CN114134057A - 一株酿酒酵母swgcjm001及其培养方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株生物催化合成L‑木糖的酿酒酵母SWGCJM001及其培养方法和应用,属于功能菌开发技术领域。本发明所述酿酒酵母SWGCJM001的保藏编号为CGMCC No.20832。所述菌株是一种能够以木糖醇为底物催化合成L‑木糖的新菌种,通过该菌种能够实现L‑木糖高纯度的制备,其转化率100%,光学纯度达到100%。使用本发明的菌株进行不对称还原工艺,反应条件温和,节能,环保,更重要的是显著提高L‑木糖的经济效益,具有很好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于功能菌开发技术领域,具体涉及一株酿酒酵母SWGCJM001及其培养方法和应用。
背景技术
木糖是一种五碳糖,具有D-和L-两种构型。D-木糖主要存在于植物和动物体内,L-木糖在自然界中不存在,而L-木糖广泛应用于医药、食品、化工等领域。L-木糖作为医药中间体,在抗癌、抗病毒、抗炎症、抗糖尿病等方面发挥着重要作用,在食品方面,L-木糖能改善人体的微生物环境,提高机体免疫能力,是糖尿病人理想的甜味剂,还可作为原料用于合成一种健康甜味剂木糖醇。
木糖不是一种天然存在的化合物,只有通过化学合成法和生物转化法合成得到。最早的化学合成法为1950年美国专利US2584129A报道的。1955年,Courtois,J.E.报道以2,4-O-苄烯-D-山梨醇为原料,采用先氧化后水解的两步法合成L-木糖,但是该方法使用的催化氧化剂极不稳定,特别容易分解,反应过程很难控制。2003年,美国专利20030097029中报道用L-木糖酸在钉催化剂作用下加氢还原生成L-木糖,反应压力5MPa,反应时间18h,反应压力大,反应时间长,且在此条件下L-木糖会继续过度还原生成木糖醇,所得一木糖纯度不高。2017年,中国专利108276455A中报道了利用2,4-0-苄烯-L-木糖为底物在酸催化剂作用下合成L-木糖,产品收率为80%左右,产品纯度为98%,副产物产生较多,纯化难度大,现阶段仍仅限于实验室研究,不能满足工业生产的要求。
因此提供一种L-木糖的合成方法,解决现有技术中L-木糖的合成工艺压力过高,反应时间长,反应过程控制难,后处理繁琐,不易工业化的问题成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一株生物催化合成L-木糖的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SWGCJM001及培养方法和应用,并高效立体选择性地以木糖醇为底物催化合成L-木糖。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一株生物催化合成L-木糖的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SWGCJM001,所述酿酒酵母SWGCJM001已完成保藏,保藏编号为CGMCCNo.20832。
优选的,所述酿酒酵母SWGCJM001的28S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明提供了一种鉴定上述酿酒酵母SWGCJM001的引物对,所述引物对包括引物F和引物R,所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述引物R的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
本发明提供了一种鉴定上述酿酒酵母SWGCJM001的方法,包括以下步骤:以菌株的基因组DNA为模板,与上述引物对混合成PCR体系进行PCR扩增,扩增产物与SEQ ID No.1所示序列一致,则认为是所述酿酒酵母SWGCJM001。
本发明提供了上述酿酒酵母SWGCJM001的培养方法,包括以下步骤:(1)将酿酒酵母SWGCJM001接种至种子培养基中进行活化培养,得种子液;所述种子培养基包括以下重量百分含量的原料:3~6%葡萄糖、0.2~0.8%酵母膏、0.1~0.3%(NH4)2SO4、0.1~0.3%KH2PO4和0.1~0.3%MgSO4·7H2O,pH值为5~6;
2)将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养,将发酵液离心后,收集沉淀,得酿酒酵母SWGCJM001菌体;所述发酵培养基包含以下重量百分含量的原料:10~20%葡萄糖、0.1~0.3%酵母膏、0.1~0.3%(NH4)2SO4和0.1~0.3%KH2PO4,pH值为5~6。
优选的,步骤(1)所述活化培养的温度为25~35℃,活化培养的时间为8~12h。
优选的,步骤(2)所述发酵培养在摇床上进行,温度为25~35℃,震荡频率为150~300rpm;所述发酵培养的时间为36~48h。
本发明还提供了上述酿酒酵母SWGCJM001或利用上述培养方法培养得到的酿酒酵母SWGCJM001菌体在生物合成L-木糖中的应用。
本发明还提供了一种生物合成L-木糖的方法,以木糖醇为底物,以上述酿酒酵母SWGCJM001或利用上述培养方法培养得到的酿酒酵母SWGCJM001菌体为催化剂,在磷酸盐缓冲液的环境中反应5~60h,分离纯化后得所述L-木糖。
优选的,所述反应的温度为20~50℃,pH值为5.0~7.0;
所述底物和催化剂的质量比为1~100:0.1~20。
