CN1824767A

CN1824767A - 一种生产木糖醇的方法及其专用菌株

Info

Publication number: CN1824767A
Application number: CN 200510008756
Authority: CN
Inventors: 江宁; 贺鹏; 卢大军; 沈安; 王淑豪
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2005-02-25
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2006-08-30
Anticipated expiration: 2025-02-25
Also published as: CN100390271C

Abstract

本发明公开了一种生产木糖醇的方法及其专用菌株。本发明所提供的用于生产木糖醇的菌株是含有木糖还原酶基因的酿酒酵母，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XG521 CGMCC No.1307。本发明所提供的生产木糖醇的方法，是发酵含有木糖还原酶基因的酿酒酵母，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XG521 CGMCC No.1307得到木糖醇。本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XG521 CGMCC No.1307不仅能用木糖为原料生产木糖醇，还能利用木糖生产过程中的木糖母液作为主要原料发酵生产木糖醇。转化率可达0.9克(木糖醇)/克(木糖)，产率可达1克(木糖醇)/升·小时。

Description

一种生产木糖醇的方法及其专用菌株

技术领域

本发明涉及生物技术领域中一种生产木糖醇的方法及其专用菌株。

背景技术

木糖醇是存在于黄梅、覆盆子、草霉、莴苣、花椰菜等许多水果和蔬菜中的一种天然五碳糖醇。作为一种甜味剂，由于它不会导致龋齿，且具有较高的甜度，近年来已引起人们越来越多的注意。木糖醇的代谢无须胰岛素的调节，因此在临床上被用作糖尿病患者食物中的蔗糖的替代品。同时，它的代谢过程也无须6-磷酸葡萄糖脱氢酶的作用，因此它也是6-磷酸葡萄糖脱氢酶缺乏症患者理想的食用甜味剂。最近国外医药研究人员发现：木糖醇还可用于防止病人肺部感染等症(www.cpha.org.cn/html/content/add/hlyy_xhzy_73.htm.htm)。

由于木糖醇在水果和蔬菜中的含量很低，直接提取困难而不经济。目前工业上生产木糖醇主要用木糖化学催化加氢的方法。但是化学催化加氢法工艺复杂、成本较高，因此，随着生物技术的发展，化学法有被微生物发酵法逐步取代的趋势。

用于发酵法制备木糖醇的微生物几乎都是酵母菌，既有自然菌种，也有基因工程菌。目前，自然菌种的生产水平为：转化率0.56～0.74克(木糖醇)/克(木糖)，产率0.2～0.5克(木糖醇)/升·小时；基因工程菌的生产水平为：转化率可接近理论值，约0.9克(木糖醇)/克(木糖)，产率0.6～1.0克(木糖醇)/升·小时(Leathers：FEMS Yeast Research，3 133-140，2003)。在木糖醇的生产中，基因工程菌优于自然菌种，但需要添加葡萄糖、乙醇、乙酸、甘油等作为辅底物来再生辅酶。

木糖母液是生产木糖的副产物，色泽深、粘度大，除含木糖外，还含有较多的葡萄糖、阿拉伯糖等杂糖，利用价值很小。

发明内容

本发明的目的是提供一种可利用木糖母液生产木糖醇的酵母菌。

本发明所提供的酵母菌，是含有木糖还原酶基因(XYL1)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

所述木糖还原酶基因为Amore，R等报道的序列(Gene，109(1)：89-97，1991)。可通过常规的基因工程技术将所述木糖还原酶基因导入酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)得到含有所述木糖还原酶基因(XYL1)的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。

所述含有木糖还原酶基因(XYL1)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XG521，已于2005年01月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏中心登记入册的编号为CGMCC No.1307。该菌株细胞呈卵圆型，菌落为乳白色，表面湿润、粘稠。

本发明的另一个目的是提供一种低成本且具有较高产率的木糖醇生产方法。

本发明所提供的木糖醇生产方法，是发酵含有木糖还原酶基因(XYL1)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)得到木糖醇。

所述木糖还原酶基因为Amore，R等报道的序列(Gene，109(1)：89-97，1991)。

所述含有木糖还原酶基因(XYL1)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XG521 CGMCC No.1307。

