余的水牢固结合保护生物大分子的结构完整性(Belton and Gil.1994.IR and Raman spectroscopics studies of theinteraction of trehalose with hen egg white lysozyme.Biopolymers,34:957-961)。

由于海藻糖具有上述优良的生理生化特性，其在医药领域、食品领域以及化妆品领域都得到十分广泛的应用。

在医药领域常用于疫苗、血液制品、抗体的稳定剂，使疫苗在常温下以及冷冻的条件下同样具有稳定性，增加血液制品以及抗体在冷冻条件下的稳定性(Patent WO1996/022107)。海藻糖还可以和透明质酸配伍用于制备眼部用药传递系统以及润滑剂(中国发明专利200410036422.0，200410075549.3)，还可以制成关节腔内注射药剂，起到抗氧化和抗自由基的作用，改善炎症症状，为软骨修复提供所需要的糖分，加速软骨的修复(中国发明专利200610103472.5)。同时海藻糖还可以进行衍生化合成其它的药物，在防止肿瘤的侵袭以及转移具有显著的效果(中国发明专利201010246792.2，201110150999.4)。海藻糖的衍生物还可以用于制备皮肤外用剂，具有促进血液循环，保湿，吸收紫外线以及抗氧化的功效(Patent WO2004/071472,JP2004/001401)。

海藻糖由于具有低甜度、非还原性、抗干燥等作用，在食品领域有着广阔的应用前景。海藻糖的甜度相当于蔗糖的45％，口感柔和，能在小肠内被消化吸收，可作营养源。此外还具有抗腐蚀性，不生成引起龋齿的不溶性葡聚糖，不被口腔病原菌所利用，因此可以作为新型甜味剂，添加于奶粉、口香糖、巧克力、冰淇淋、糖果等食品中。由于海藻糖对酸、热都非常稳定，不具有还原性，在食品加工过程中不会产生美拉德反应，因此在食品加工过程中添加一定量德海藻糖，对于淀粉类食品可抑制淀粉的老化，延长食品的保质期；可抑制蛋白质的变性；对于肉类、油炸类等含脂肪多的食品。添加海藻糖可有效的抑制脂肪酸化，保持食品原有风味。

海藻糖由于具有优良的保湿性使其成为化妆品原料之一。用于皮肤化妆品如洗面奶中，可抑制皮肤干燥；用于唇膏、口腔清凉剂、口腔芳香剂中，可作为甜味剂、呈味改良剂及品质改良剂。无水海藻糖可用于护肤霜等中，作为磷脂及酶的脱水剂。

由于海藻糖在医药、食品、化妆品领域均具有十分重要的功效，而且新的功效正在不断的被开发应用，因此，如何更加经济的规模化制备就具有十分重要的价值。

最开始的海藻糖制备方法是从酿酒酵母细胞中提取得到(巴西发明专利Patent9303490,，日本发明专利JP7000190,JP7099988)。由于提取得率低，需要破细胞壁，步骤多，难以实际规模化制备。后来研究发现有些微生物含有海藻糖合成酶能够直接利用麦芽糖发生分子内重排合成海藻糖，此方法转化步骤少，将麦芽糖转化为海藻糖，所需能量较低、分离较为简便，适合规模化生产海藻糖。基于这种单酶体系转化麦芽糖合成海藻糖的原理，国内外许多学者申请了合成海藻糖的发明专利。中国发明专利(申请号201310112536.8，一种利用全细胞催化合成海藻糖的方法)描述了在大肠杆菌中表达海藻糖合成酶基因，并用经过表面活性剂渗透处理的全细胞转化麦芽糖合成海藻糖。该方法步骤与使用的试剂较多，比如需要采用抗生素筛选，使用诱导剂诱导，使用表面活性剂进行处理细胞，转化率也较低。这些限制条件使得该方法难以规模化采用。中国发明专利(申请号201310182033.8，一种利用固定化海藻糖合成酶生产海藻糖的方法)描述了一种采用来自恶臭假单胞菌、热带假丝酵母、玫瑰链霉菌或大肠杆菌的海藻糖合成酶，并将该酶固定来转化麦芽糖合成海藻糖。该方法同样存在步骤繁多的缺点(培养细胞，破壁，纯化酶，固定化酶等)。另外，采用麦芽糖为底物转化合成海藻糖，由于麦芽糖与海藻糖均属于二糖，反应液中存在较多的未反应完的麦芽糖(一般仍有20％以上的麦芽糖残留)，存在难以将二者分离或者分离困难。

目前工业化生产海藻糖主要是以酶转化法，采用大肠杆菌进行酶表达。表达的过程较为复杂，需要使用抗生素(如卡那霉素或者氨苄青霉素等)保持筛选压力，还需要使用诱导剂(如IPTG等)，另外还需要破壁大肠杆菌以释放海藻糖合成酶，在破壁的同时大肠杆菌的内毒素等有害物质也释放出来，同时大肠杆菌是致病微生物，不适合用于食品制备。虽然从大肠杆菌中可以纯化得到海藻糖合成酶，然后以纯酶进行转化麦芽糖合成海藻糖，也可以进行，但是纯化得到纯酶的成本太高。