有益效果:本发明提供一株生物催化合成L-木糖的酿酒酵母SWGCJM001,菌株SWGCJM001的菌落如图1所示,呈乳橙色,表面光滑,不透明,边缘整齐。本发明所述菌株SWGCJM001能够以木糖醇为底物催化合成L-木糖,其转化率100%,光学纯度达到100%,产品纯度大于99.90%,产品收率90%以上。使用本发明所述菌株SWGCJM001进行不对称还原工艺,反应条件温和,节能,环保,更重要的是显著提高了经济效益,具有很好的工业应用前景。
生物保藏信息
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),菌株编号为SWGCJM001,于2020年9月27日保藏至保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,100101,保藏编号为CGMCC No.20832。
附图说明
图1为酿酒酵母SWGCJM001的菌落形态;
图2为木糖醇和L-木糖的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一株生物催化合成L-木糖的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)SWGCJM001,酿酒酵母SWGCJM001的保藏编号为CGMCC No.20832。
本发明所述菌株SWGCJM001从土壤中分离筛选得到,菌体圆形或卵圆形,单端出芽或两边芽殖;生理生化特性中,阳性项目:长温度为4~40℃,能够耐受7~10%氯化钠,能够V-P,硝酸盐还原,淀粉水解,明胶液化,可以利用柠檬酸,果糖,L-阿拉伯糖,甘露醇,葡萄糖,蔗糖,络氨酸为碳源;阴性项目:不能利用木糖、D-阿拉伯糖、苯丙氨酸为碳源。甲基红试验、接触酶和氧化酶试验为阳性,不产过氧化氢和硫化氢。所述菌株SWGCJM001的菌落如图2所示,呈乳橙色,表面光滑,不透明,边缘整齐;经28S rDNA测序,其序列优选如SEQ ID No.1所示(622bp):TATTTCTTCTGTTTGCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGT TTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACCCACGGGAACCAC。
本发明提供了一种鉴定上述酿酒酵母SWGCJM001的引物对,所述引物对包括引物F和引物R,所述引物F(NL1)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述引物R(NL4)的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
利用本发明所述引物对,可扩增所述酿酒酵母SWGCJM001基因组的28S rDNA,产物为622bp。
本发明提供了一种鉴定上述酿酒酵母SWGCJM001的方法,包括以下步骤:以菌株的基因组DNA为模板,与上述引物对混合成PCR体系进行PC R扩增,扩增产物扩增产物与SEQID No.1所示序列一致,则认为是所述酿酒酵母SWGCJM001。
本发明所述PCR体系以20μL计,优选包括:基因组DNA 1μL,NL1、NL4引物各0.5μL,2×TransStart KD Plus PCR SuperMix 10μL,超纯水8μL。
本发明所述PCR扩增的程序优选包括:94℃4min;94℃15s,55℃15s,72℃40s,30个循环;72℃2min。
本发明还提供了上述酿酒酵母SWGCJM001的培养方法,包括以下步骤:
1)将酿酒酵母SWGCJM001接种至种子培养基中进行活化培养,得种子液;所述种子培养基包括以下重量百分含量的原料:3~6%葡萄糖、0.2~0.8%酵母膏、0.1~0.3%(NH4)2SO4、0.1~0.3%KH2PO4和0.1~0.3%MgSO4·7H2O,pH值为5~6;
2)将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养,将发酵液离心后,收集沉淀,得酿酒酵母SWGCJM001菌体;所述发酵培养基包含以下重量百分含量的原料:10~20%葡萄糖、0.1~0.3%酵母膏、0.1~0.3%(NH4)2SO4和0.1~0.3%KH2PO4,pH值为5~6。
本发明将酿酒酵母SWGCJM001接种至种子培养基中进行活化培养,得种子液;所述接种的方式优选包括单菌落接种。本发明所述种子培养基优选包括以下重量百分含量的原料:5%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.2%(NH4)2SO4、0.2%KH2PO4和0.1%MgSO4·7H2O,pH值为5~6。本发明所述活化培养的温度优选为25~35℃,活化培养的时间优选为8~12h。本发明在进行所述活化培养时,优选在摇床上进行,转速优选为250rpm。
本发明将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养,将发酵液离心后,收集沉淀,得酿酒酵母SWGCJM001菌体;所述接种的接种量优选为0.1~10%(v/v),更优选为1~5%。本发明所述发酵培养基优选包含以下重量百分含量的原料:15%葡萄糖、0.2%酵母膏、0.2%(NH4)2SO4和0.1%KH2PO4,pH值为5~6。本发明所述发酵培养优选在摇床上进行,并设置温度25~35℃,震荡频率150~300rpm,更优选250rpm;所述发酵培养的时间为36~48h。