所述方法中，发酵温度可为24-37℃，发酵时间可为16-96h；最适发酵温度为28-32℃。

所述方法中，发酵培养基含有碳源和氮源；所述碳源为木糖和葡萄糖；所述氮源为蛋白胨和/或酵母提取物和/或牛肉膏和/或玉米浆和/或铵盐。

所述木糖可为成品木糖但不限于成品木糖，还包括含木糖的半纤维素(玉米芯、甘蔗渣、碎木、秸秆等)水解液，木糖母液和其他含木糖的液体。

所述葡萄糖可为成品葡萄糖但不限于成品葡萄糖，还包括含葡萄糖的淀粉水解糖，纤维素水解糖和其他含葡萄糖的液体。

所述发酵培养基具体可包括5％～50％木糖母液，0～10％木糖和0～10％葡萄糖，0.3-3.0％氮源，pH4.0-6.5；所述百分含量均为质量百分含量。

本发明的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XG521 CGMCC No.1307不仅能用木糖为原料生产木糖醇，还能利用木糖生产过程中的木糖母液作为主要原料发酵生产木糖醇。转化率可达0.9克(木糖醇)/克(木糖)，产率可达1克(木糖醇)/升·小时。本发明实现了利用价格低廉的木糖母液生产木糖醇，可使生产成本大幅度降低，具有很好的应用前景。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。下述实施例中的百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XG521 CGMCC No.1307的获得

按照J.Sambrook编著的《Molecular Cloning(分子克隆操作指南)》CSHL出版社第三版(2001)所述的实验方法，以毕赤酵母(Pichia stipitii)IF010063(购自大阪发酵研究所Institute for Fermentation，OSAKA)的基因组DNA为模板，在上游引物GCTCTAGATGCCTTCTATTAAGTTGAAC和下游引物ATGGATCCTTAGACGAAGATAGGAATC的引导下，通过PCR获得毕赤酵母(Pichiastipitii)IF010063的木糖还原酶基因XYL1，并将XYL1的编码序列与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GPD1启动子序列(序列表中的序列1)和终止子cyc1序列(序列表中的序列2)连接构成重组表达框。将保存在斜面培养基(2％葡萄糖，1％酵母膏，1％蛋白胨，2％琼脂，自然pH)上的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)接种到50毫升含1％葡萄糖、1％酵母提取物和1％蛋白胨的培养基中，于30℃培养过夜后，按照《酵母遗传学方法实验指南》(A.亚当斯等著，刘子铎译，科学出版社，2000)的方法，将上述表达框以同源重组的方式整合于酿酒酵母染色体的18S rDNA序列上，得到重组的工程菌Saccharomyces cerevisiae XG521。

实施例2、制备木糖醇

将30毫升发酵培养基装于250毫升三角瓶中，发酵培养基的组成为：木糖8％，酵母抽提物1％，蛋白胨3％，葡萄糖4％，pH为5.0。接入酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)XG521 CGMCC No.1307，于28℃旋转摇床上培养，摇床转速为200rpm。发酵过程中，每24小时流加葡萄糖至终浓度1％。培养64小时后停止发酵，将得到的发酵液调pH至4.5，加入粉末状活性碳，于80℃搅拌2小时。过滤除去活性炭后得到清液。用711阴离子交换树脂和732阳离子交换树脂对清液进行脱离子和杂质的处理，得到pH为中性，颜色为浅黄色的液体。液体用真空旋转蒸发器浓缩至初始体积的1/10，浓缩温度为60℃。将浓缩液置于烧杯中缓慢降温至结晶产生。用布氏漏斗对结晶液进行抽滤，得到白色的木糖醇晶体。晶体干燥后测定木糖醇纯度为99％。发酵液中木糖醇的浓度为7.2％。用DNS法测定发酵液中剩余木糖的浓度，结果表明发酵液中木糖的浓度为0.6％，转化率为0.973克(木糖醇)/克(木糖)，产率为1.125克(木糖醇)/升·小时。