因此，研究开发一种能够将麦芽糖高效转化为海藻糖的新的合成途径对于提高生产效率，降低生产成本具有十分重要的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的酶合成或细胞合成海藻糖的不足之处，提供一种合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，实现由麦芽糖生物合成高纯度海藻糖。本发明通过遗传工程将解脂耶氏酵母进行改良，使得该酵母能够合成海藻糖合成酶(Trehalosesynthase，TreS)并展示在细胞表面，进而能将麦芽糖合成海藻糖。在海藻糖转化液中加入酿酒酵母发酵培养，除去转化液中剩余的底物麦芽糖和副产物葡萄糖，分离纯化得到高纯度的海藻糖。

本发明所使用解脂耶氏酵母菌株为能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母，如解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica BLC13)CGMCC NO.7326(CN201310282059；Huiling Cheng etal.Identification,characterization of two NADPH-dependent erythrosereductases in the yeast Yarrowia lipolytica and improvement of erythritolproductivity using metabolic engineering.Microbial Cell Factories,2018,17:133.)以及CGMCC NO.18478(CN110878261A)等。将海藻糖合成酶展示在细胞表面，以全细胞作为酶催化剂催化麦芽糖合成海藻糖。这是第一次报道构建能够以麦芽糖为底物合成海藻糖的解脂耶氏酵母的方法，具有发明创造性。

本发明所使用的净化酵母是酿酒酵母，该酵母能在以麦芽糖和葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长，而不能在以海藻糖为唯一碳源的培养基上生长。在转化液中接种该净化酵母发酵培养，得到纯净的海藻糖。酿酒酵母来源广泛，而且是食品安全微生物，从葡萄等水果表面均可以分离得到。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，以能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母作为出发菌株，将海藻糖合成酶表面展示在该菌株表面获得重组菌株。

如，合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母可以是发明人之前提供的菌株CGMCC NO.7326以及CGMCC NO.18478等；然后将海藻糖合成酶基因表面展示表达框转入该酵母菌。因此该酵母含有海藻糖合成酶(Trehalose synthase gene,TreS)的编码序列。该酶的脱氧核糖核酸编码序列都已经公开，可以从公共GenBank数据库中免费得到。如来自嗜热嗜酸古菌Picroplilus torridus的海藻糖合成酶编码序列(TreS)也可以从GenBank数据库中免费得到(GenBank登录号AE017261)。该重组菌株为含有海藻糖合成酶基因的解脂耶氏酵母。

进一步的，所述构建方法包括如下步骤：

S1、设计海藻糖合成酶基因表面展示表达盒，并合成该基因表达盒；

S2、将合成的海藻糖基因表面展示表达盒转化能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母；

S3、筛选含有海藻糖基因表面展示表达盒的重组解脂耶氏酵母。

进一步的，所述海藻糖合成酶基因表面展示表达盒为含TreS编码序列的表达盒，包含同源臂DNA序列、启动子DNA序列、TreS基因编码序列、终止子DNA序列。

进一步的，所述海藻糖合成酶基因表面展示表达盒的序列如SEQ ID NO.1所示。

第二方面，本发明涉及上述方法构建得到的重组解脂耶氏酵母菌在合成海藻糖中的用途。

第三方面，本发明涉及利用上述方法构建得到的重组解脂耶氏酵母菌合成海藻糖的方法，所述方法包括如下步骤：

A1、将重组解脂耶氏酵母菌发酵葡萄糖合成赤藓糖醇；

A2、发酵结束后菌液分离得到含赤藓糖醇的发酵液以及酵母菌细胞；

A3、以该酵母菌细胞作为全细胞催化剂，转化麦芽糖合成海藻糖；

A4、在A3中的转化液中加入氮源和无机盐，接种酿酒酵母，发酵分解除海藻糖以外的杂质，或再加入糖化酶以分解未转化完的麦芽糖；

A5、从A4中分离纯化得到海藻糖。

进一步的，步骤A1具体为：将所述重组解脂耶氏酵母菌菌株培养于含碳源、氮源、无机盐以及水的培养基中，在pH值2.0～8.0，温度25～35℃条件下振荡或者搅拌发酵培养，合成赤藓糖醇。其中，发酵pH值为3.0～6.0，更优选为5.0；发酵初始温度为25～35℃，更优选28℃～32℃，最优选30℃。

进一步的，所述碳源为固体葡萄糖、葡萄糖母液中的一种或两种，碳源用量为50～350克/升；所述氮源为酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵、柠檬酸铵中的一种或几种的混合，氮源的用量为5～25克/升；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种，无机盐用量为0～2.5克/升。上述氮源用量为本领域常规用量，可根据实际需要进行选择；例如可以为：氮源添加量为0.2％～4％(质量体积百分比)，在此范围内根据需要进行调整。无机盐一般为微生物生长提供微量元素，用量很小。本发明中的无机盐用量为0.01克/升～2克/升，在此范围内根据需要进行调整。

更优选的，所述碳源用量为200～300克/升；所述氮源的用量为5～20克/升；所述无机盐用量为0.01～2克/升，更优选为0.005～2克/升。

步骤A2中，发酵结束后菌液分离得到含海藻糖合成酶的酵母细胞与发酵液，发酵液用来分离得到赤藓糖醇。

进一步的，步骤A3中，在所述酵母菌细胞中加入质量百分比浓度为10％～40％的麦芽糖水溶液，酵母细胞的加入量为1％-5％，在温度20～80℃，pH 3.0～8.0条件下振荡或搅拌进行转化得到含有海藻糖的转化液。