本发明所述发酵培养基中葡萄糖的浓度优选为10~45g/L,酵母膏的浓度优选为10~50g/L。
本发明所述离心的转速优选为7000~9000rpm,更优选为8000rpm,所述离心的时间优选为15~20min。本发明优选弃去所述离心后的上清液,更优选将离心后的沉淀经生理盐水洗涤,得到所述菌体。
本发明还提供了上述酿酒酵母SWGCJM001或利用上述培养方法培养得到的酿酒酵母SWGCJM001菌体在生物合成L-木糖中的应用。
本发明所述酿酒酵母SWGCJM001可以木糖醇为碳源进行培养和发酵。
本发明还提供一种生物合成L-木糖的方法,以木糖醇为底物,以上述酿酒酵母SWGCJM001或利用上述培养方法培养得到的酿酒酵母SWGCJM001菌体为催化剂,在磷酸盐缓冲液的环境中反应5~60h,分离纯化后得所述L-木糖。
本发明所述底物和催化剂的质量比优选为1~100:0.1~20,更优选为50~80:5~15,最优选为60:10。
本发明所述反应的温度优选为20~50℃,pH值优选为5.0~7.0。
在本发明中,所述分离纯化的方法优选包括低温结晶方法;经过高效液相色谱方法鉴定,所得发酵产物为手性化合物L-木糖。
下面结合实施例对本发明提供的一株酿酒酵母SWGCJM001及其培养方法和应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
在本发明中,如未特别说明,所用的试剂、材料和仪器均应当被理解为本领域的常规产品,可通过购买得到。
实施例1
酿酒酵母SWGCJM001的分离筛选和鉴定
将从农田中随机采集的土壤样本用无菌水以1:100(W/V)稀释,涂布于筛选平板培养基,筛选平板培养基(pH 7.0)包括:1%磷酸二氢钾、0.3%磷酸氢二氨、0.5%酵母抽提物、1%胰蛋白胨、5%木糖醇、15%琼脂。在30℃下培养48h,然后挑选单个菌落分别接种至液体筛选培养基中,在30℃下,200rpm培养48h。培养物以8000rpm离心10min后,将菌体分别加入反应液中进行反应,反应液包括5%木糖醇、pH 7.0 50mM磷酸钾缓冲液中,250rpm30℃反应24h。反应液12000rpm离心后,进行液相高效色谱检测(HPLC)。
HPLC检测条件为:柱子:Aminex HPX-87H柱(300×7.8mm);流动相:5mM硫酸;流速:5mL/min;柱箱温度:40℃;检测器:RID。L-木糖标准品出峰时间为11.1min左右,木糖醇标准品出峰时间为12.8min左右。反应液检测后得到一株菌株具有以木糖醇为底物合成L-木糖的菌株。
经镜检,该菌体圆形或卵圆形,单端出芽或两边芽殖,菌落呈乳橙色,表面光滑,不透明,边缘整齐(图1)。生理生化特性中,阳性项目:长温度为4~40℃,能够耐受7~10%氯化钠,能够V-P,硝酸盐还原,淀粉水解,明胶液化,可以利用柠檬酸,果糖,L-阿拉伯糖,甘露醇,葡萄糖,蔗糖,络氨酸为碳源;阴性项目:不能利用木糖、D-阿拉伯糖、苯丙氨酸为碳源。甲基红试验、接触酶和氧化酶试验为阳性,不产过氧化氢和硫化氢。
以NL1、NL4引物扩增28S rDNA,得到大小约600bp扩增产物,经测序后序列全长为622bp,将序列在NCBI数据库中进行BLAST序列相似性比对,鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),命名为酿酒酵母SWGCJM001,保藏编号为CGMCC No.20832。
实施例2
酿酒酵母SWGCJM001的发酵培养
种子培养基:5%葡萄糖、0.5%酵母膏、0.2%(NH4)2SO4、0.2%KH2PO4,0.1%MgSO4·7H2O,pH值为5.5;发酵培养基:15%葡萄糖、0.2%酵母膏、0.2%(NH4)2SO4、0.1%KH2PO4,溶剂为蒸馏水,pH值调至5.5。种子培养基在115℃高温灭菌25min,冷却后接种,摇瓶培养,装液量为30%。
具体的培养步骤:取-70℃保存的菌种在种子固体平板上划线,挑取单菌落接于种子液体培养基中,30℃,250rpm转速培养12小时,将种子按照5%的接种量接种于发酵培养基中,30℃,250rpm振荡培养24小时,培养结束后发酵液离心并利用生理盐水洗涤2次,收集湿菌体细胞,菌体湿重达到20g/L。
实施例3
L-木糖的生产
在10L催化体系中,加入600g木糖醇,缓冲液用pH7.0磷酸缓冲溶液,搅拌,加入酿酒酵母SWGCJM001菌株10g,开始反应。35℃反应12h结束后,经液相色谱检测溶液中的L-木糖浓度可达44.79g/L,转化率达到96.54%以上。反应结束后,反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到427.72g成品。经检测该成品L-木糖手性纯度为100%,产品纯度为99.90%,产品收率为95.5%。
实施例4
L-木糖的生产
在10L催化体系中,加入600g木糖醇,缓冲液用pH7.0磷酸钾缓冲溶液,搅拌,加入酿酒酵母SWGCJM001菌株10g,开始反应。40℃反应12h结束后,经液相色谱检测溶液中的L-木糖浓度可达46.39g/L,转化率达到100%以上。反应结束后,反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到443.97g成品。经检测该成品L-木糖手性纯度为100%,产品纯度为99.93%,产品收率为95.7%。
实施例5
L-木糖的生产
