CN114134057B - 一株酿酒酵母swgcjm001及其培养方法和应用 - Google Patents

一株酿酒酵母swgcjm001及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株生物催化合成L‑木糖的酿酒酵母SWGCJM001及其培养方法和应用，属于功能菌开发技术领域。本发明所述酿酒酵母SWGCJM001的保藏编号为CGMCC No.20832。所述菌株是一种能够以木糖醇为底物催化合成L‑木糖的新菌种，通过该菌种能够实现L‑木糖高纯度的制备，其转化率100％，光学纯度达到100％。使用本发明的菌株进行不对称还原工艺，反应条件温和，节能，环保，更重要的是显著提高L‑木糖的经济效益，具有很好的工业应用前景。

Description

一株酿酒酵母SWGCJM001及其培养方法和应用
技术领域
本发明属于功能菌开发技术领域，具体涉及一株酿酒酵母SWGCJM001及其培养方法和应用。
背景技术
木糖是一种五碳糖，具有D-和L-两种构型。D-木糖主要存在于植物和动物体内，L-木糖在自然界中不存在，而L-木糖广泛应用于医药、食品、化工等领域。L-木糖作为医药中间体，在抗癌、抗病毒、抗炎症、抗糖尿病等方面发挥着重要作用，在食品方面，L-木糖能改善人体的微生物环境，提高机体免疫能力，是糖尿病人理想的甜味剂，还可作为原料用于合成一种健康甜味剂木糖醇。
木糖不是一种天然存在的化合物，只有通过化学合成法和生物转化法合成得到。最早的化学合成法为1950年美国专利US2584129A报道的。1955年，Courtois，J.E.报道以2,4-O-苄烯-D-山梨醇为原料，采用先氧化后水解的两步法合成L-木糖，但是该方法使用的催化氧化剂极不稳定，特别容易分解，反应过程很难控制。2003年，美国专利20030097029中报道用L-木糖酸在钉催化剂作用下加氢还原生成L-木糖，反应压力5MPa，反应时间18h，反应压力大，反应时间长，且在此条件下L-木糖会继续过度还原生成木糖醇，所得一木糖纯度不高。2017年，中国专利108276455A中报道了利用2,4-0-苄烯-L-木糖为底物在酸催化剂作用下合成L-木糖，产品收率为80％左右，产品纯度为98％，副产物产生较多，纯化难度大，现阶段仍仅限于实验室研究，不能满足工业生产的要求。
因此提供一种L-木糖的合成方法，解决现有技术中L-木糖的合成工艺压力过高，反应时间长，反应过程控制难，后处理繁琐，不易工业化的问题成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株生物催化合成L-木糖的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SWGCJM001及培养方法和应用，并高效立体选择性地以木糖醇为底物催化合成L-木糖。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株生物催化合成L-木糖的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SWGCJM001，所述酿酒酵母SWGCJM001已完成保藏，保藏编号为CGMCCNo.20832。
优选的，所述酿酒酵母SWGCJM001的28S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种鉴定上述酿酒酵母SWGCJM001的引物对，所述引物对包括引物F和引物R，所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
本发明提供了一种鉴定上述酿酒酵母SWGCJM001的方法，包括以下步骤：以菌株的基因组DNA为模板，与上述引物对混合成PCR体系进行PCR扩增，扩增产物与SEQ ID No.1所示序列一致，则认为是所述酿酒酵母SWGCJM001。
本发明提供了上述酿酒酵母SWGCJM001的培养方法，包括以下步骤：(1)将酿酒酵母SWGCJM001接种至种子培养基中进行活化培养，得种子液；所述种子培养基包括以下重量百分含量的原料：3～6％葡萄糖、0.2～0.8％酵母膏、0.1～0.3％(NH4)2SO4、0.1～0.3％KH2PO4和0.1～0.3％MgSO4·7H2O，pH值为5～6；
2)将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养，将发酵液离心后，收集沉淀，得酿酒酵母SWGCJM001菌体；所述发酵培养基包含以下重量百分含量的原料：10～20％葡萄糖、0.1～0.3％酵母膏、0.1～0.3％(NH4)2SO4和0.1～0.3％KH2PO4，pH值为5～6。
优选的，步骤(1)所述活化培养的温度为25～35℃，活化培养的时间为8～12h。
优选的，步骤(2)所述发酵培养在摇床上进行，温度为25～35℃，震荡频率为150～300rpm；所述发酵培养的时间为36～48h。
本发明还提供了上述酿酒酵母SWGCJM001或利用上述培养方法培养得到的酿酒酵母SWGCJM001菌体在生物合成L-木糖中的应用。
本发明还提供了一种生物合成L-木糖的方法，以木糖醇为底物，以上述酿酒酵母SWGCJM001或利用上述培养方法培养得到的酿酒酵母SWGCJM001菌体为催化剂，在磷酸盐缓冲液的环境中反应5～60h，分离纯化后得所述L-木糖。
优选的，所述反应的温度为20～50℃，pH值为5.0～7.0；