进一步的，步骤A3中，所述酵母细胞转化麦芽糖合成海藻糖包括如下步骤：

A31、在所述酵母细胞中加入质量百分比浓度为20％～40％的麦芽糖，在温度30～50℃，pH 3～8条件下振荡或搅拌进行转化。

A32、对转化液进行菌液分离，得到含海藻糖合成酶的酵母细胞与含有海藻糖的细胞转化液；

A33、步骤A32得到的所述含海藻糖合成酶的酵母细胞可重复进行步骤A31、A32。即，该分离得到的酵母细胞还可以作为酶催化剂，再次转化20％～40％的麦芽糖，生成海藻糖。细胞可以重复利用3～5次。

优选的，所述转化麦芽糖是在温度30～70℃，pH 4.0～8.0条件下进行的。优选转化温度为40～60℃；更优选为50～60℃。转化pH值优选为5.0～7.0；更优选为5.5～6.5。

进一步的，步骤A4中的酿酒酵母能利用麦芽糖以及葡萄糖而不能利用产物海藻糖。

进一步的，步骤A4中，所述酿酒酵母的接种量为1％-5％。(该接种量是相对于转化液和氮源和无机盐的总重。)

进一步的，步骤A4中，所述加入的氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵中的一种或几种的混合；所述加入的无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种。

进一步的，所述氮源的用量为5～25克/升；所述无机盐用量为0～2.5克/升。

进一步的，步骤A4中，所述分离纯化得到海藻糖，其方法为过滤除菌、浓缩，离子交换，再浓缩，脱色，结晶等常规步骤。

本发明中所述的能由麦芽糖合成高纯度海藻糖的(Yarrowia lipolytica)酵母菌株，即所述合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌，是通过以下方法构建的：

按照Yarrowia lipolytica密码子偏好性，合成含TreS编码序列的表达盒，并将该表达盒转化能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母出发菌株如Yarrowia lipolytica CGMCC7326等，在筛选培养基中筛选含有TreS编码序列的表达盒的酵母转化子并挑出单菌落克隆进行分子鉴定。

含海藻糖合成酶基因的表面展示表达框是采用如下方法构建并合成的：

含海藻糖合成酶基因(TreS)编码序列的表达盒包含同源臂DNA序列、启动子DNA序列、TreS基因编码序列、终止子DNA序列。同源臂DNA序列可以为来自Yarrowia lipolytica酵母的URA3编码的序列，也可以为LEU2编码的序列，也可以为核糖体18S rDNA编码序列，也可以为长末端重复DNA序列(Zeta序列)等。启动子DNA序列可以为来自Yarrowialipolytica酵母的任意基因的启动子DNA序列，比如TEF1编码序列(转录延长因子1基因)的启动子，也可以为hp4d启动子(杂合启动子)，也可以为GPD编码序列(3-磷酸甘油醛脱氢酶基因)启动子，也可以是1，6-二磷酸果糖裂解酶编码序列(FBA)的启动子，也可以是XPR2编码序列的启动子等。TreS编码序列可以来自但不限于Picroplilus torridus、Grifolafrondosa等生物。在TreS基因的5’端或者3’端融合一段表面锚定蛋白基因(如解脂耶氏酵母的Pir基因等)。终止子DNA序列可以为来自Yarrowia lipolytica酵母的任何基因的终止子DNA序列，如TEF1编码序列的终止子DNA序列，也可以是XPR2编码序列的终止子DNA序列等。上述启动子DNA序列、终止子DNA序列在公共数据库中都已公开，如在GenBank数据库中都能查询并免费得到序列。体外合成基因的技术目前也是很成熟的技术，一般的DNA合成公司都能合成。DNA的转化、酵母的转化、转化子的筛选等技术都是常规的实验技术。本发明提供的合成海藻糖的专用菌株含有上述编码序列的表达盒。

作为本发明的一个实施方案，含海藻糖合成酶基因的表面展示表达盒的序列如SEQ ID NO.1所示。

与现有的合成海藻糖的技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)本发明采用公认安全的能够合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母Yarrowialipolytica作为海藻糖合成酶表达宿主，该酵母在发酵合成食品添加剂行业被允许使用。而以往的技术是采用大肠杆菌作为表达宿主，大肠杆菌在食品添加剂发酵行业使用受一定的限制。

(2)本发明使用的解脂耶氏酵母表面展示海藻糖合成酶菌株是先合成赤藓糖醇，得到的酵母细胞作为细胞催化剂全细胞转化麦芽糖生成海藻糖。以往的方法都是采用大肠杆菌单独表达该酶，并破碎细胞释放酶，然后加入到转化液中，操作比较复杂，成本较高。而本方法得到的含海藻糖合成酶的细胞是赤藓糖醇发酵的副产物。能提高副产物的利用价值。