在10L催化体系中,加入600g木糖醇,缓冲液用pH7.0磷酸钾缓冲溶液,搅拌,加入酿酒酵母SWGCJM001菌株10g,开始反应。50℃反应12h结束后,经液相色谱检测溶液中的L-木糖浓度可达42.32g/L,转化率达到91.23%以上。反应结束后,反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到382.18g成品。经检测该成品L-木糖手性纯度为100%,产品纯度为99.32%,产品收率为90.3%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>河北省科学院生物研究所
<120>一株酿酒酵母SWGCJM001及其培养方法和应用
<160>3
<170>SIPOSequenceListing 1.0
<210>1
<211>622
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>1
TATTTCTTCTGTTTGCGGAGGAAAAGAAACCAACCGGGATTGCCTTAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACCCACGGGAACCAC
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列(artificial sequence)
<400>2
gcatatcaataagcggaggaaaag
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列(artificial sequence)
<400>3
ggtccgtgtttcaagacgg
序列表
<110> 河北省科学院生物研究所
<120> 一株酿酒酵母SWGCJM001及其培养方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 622
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
gcatatcaat aagcggagga aaag 24
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
ggtccgtgtt tcaagacgg 19
Claims (10)
1.一株生物催化合成L-木糖的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SWGCJM001,其特征在于,所述酿酒酵母SWGCJM001已完成保藏,保藏编号为CGMCC No.20832。
2.根据权利要求1所述酿酒酵母SWGCJM001,其特征在于,所述酿酒酵母SWGCJM001的28S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种鉴定权利要求1或2所述酿酒酵母SWGCJM001的引物对,其特征在于,所述引物对包括引物F和引物R,所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示,所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
4.一种鉴定权利要求1或2所述酿酒酵母SWGCJM001的方法,其特征在于,包括以下步骤:以菌株的基因组DNA为模板,与权利要求3所述引物对混合成PCR体系进行PCR扩增,扩增产物与SEQ ID No.1所示序列一致,则认为是所述酿酒酵母SWGCJM001。
5.权利要求1或2所述酿酒酵母SWGCJM001的培养方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)将酿酒酵母SWGCJM001接种至种子培养基中进行活化培养,得种子液;所述种子培养基包括以下重量百分含量的原料:3~6%葡萄糖、0.2~0.8%酵母膏、0.1~0.3%(NH4)2SO4、0.1~0.3%KH2PO4和0.1~0.3%MgSO4·7H2O,pH值为5~6;
2)将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养,将发酵液离心后,收集沉淀,得酿酒酵母SWGCJM001菌体;所述发酵培养基包含以下重量百分含量的原料:10~20%葡萄糖、0.1~0.3%酵母膏、0.1~0.3%(NH4)2SO4和0.1~0.3%KH2PO4,pH值为5~6。
6.根据权利要求5所述培养方法,其特征在于,步骤(1)所述活化培养的温度为25~35℃,活化培养的时间为8~12h。
7.根据权利要求5所述培养方法,其特征在于,步骤(2)所述发酵培养在摇床上进行,温度为25~35℃,震荡频率为150~300rpm;所述发酵培养的时间为36~48h。
8.权利要求1或2所述酿酒酵母SWGCJM001或利用权利要求5~7任一项所述培养方法培养得到的酿酒酵母SWGCJM001菌体在生物合成L-木糖中的应用。
9.一种生物合成L-木糖的方法,其特征在于,以木糖醇为底物,以权利要求1或2所述酿酒酵母SWGCJM001或利用权利要求5~7任一项所述培养方法培养得到的酿酒酵母SWGCJM001菌体为催化剂,在磷酸盐缓冲液的环境中反应5~60h,分离纯化后得所述L-木糖。
10.根据权利要求9所述方法,其特征在于,所述反应的温度为20~50℃,pH值为5.0~7.0;
所述底物和催化剂的质量比为1~100:0.1~20。
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