所述底物和催化剂的质量比为1～100：0.1～20。
有益效果：本发明提供一株生物催化合成L-木糖的酿酒酵母SWGCJM001，菌株SWGCJM001的菌落如图1所示，呈乳橙色，表面光滑，不透明，边缘整齐。本发明所述菌株SWGCJM001能够以木糖醇为底物催化合成L-木糖，其转化率100％，光学纯度达到100％，产品纯度大于99.90％，产品收率90％以上。使用本发明所述菌株SWGCJM001进行不对称还原工艺，反应条件温和，节能，环保，更重要的是显著提高了经济效益，具有很好的工业应用前景。
生物保藏信息
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，菌株编号为SWGCJM001，于2020年9月27日保藏至保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号为CGMCC No.20832。
附图说明
图1为酿酒酵母SWGCJM001的菌落形态；
图2为木糖醇和L-木糖的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一株生物催化合成L-木糖的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SWGCJM001，酿酒酵母SWGCJM001的保藏编号为CGMCC No.20832。
本发明所述菌株SWGCJM001从土壤中分离筛选得到，菌体圆形或卵圆形，单端出芽或两边芽殖；生理生化特性中，阳性项目：长温度为4～40℃，能够耐受7～10％氯化钠，能够V-P，硝酸盐还原，淀粉水解，明胶液化，可以利用柠檬酸，果糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，葡萄糖，蔗糖，络氨酸为碳源；阴性项目：不能利用木糖、D-阿拉伯糖、苯丙氨酸为碳源。甲基红试验、接触酶和氧化酶试验为阳性，不产过氧化氢和硫化氢。所述菌株SWGCJM001的菌落如图2所示，呈乳橙色，表面光滑，不透明，边缘整齐；经28S rDNA测序，其序列优选如SEQ ID No.1所示(622bp)：TATTTCTTCTGTTTGCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGT TTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACCCACGGGAACCAC。
本发明提供了一种鉴定上述酿酒酵母SWGCJM001的引物对，所述引物对包括引物F和引物R，所述引物F(NL1)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述引物R(NL4)的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
利用本发明所述引物对，可扩增所述酿酒酵母SWGCJM001基因组的28S rDNA，产物为622bp。
本发明提供了一种鉴定上述酿酒酵母SWGCJM001的方法，包括以下步骤：以菌株的基因组DNA为模板，与上述引物对混合成PCR体系进行PC R扩增，扩增产物扩增产物与SEQID No.1所示序列一致，则认为是所述酿酒酵母SWGCJM001。
本发明所述PCR体系以20μL计，优选包括：基因组DNA 1μL，NL1、NL4引物各0.5μL，2×TransStart KD Plus PCR SuperMix 10μL，超纯水8μL。
本发明所述PCR扩增的程序优选包括：94℃4min；94℃15s，55℃15s，72℃40s，30个循环；72℃2min。
本发明还提供了上述酿酒酵母SWGCJM001的培养方法，包括以下步骤：
1)将酿酒酵母SWGCJM001接种至种子培养基中进行活化培养，得种子液；所述种子培养基包括以下重量百分含量的原料：3～6％葡萄糖、0.2～0.8％酵母膏、0.1～0.3％(NH4)2SO4、0.1～0.3％KH2PO4和0.1～0.3％MgSO4·7H2O，pH值为5～6；
2)将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养，将发酵液离心后，收集沉淀，得酿酒酵母SWGCJM001菌体；所述发酵培养基包含以下重量百分含量的原料：10～20％葡萄糖、0.1～0.3％酵母膏、0.1～0.3％(NH4)2SO4和0.1～0.3％KH2PO4，pH值为5～6。
本发明将酿酒酵母SWGCJM001接种至种子培养基中进行活化培养，得种子液；所述接种的方式优选包括单菌落接种。本发明所述种子培养基优选包括以下重量百分含量的原料：5％葡萄糖、0.5％酵母膏、0.2％(NH4)2SO4、0.2％KH2PO4和0.1％MgSO4·7H2O，pH值为5～6。本发明所述活化培养的温度优选为25～35℃，活化培养的时间优选为8～12h。本发明在进行所述活化培养时，优选在摇床上进行，转速优选为250rpm。
本发明将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养，将发酵液离心后，收集沉淀，得酿酒酵母SWGCJM001菌体；所述接种的接种量优选为0.1～10％(v/v)，更优选为1～5％。本发明所述发酵培养基优选包含以下重量百分含量的原料：15％葡萄糖、0.2％酵母膏、0.2％(NH4)2SO4和0.1％KH2PO4，pH值为5～6。本发明所述发酵培养优选在摇床上进行，并设置温度25～35℃，震荡频率150～300rpm，更优选250rpm；所述发酵培养的时间为36～48h。