(3)本发明使用的含有海藻糖合成酶的解脂耶氏酵母可以被循环利用3～5次，而采用从大肠杆菌中纯化的酶只能被利用一次。

(4)本发明对转化过程中产生的葡副产物葡萄糖以及剩余的底物麦芽糖的处理是采用加入一种生物净化酵母，属酿酒酵母，该酵母在发酵合成食品添加剂行业被允许使用。使海藻糖的生产以及副产物的清除在同一个反应器中进行，进一步简化了海藻糖的生产步骤，降低生产成本，不需要使用色谱分离。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为含海藻糖合成酶基因表面展示表达框的示意图，依次含有上游同源臂序列(此示意图是26S rDNA的5’端序列)、启动子序列、锚定蛋白基因序列(如Pir1基因)、终止子序列、筛选基因表达盒(此处是潮霉素基因)以及下游同源臂序列(此示意图是26S rDNA的3’端序列)；

图2为出发菌株解脂耶氏酵母与重组得到的含有海藻糖合成酶的解脂耶氏酵母菌株在筛选培养基中生长比较；其中，1为本实验重组菌株在含木糖醇的基本培养基中的生长情况，2为出发菌株在同样培养基中的生长情况；

图3为解脂耶氏酵母表面展示海藻糖合成酶细胞在含300克/升麦芽糖的发酵液中发酵的液相分析；其中，A：发酵30小时的HPLC分析；B：发酵50小时时的HPLC分析；

图4为转化液中加入净化酵母后的HPLC分析。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域内的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1、海藻糖合成酶基因表面展示表达框架(表达盒)的设计与合成

海藻糖合成酶基因表面展示表达框架(表达盒)包括如下DNA元件：上游同源臂序列(此示意图是26S rDNA的5’端序列)、启动子序列、锚定蛋白基因序列(如Pir1基因)、海藻糖合成酶基因序列、终止子序列、筛选基因表达盒(此处是木糖醇脱氢酶基因)以及下游同源臂序列(此示意图是26S rDNA的3’端序列)，示意图如图1所示。序列如序列表中SEQ IDNO.1设计好后，采用化学合成全DNA序列，合成方法为成熟商业化技术，委托专门的生物科技公司合成，此处委托上海睿勉生物科技有限公司合成。

实施例2、海藻糖合成酶基因表面展示表达框架(表达盒)的转化

海藻糖合成酶基因表面展示表达框架(表达盒)全序列合成后，用于转化能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母(如Yarrowia lipolytica CGMCC7326等，本实施例中选用Yarrowialipolytica CGMCC 7326)，转化方法详见发明人公开发表的文献(Journal of FunctionalFoods,2017,32：208～217)。在含木糖醇的基本筛选培养基中培养，筛选培养基的成分为：酵母氮碱10克/升，硫酸铵5克/升，木糖醇20克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0。由于解脂耶氏酵母本身不能利用木糖醇，因此在含木糖醇的培养基中能生长的转化子就含有木糖醇脱氢酶基因，从而能生长(图2)。同时还含有海藻糖合成酶基因，从而获得含海藻糖合成酶基因表面展示表达的转化子。然后将含有Cre重组酶的质粒pUB4-CRE(来自公开发表的文献：Fickers et al.2003.New disruption cassettes for rapid gene disruption andmarker rescue in the yeast Yarrowia lipolytica.J.Microbiol.Methods,55,727–737)转化表达海藻糖合成酶的转化子，在含有潮霉素为选择标记的YPD琼脂培养基中筛选(葡萄糖10克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，琼脂15克/升，潮霉素300微克/毫升，pH6.0)。长出的转化子转接在含有木糖醇的基本培养基中(酵母氮碱10克/升，硫酸铵5克/升，木糖醇10克/升，琼脂粉15克/升，pH6.0)，选择木糖醇脱氢酶基因丢失的突变体(即不能再利用木糖醇)。然后在不含潮霉素的液体YPD培养基中培养不能利用木糖醇的突变体，再梯度稀释涂布在不含潮霉素的固体YPD培养基上，从长出的转化子中挑取转接在含有潮霉素的YPD琼脂培养基中，选择不能再抗潮霉素的突变体，即为过表达海藻糖合成酶基因，同时筛选标记木糖醇脱氢酶基因也丢失的突变体。将过表达海藻糖合成酶基因同时筛选标记又丢失的转化子标记为ery::TreS。

实施例3、不同条件下发酵合成海藻糖的试验

以下实施例详细描述含有海藻糖合成酶的解脂耶氏酵母菌株在不同pH、温度、底物浓度(碳源)、不同氮源及浓度对发酵合成海藻糖的影响。

3.1重组解脂耶氏酵母菌ery::TreS由发酵葡萄糖合成赤藓糖醇

将重组解脂耶氏酵母菌ery::TreS接种在发酵培养基中，其成分为：一水葡萄糖330克/升，酵母粉10克/升，蛋白胨5克/升，柠檬酸铵3克/升，氯化锌0.05克/升，氯化锰0.01克/升，七水硫酸镁0.1克/升，pH6.0，灭菌。在3升发酵罐中进行发酵，含1.5升发酵培养基，温度30度，搅拌500转每分钟，通气。定时取样检测，发现突变株ery::TreS在85小时时葡萄糖利用完全，赤藓糖醇147.5±4.5克/升，甘露醇11.5±1.5克/升。离心得到酵母细胞，用无菌水洗涤细胞3次以去除赤藓糖醇，酵母细胞用作全细胞催化剂催化麦芽糖合成海藻糖。

3.2pH值对合成海藻糖的影响

在250毫升摇瓶中装入50毫升转化培养基，成分为(克/升)：麦芽糖250，上述3.1获得的酵母细胞10克(湿重)。pH分别调节至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，在30℃振荡转化。到50小时取样，分别测定海藻糖的含量。结果如下表1：

表1 不同pH对酵母生长以及海藻糖合成的影响

pH值	2.0	3.0	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0
								海藻糖含量(g/L)	31.5	56.4	88.5	150.4	193.5	199.6	160.3

由表1结果初步可见，在pH2.0～8.0条件下酵母均能合成海藻糖，但在pH2.0条件下合成海藻糖的量明显低于其它pH条件下的量，在pH7中性条件下合成效率最高。

3.3温度对发酵合成海藻糖的影响

转化液成分同上3.2，pH调节至7.0，灭菌后接入含海藻糖合成酶基因的酵母Yarrowia lipolyticaery::TreS，分别在25℃，28℃，30℃，32℃，35℃振荡发酵培养。发酵到50小时取样，分别测定海藻糖的含量。结果如下表2：

表2 不同温度对酵母生长以及海藻糖合成的影响

温度	25	28	30	32	35
						海藻糖含量(g/L)	130.8	187.4	193.4	199.4	183.5

由表2结果初步可见，在温度28～35℃条件下酵母均能良好的合成海藻糖。低于28度合成量明显减少。

3.4不同麦芽糖浓度对合成海藻糖的影响

在250毫升摇瓶中装入50毫升转化液，成分为(克/升)：麦芽糖分别为50、100、150、200、250、280，pH调节至7.0，灭菌后接入10克含海藻糖合成酶基因的酵母Yarrowialipolytica ery::TreS在32℃振荡发酵。50小时取样，分别测定海藻糖的含量。结果如下表3：

表3 不同麦芽糖浓度对海藻糖合成的影响

麦芽糖浓度(g/L)	50	100	150	200	250	280
							海藻糖含量(g/L)	32.5	68.2	113.3	153	192.8	211.4
转化率(％)	65	68.2	75.5	76.5	77.1	75.5

由表3可见，合成海藻糖的转化率随着底物麦芽糖的浓度提高而增加，在65～77％之间，但到麦芽糖浓度提高到150-280之间时转化率基本稳定在75％。HPLC分析海藻糖的纯度在70～75％之间，其余为副产物葡萄糖。

实施例4、转化结束后海藻糖的生物净化

上述实施例3中合成海藻糖后，发酵液中还有少量残留的麦芽糖以及葡萄糖，为了提高发酵液中海藻糖的纯度，以便纯化，本发明在发酵液中添加一定量的糖化酶，反应一段时间后再加入酿酒酵母发酵葡萄糖。

在250毫升摇瓶中装入50毫升培养基，成分为(克/升)：葡萄糖20，麦芽糖为250，酵母粉5，玉米浆干粉5，磷酸氢二铵2，硫酸镁1.98，氯化锰0.01，氯化铜0.01，pH调节至5.0，灭菌后接入酵母在30℃振荡发酵。以海藻糖的含量在连续5小时内不再增加作为发酵结束的依据，HPLC分析发酵液的成分，图谱如图3所示，图3A为发酵30小时时的色谱分析，10.9麦芽糖的峰，11.4为海藻糖的峰。图3B为发酵50小时的分析，10.97为低聚麦芽糖，11.5为麦芽糖的峰，12.0为海藻糖的峰。随着转化时间的增加会产生少量的低聚麦芽糖。由图3可知，海藻糖的纯度为75％。再加入发酵液质量百分比为0.05％的糖化酶，升温至50℃反应2小时，糖化酶将发酵液中残余的低聚麦芽糖或麦芽糖全部水解为葡萄糖，此时海藻糖的纯度与酶解前基本一致，为75.2％。降温至30℃，加入酿酒酵母搅拌12小时，HPLC分析，图谱如图4所示，图中12min为海藻糖。由图4可见，加入酿酒酵母后能将葡萄糖分解完全，提高发酵液中海藻糖的纯度，此时海藻糖的纯度为99％以上。

由上述结果可见，在发酵液中加入糖化酶以及酿酒酵母能显著提高发酵液中海藻糖的纯度。

实施例5、发酵液中海藻糖的分离纯化

采用本领域内通识的分离方法既能从发酵液中分离纯化海藻糖。这些方法技术人员通过有限的操作实践既能掌握。

首先进行菌液分离，采取的方法有离心(管式离心机离心)、陶瓷膜过滤、板框过滤等。得到澄清的发酵液后浓缩到折光60％，冷却，海藻糖既能结晶析出。离心得到海藻糖晶体。再进行二次结晶，步骤为：溶解、脱色、离子交换、浓缩、再结晶。离心晶体并干燥，得到白色海藻糖。