本发明所述发酵培养基中葡萄糖的浓度优选为10～45g/L，酵母膏的浓度优选为10～50g/L。
本发明所述离心的转速优选为7000～9000rpm，更优选为8000rpm，所述离心的时间优选为15～20min。本发明优选弃去所述离心后的上清液，更优选将离心后的沉淀经生理盐水洗涤，得到所述菌体。
本发明还提供了上述酿酒酵母SWGCJM001或利用上述培养方法培养得到的酿酒酵母SWGCJM001菌体在生物合成L-木糖中的应用。
本发明所述酿酒酵母SWGCJM001可以木糖醇为碳源进行培养和发酵。
本发明还提供一种生物合成L-木糖的方法，以木糖醇为底物，以上述酿酒酵母SWGCJM001或利用上述培养方法培养得到的酿酒酵母SWGCJM001菌体为催化剂，在磷酸盐缓冲液的环境中反应5～60h，分离纯化后得所述L-木糖。
本发明所述底物和催化剂的质量比优选为1～100：0.1～20，更优选为50～80：5～15，最优选为60：10。
本发明所述反应的温度优选为20～50℃，pH值优选为5.0～7.0。
在本发明中，所述分离纯化的方法优选包括低温结晶方法；经过高效液相色谱方法鉴定，所得发酵产物为手性化合物L-木糖。
下面结合实施例对本发明提供的一株酿酒酵母SWGCJM001及其培养方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明中，如未特别说明，所用的试剂、材料和仪器均应当被理解为本领域的常规产品，可通过购买得到。
实施例1
酿酒酵母SWGCJM001的分离筛选和鉴定
将从农田中随机采集的土壤样本用无菌水以1:100(W/V)稀释，涂布于筛选平板培养基，筛选平板培养基(pH 7.0)包括：1％磷酸二氢钾、0.3％磷酸氢二氨、0.5％酵母抽提物、1％胰蛋白胨、5％木糖醇、15％琼脂。在30℃下培养48h，然后挑选单个菌落分别接种至液体筛选培养基中，在30℃下，200rpm培养48h。培养物以8000rpm离心10min后，将菌体分别加入反应液中进行反应，反应液包括5％木糖醇、pH 7.0 50mM磷酸钾缓冲液中，250rpm30℃反应24h。反应液12000rpm离心后，进行液相高效色谱检测(HPLC)。
HPLC检测条件为：柱子：Aminex HPX-87H柱(300×7.8mm)；流动相：5mM硫酸；流速：5mL/min；柱箱温度：40℃；检测器：RID。L-木糖标准品出峰时间为11.1min左右，木糖醇标准品出峰时间为12.8min左右。反应液检测后得到一株菌株具有以木糖醇为底物合成L-木糖的菌株。
经镜检，该菌体圆形或卵圆形，单端出芽或两边芽殖，菌落呈乳橙色，表面光滑，不透明，边缘整齐(图1)。生理生化特性中，阳性项目：长温度为4～40℃，能够耐受7～10％氯化钠，能够V-P，硝酸盐还原，淀粉水解，明胶液化，可以利用柠檬酸，果糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，葡萄糖，蔗糖，络氨酸为碳源；阴性项目：不能利用木糖、D-阿拉伯糖、苯丙氨酸为碳源。甲基红试验、接触酶和氧化酶试验为阳性，不产过氧化氢和硫化氢。
以NL1、NL4引物扩增28S rDNA，得到大小约600bp扩增产物，经测序后序列全长为622bp，将序列在NCBI数据库中进行BLAST序列相似性比对，鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，命名为酿酒酵母SWGCJM001，保藏编号为CGMCC No.20832。
实施例2
酿酒酵母SWGCJM001的发酵培养
种子培养基：5％葡萄糖、0.5％酵母膏、0.2％(NH4)2SO4、0.2％KH2PO4，0.1％MgSO4·7H2O，pH值为5.5；发酵培养基：15％葡萄糖、0.2％酵母膏、0.2％(NH4)2SO4、0.1％KH2PO4，溶剂为蒸馏水，pH值调至5.5。种子培养基在115℃高温灭菌25min，冷却后接种，摇瓶培养，装液量为30％。
具体的培养步骤：取-70℃保存的菌种在种子固体平板上划线，挑取单菌落接于种子液体培养基中，30℃，250rpm转速培养12小时，将种子按照5％的接种量接种于发酵培养基中，30℃，250rpm振荡培养24小时，培养结束后发酵液离心并利用生理盐水洗涤2次，收集湿菌体细胞，菌体湿重达到20g/L。
实施例3
L-木糖的生产
在10L催化体系中，加入600g木糖醇，缓冲液用pH7.0磷酸缓冲溶液，搅拌，加入酿酒酵母SWGCJM001菌株10g，开始反应。35℃反应12h结束后，经液相色谱检测溶液中的L-木糖浓度可达44.79g/L，转化率达到96.54％以上。反应结束后，反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到427.72g成品。经检测该成品L-木糖手性纯度为100％，产品纯度为99.90％，产品收率为95.5％。
实施例4
L-木糖的生产
在10L催化体系中，加入600g木糖醇，缓冲液用pH7.0磷酸钾缓冲溶液，搅拌，加入酿酒酵母SWGCJM001菌株10g，开始反应。40℃反应12h结束后，经液相色谱检测溶液中的L-木糖浓度可达46.39g/L，转化率达到100％以上。反应结束后，反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到443.97g成品。经检测该成品L-木糖手性纯度为100％，产品纯度为99.93％，产品收率为95.7％。