实施例6、以合成赤藓醇后得到的酵母细胞泥为催化剂循环转化合成海藻糖

由于本发明所构建得到的含海藻糖合成酶基因的酵母菌株Yarrowia lipolytica菌株(ery::TreS)来自于出发菌株CGMCC NO.7326，保留了该出发菌株合成赤藓糖醇的特性，同时又能合成海藻糖。合成赤藓糖醇后，酵母菌株Yarrowia lipolytica ery::TreS仍然具备合成海藻糖的能力。以酵母菌株Yarrowia lipolytica CGMCC NO.11367(CN201510599925)在含葡萄糖的发酵培养基中合成赤藓糖醇，以菌液分离后得到的酵母泥来转化麦芽糖合成海藻糖。第一次转化后，菌液分离，得到的酵母细胞再用于转化麦芽糖合成海藻糖，转化结束后再次菌液分离，得到的细胞还可以再次用于转化合成海藻糖，细胞可以反复利用5次，转化率分别为80.5％，78.6％，77.5％，77.8％以及75.4％。转化结束后按照实施例4描述的方法加入糖化酶以及酿酒酵母进行分解去除葡萄糖，提高海藻糖的纯度。细胞一般反复利用5次。说明可以以合成赤藓糖醇后留下的废酵母细胞为催化剂转化合成海藻糖，充分利用了酵母资源，这是本发明的一个重要创新点。

实施例7、以淀粉为起始原料合成海藻糖

上述实施例中以麦芽糖为起始原料发酵或者细胞转化得到海藻糖。而制备麦芽糖的原料是淀粉，因此在该实施例中描述以淀粉为起始原料来合成海藻糖。

称取1000克淀粉，用3升蒸馏水调成淀粉乳，加热到90℃，加入质量百分比为0.05％的高温淀粉酶反应，直到DE值在8～12结束反应，再加热到105℃维持10分钟以灭活淀粉酶。冷却到60℃，再按照质量百分比为0.02％的量加入普鲁兰酶(一种淀粉去分支酶)以及β-淀粉酶，60℃反应5小时，得到麦芽糖。再按照实施例4描述的方法细胞转化合成海藻糖。

综上所述，采用本发明描述的构建能合成海藻糖的方法得到的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ery::TreS能自我高效合成海藻糖所需要的酶，且能循环使用，降低了生产成本；该酵母还能合成赤藓糖醇，可以利用合成赤藓糖醇后得到的酵母细胞转化麦芽糖合成海藻糖，节省了培养细胞的成本。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法

<130> KAG43448

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6155

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagatcttgg tggtagtagc aaatattcaa atgagaactt tgaagactga agtggggaaa 60

ggttccgtgt gaacagcagt tggacacggg taagtcgatc ctaaggggtg gcataactgt 120

cgcgtacggc ccgataaggg ccttctccaa aagggaagcc ggttgaaatt ccggcacttg 180

gatgtggatt ctccacggca acgtaactga atgtggggac ggtggcacaa gtcttggaag 240

gagttatctt ttctttttaa cggagtcaac accctggaat tagtttgtct agagataggg 300

tatcgttccg gaagaggggg gcagctttgt cccctccgat gcacttgtga cgccccttga 360

aaacccgcag gaaggaatag ttttcacgcc aagtcgtact gataaccgca gcaggtctcc 420

aaggtgaaca gcctctagtt gatagaataa tgtagataag ggaagtcggc aaaatagatc 480

cgtaacttcg ggataaggat tggctctggg ggttggtgga tggaagcgtg ggagacccca 540

agggactggc agctgggcaa ctggcagccg gacccgcctg aggtgtctca caagtgccgt 600

gcagtcccgc ccccacttgc ttctctttgt gtgtagtgta cgtacattat cgagaccgtt 660

gttcccgccc acctcgatcc ggctgaggtg tctcacaagt gccgtgcagt cccgccccca 720

cttgcttctc tttgtgtgta gtgtacgtac attatcgaga ccgttgttcc cgcccacctc 780

gatccggctg aggtgtctca caagtgccgt gcagtcccgc ccccacttgc ttctctttgt 840

gtgtagtgta cgtacattat cgagaccgtt gttcccgccc acctcgatcc ggctgaggtg 900

tctcacaagt gccgtgcagt cccgccccca cttgcttctc tttgtgtgta gtgtacgtac 960

attatcgaga ccgttgttcc cgcccacctc gatccggcac gggcaaaagt gcgtatatat 1020

acaagagcgt ttgccagcca cagattttca ctccacacac cacatcacac atacaaccac 1080

acacatccac aatggaaccc gaaactaagg agctcatggt gttcaagtct gctgctgttt 1140

ctttggttgc tttggctgct actgtttctg ctgctgacga atggactaag ttgaagccaa 1200

ctaacactgc tccatctaac tggatcactt cttactctaa cttcggtatc gctatccaac 1260

caatcactgg tgctgttcaa gctggtgctg aagctactgc tgttccaact gctcaccaaa 1320

agagagacga acacgacgac gacgttgtta ctcaaactgt tgttgtttgt ccatgtgacg 1380

aatctactac tactttgcca gttgttgctc cacaccacga agaatgtgct gctccaactt 1440

ctgctaagga atctgctgct gctgctgaaa ctactccagc tactgttcca cactctgacg 1500

ttactactaa ggctttcgct acttctgctg ctgcttcttc tgctgctgct tcttctgctg 1560

ctgtttctgg tgacgctgaa gctactaagg ctgctttcgc tgctactact ggtccaaagc 1620

catctggtaa gcaagacgaa ccaacttcta actctgactt cgctaagttg gttgcttgta 1680

agaaggaagg tactttggct atgactttgg aagacggtat cttgaaggac gacaagggta 1740

gaatcggttc tatcgtttct aactaccaat tccaattcga cggtccacca ccacaagctg 1800

gtgcttggta cgctgctggt tgggctatct cttctgacgg taacttggct atcggtgaca 1860

accaagtttt ctggcaatgt ttgtctggta ctttctacaa cttgtacgac agaaaggaca 1920

acagagacca atgtactgct gttcacttgg ctatcgttaa cttggaagac tgtatgcttg 1980

ataataatgg tttatggtac cgtgatgctg tattttatga ggttcctgta aaatcattct 2040

atgattcaaa caacgatggc ataggcgatt ttaatggcct aacaatgaag cttgactatt 2100

taaaaaagct tggtgttgac gctttatggc tgctgccatt ctataaatcg ccattgaagg 2160

acgacggtta cgatatatct gattactatt caatactgcc ggagtatgga acaattgatg 2220

attttaaaaa cttcatagat accgcgcatt caatgaacat aagggttata gcggacctcg 2280

ttctaaacca tgtatctgac cagcatccat ggttcattga atcaagaagc agcattgata 2340

atccaaagag ggactggttt atatggagcg acacaccaga aaaatttaag gaggcaagga 2400

taatatttat agatacagaa aaatcaaact ggacatatga tccggaaaca aaacagtatt 2460

actttcacag gttttactca tcccagccgg atcttaacta tgacaatcct gatgtcagga 2520

acgaggttaa aaaggttata aggtactggc ttgaccttgg ccttgacggc ttcagggcag 2580

atgcggttcc atacctcttt aaaagggaga atacaaactg tgagaacctg ccagaaacac 2640

acaacttctt taaggaaata aggaagatga tggatgaaga ttaccctgga acaatacttt 2700

tagcagaggc aaaccagtgg cctacagaaa caaaggcata ctttggtaac ggcgatgaat 2760

ttcatatggc attcaatttt cctttgatgc caaggatctt tatagcactg gccaggagcg 2820

attactatcc aataatggat ataataaagc agacgctgcc gatacctgat aactgcgact 2880

ggtgcatctt tcttagaaac catgacgagc ttacccttga gatggtcacg gattcagaaa 2940

gggatatcat gtacagggag tacgcaaaga taccaaagat gcgtttaaat cttggaataa 3000

ggcgcaggct agcaccgctt gctgacaatg atataaacac aatagaacta ttaaacgcat 3060

taatattttc actgcccggc acgccgataa tatactatgg cgacgagata ggcatgggtg 3120

ataacatata tcttggcgat agaaacggtg tgagaacgcc aatgcagtgg tcatatgata 3180

gaaacgcagg tttctcaatg gcagattcgg agcagctcta ctcaccggtg ataacaaatc 3240

ctaattatca ttatgaaagc gtgaacgttg aggctgagct caggctgagc tcatcgcttt 3300

taaactggat gataaagatt atacatgtta gaaaggatta caaggagctc ctcggccgcg 3360

gttcaataaa atttatagag cagggtaata aaagggtgct ttcttatata agagagtatg 3420

aaaaccagag gatgctgtgc ctttttaatt tatcaaggaa tccaacgtac gttgagctaa 3480

atttaagtga ttacataggg cttaaaccaa tagaggccat aacaaaggca gcatttccaa 3540

ggataaagga tgataggtat ttcataacaa tgacaccaag gtcattcttc tggtttaatt 3600

taattgtacc tgaaagggat gattcatacg acctcattgg agaagattaa gcaattaaca 3660

gatagtttgc cggtgataat tctcttaacc tcccacactc ctttgacata acgatttatg 3720

taacgaaact gaaatttgac cagatattgt tgtaaataga aaatctggct tgtaggtggc 3780

aaaatcccgt ctttgttcgt cggttccctc tgtgactgct cgtcgtccct ttgtgttcga 3840

ctgtcgtgtt ttgttttccg tgcgtgcgca agtgagatgc ccgtgttcga atacggtagt 3900

cgcacggaat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atctgaggtg tctcacaagt 3960