实施例5
L-木糖的生产
在10L催化体系中，加入600g木糖醇，缓冲液用pH7.0磷酸钾缓冲溶液，搅拌，加入酿酒酵母SWGCJM001菌株10g，开始反应。50℃反应12h结束后，经液相色谱检测溶液中的L-木糖浓度可达42.32g/L，转化率达到91.23％以上。反应结束后，反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到382.18g成品。经检测该成品L-木糖手性纯度为100％，产品纯度为99.32％，产品收率为90.3％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>河北省科学院生物研究所
<120>一株酿酒酵母SWGCJM001及其培养方法和应用
<160>3
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>622
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>1
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<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(artificial sequence)
<400>2
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<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列(artificial sequence)
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序列表
<110> 河北省科学院生物研究所
<120> 一株酿酒酵母SWGCJM001及其培养方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 622
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
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ccgatagcga acaagtacag tgatggaaag atgaaaagaa ctttgaaaag agagtgaaaa 360
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<400> 2
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtccgtgtt tcaagacgg 19

Claims (7)

1.一株生物催化合成L-木糖的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SWGCJM001，其特征在于，所述酿酒酵母SWGCJM001已完成保藏，保藏编号为CGMCC No.20832。
2.权利要求1所述酿酒酵母SWGCJM001的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将酿酒酵母SWGCJM001接种至种子培养基中进行活化培养，得种子液；所述种子培养基包括以下重量百分含量的原料：3～6％葡萄糖、0.2～0.8％酵母膏、0.1～0.3％(NH4)2SO4、0.1～0.3％KH2PO4和0.1～0.3％MgSO4·7H2O，pH值为5～6；
2)将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养，将发酵液离心后，收集沉淀，得酿酒酵母SWGCJM001菌体；所述发酵培养基包含以下重量百分含量的原料：10～20％葡萄糖、0.1～0.3％酵母膏、0.1～0.3％(NH4)2SO4和0.1～0.3％KH2PO4，pH值为5～6。
3.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，步骤(1)所述活化培养的温度为25～35℃，活化培养的时间为8～12h。
4.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，步骤(2)所述发酵培养在摇床上进行，温度为25～35℃，振荡频率为150～300rpm；所述发酵培养的时间为36～48h。
5.权利要求1所述酿酒酵母SWGCJM001或利用权利要求2～4任一项所述培养方法培养得到的酿酒酵母SWGCJM001菌体在生物合成L-木糖中的应用。
6.一种生物合成L-木糖的方法，其特征在于，以木糖醇为底物，以权利要求1所述酿酒酵母SWGCJM001或利用权利要求2～4任一项所述培养方法培养得到的酿酒酵母SWGCJM001菌体为催化剂，在磷酸盐缓冲液的环境中反应5～60h，分离纯化后得所述L-木糖。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述反应的温度为20～50℃，pH值为5.0～7.0； 所述底物和催化剂的质量比为1～100：0.1～20。
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