gccgtgcagt cccgccccca cttgcttctc tttgtgtgta gtgtacgtac attatcgaga 4020

ccgttgttcc cgcccacctc gatccggctg aggtgtctca caagtgccgt gcagtcccgc 4080

ccccacttgc ttctctttgt gtgtagtgta cgtacattat cgagaccgtt gttcccgccc 4140

acctcgatcc ggctgaggtg tctcacaagt gccgtgcagt cccgccccca cttgcttctc 4200

tttgtgtgta gtgtacgtac attatcgaga ccgttgttcc cgcccacctc gatccggctg 4260

aggtgtctca caagtgccgt gcagtcccgc ccccacttgc ttctctttgt gtgtagtgta 4320

cgtacattat cgagaccgtt gttcccgccc acctcgatcc ggcacgggca aaagtgcgta 4380

tatatacaag agcgtttgcc agccacagat tttcactcca cacaccacat cacacataca 4440

accacacaca tccacaatgg aacccgaaac taagatgtcg aagaagttta acggtaaggt 4500

ctgtctggtc accggcgctg gtggcaacat cggtcttgct accgccctcc gtctggccga 4560

agagggcacg gccatcgccc ttctggacat gaaccgagag gctctggaaa aggctgaagc 4620

ctccgtccgt gaaaagggcg tcgaagcccg atcctatgtc tgtgacgtca cgtccgaaga 4680

ggccgtgatc ggtacggtgg atagcgtggt ccgggacttc ggtaagatcg acttcctgtt 4740

caacaacgcc ggctatcagg gagccttcgc ccccgtgcag gactacccgt ccgacgattt 4800

cgcccgagtg ctgacgatca acgtcactgg tgccttccac gtcctcaagg ccgtttcgcg 4860

acagatgatc acgcagaact acggtcgaat cgtcaacacc gccagcatgg ccggtgtgaa 4920

gggaccgcca aacatggccg cctatggtac gtccaaggga gccatcatcg ccctgaccga 4980

aacggccgct cttgaccttg ccccctacaa catccgtgtg aacgccatca gccccggtta 5040

catgggtccc ggtttcatgt gggagcgtca ggtcgagctt caggccaagg tcggaagcca 5100

gtatttctcc accgatccca aggtcgtggc ccagcagatg atcggcagcg ttccgatgcg 5160

acgatatggc gacatcaacg agattccggg cgtggtggct ttcctgctgg gtgatgattc 5220

cagcttcatg acgggtgtga acctgccgat tgctggcggt tgagcaatta acagatagtt 5280

tgccggtgat aattctctta acctcccaca ctcctttgac ataacgattt atgtaacgaa 5340

actgaaattt gaccagatat tgttgtaaat agaaaatctg gcttgtaggt ggcaaaatcc 5400

cgtctttgtt cgtcggttcc ctctgtgact gctcgtcgtc cctttgtgtt cgactgtcgt 5460

gttttgtttt ccgtgcgtgc gcaagtgaga tgcccgtgtt cgaattgggt agtcgcacgg 5520

aataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatggcag acactgcgtc gctccgtcca 5580

catcatcaac cgccccagaa ctggtacgga caaggggaat ctgactgtct aattaaaaca 5640

tagctttgcg atggttgtaa aacaatgttg acgcaaagtg atttctgccc agtgctctga 5700

atgtcaaagt gaagaaattc aaccaagcgc gcgggtaaac ggcgggagta actatgctct 5760

cttaaggtag ccaaatgcct cgtcatctaa ttagtgacgc gcatgaatgg attaacgaga 5820

ttcccactgt ccctatctac tatgtagcga aaccacagcc aagggaacgg gcttggcaga 5880

atcagcgggg aaagaagacc ctgttgagct tgactctagt ttgacattgt gaagagacat 5940

agggggtgta gaataagtgg gagcttcggc gccggtgaaa taccactacc cttatcgttt 6000

ctttacttat ttagtaagtg gaagtggttt aacaaccatt ttctagcatt cctttccagg 6060

ctgaagacat tgtcaggtgg ggagtttggc tggggcggca catctgttaa aagataacgc 6120

agatgtccta agggggactc aatgagaaca gaaat 6155

Claims

1.一种合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，其特征在于，以能合成赤藓糖醇的解脂耶氏酵母作为海藻糖合成酶表达宿主，将海藻糖合成酶表面展示在该菌株表面获得重组菌株。

2.如权利要求1所述的合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的合成海藻糖的重组解脂耶氏酵母菌的构建方法，其特征在于，所述海藻糖合成酶基因表面展示表达盒为含TreS编码序列的表达盒，包含同源臂DNA序列、启动子DNA序列、TreS基因编码序列、终止子DNA序列。

4.一种利用如权利要求1所述的方法构建得到的重组解脂耶氏酵母菌在合成海藻糖中的用途。

5.一种利用如权利要求1所述的方法构建得到的重组解脂耶氏酵母菌合成海藻糖的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

A1、将重组解脂耶氏酵母菌发酵葡萄糖合成赤藓糖醇；

A5、从A4中分离纯化得到海藻糖。

6.如权利要求5所述的利用重组解脂耶氏酵母菌合成海藻糖的方法，其特征在于，步骤A3中，在所述酵母菌细胞中加入质量百分比浓度为10％～30％的麦芽糖水溶液，在温度30～50℃，pH 3.0～8.0条件下振荡或搅拌进行转化得到含有海藻糖的转化液。

7.如权利要求5所述的利用重组解脂耶氏酵母菌合成海藻糖的方法，其特征在于，步骤A4中的酿酒酵母能利用麦芽糖以及葡萄糖而不能利用产物海藻糖。

8.如权利要求5所述的利用重组解脂耶氏酵母菌合成海藻糖的方法，其特征在于，步骤A4中，所述酿酒酵母的接种量为1-5％。

9.如权利要求5所述的利用重组解脂耶氏酵母菌合成海藻糖的方法，其特征在于，步骤A4中，所述氮源为蛋白胨、酵母粉、酵母浸膏、玉米浆干粉、玉米浆、磷酸氢二铵中的一种或几种的混合；所述无机盐为硫酸镁、氯化锰、氯化铜中的一种或几种。

10.如权利要求9所述的利用重组解脂耶氏酵母菌合成海藻糖的方法，其特征在于，所述氮源的用量为5～25克/升；所述无机盐用量为0～2.5克/升。