实施例3、制备木糖醇

将30毫升发酵培养基装于250毫升三角瓶中，发酵培养基的组成为：稀释至木糖浓度为5％，葡萄糖浓度为3％的木糖结晶母液(木糖结晶母液购自山东威龙工业集团有限责任公司)，酵母抽提物1％，玉米浆3％，硫酸铵1％，pH为5.0。接入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XG521 CGMCC No.1307，于32℃旋转摇床上培养，摇床转速为220rpm。发酵72小时，按照实施例2的方法纯化发酵液中的木糖醇，木糖醇的纯度为99％，发酵液中木糖醇的浓度为4.4％。发酵液中木糖的浓度为0.5％，转化率为0.978克(木糖醇)/克(木糖)，产率为0.611克(木糖醇)/升·小时。

实施例4、制备木糖醇

500毫升种子培养基装于3000毫升三角瓶中，种子培养基组成：葡萄糖2％，酵母抽提物1％，牛肉膏1％，蛋白胨1％，pH为5.0。接入酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)XG521 CGMCC No.1307，于30℃旋转摇床上培养，摇床转速为220rpm，培养18小时后，转入装有2.3升发酵培养基的发酵罐中开始发酵。发酵培养基组成为：稀释至木糖浓度为8％，葡萄糖浓度为3％的木糖结晶母液(木糖结晶母液购自山东威龙工业集团有限责任公司)，酵母抽提物1％，玉米浆3％，硫酸铵1％。发酵过程中，搅拌转速为300-350rpm，温度为30℃，pH为5.0，葡萄糖按0.4克/升·小时流加。84小时后停止发酵。按照实施例2的方法纯化发酵液中的木糖醇，木糖醇的纯度为99％，发酵液中木糖醇的浓度为7.1％。发酵液中木糖的浓度为0.8％，转化率为0.986克(木糖醇)/克(木糖)，产率为0.845克(木糖醇)/升·小时。

序列表

<160>2

<210>1

<211>670

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>1

ctcagtttat cattatcaat actcgccatt tcaaagaata cgtaaataat taatagtagt 60

gattttccta actttattta gtcaaaaaat tagcctttta attctgctgt aacccgtaca 120

tgcccaaaat agggggcggg ttacacagaa tatataacat cgtaggtgtc tgggtgaaca 180

gtttattcct ggcatccact aaatataatg gagcccgctt tttaagctgg catccagaaa 240

aaaaaagaat cccagcacca aaatattgtt ttcttcacca accatcagtt cataggtcca 300

ttctcttagc gcaactacag agaacagggg cacaaacagg caaaaaacgg gcacaacctc 360

aatggagtga tgcaacctgc ctggagtaaa tgatgacaca aggcaattga cccacgcatg 420

tatctatctc attttcttac accttctatt accttctgct ctctctgatt tggaaaaagc 480

tgaaaaaaaa ggttgaaacc agttccctga aattattccc ctacttgact aataagtata 540

taaagacggt aggtattgat tgtaattctg taaatctatt tcttaaactt cttaaattct 600

acttttatag ttagtctttt ttttagtttt aaaacaccaa gaacttagtt tcgacggatc 660

tagaactagt 670

<210>2

<211>271

<212>DNA

<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400>2

cgtcgacctc gagtcatgta attagttatg tcacgcttac attcacgccc tccccccaca 60

tccgctctaa ccgaaaagga aggagttaga caacctgaag tctaggtccc tatttatttt 120

tttatagtta tgttagtatt aagaacgtta tttatatttc aaatttttct tttttttctg 180

tacagacgcg tgtacgcatg taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga 240

cgctcgaagg ctttaatttg caagctggta c 271

Claims

1、含有木糖还原酶基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

2、根据权利要求1所述的含有木糖还原酶基因的酿酒酵母，其特征在于：所述含有木糖还原酶基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XG521 CGMCC No.1307。

3、一种生产木糖醇的方法，是发酵含有木糖还原酶基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)得到木糖醇。

4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述含有木糖还原酶基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)XG521 CGMCC No.1307。

5、根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述方法中，发酵温度为24-37℃；发酵时间为16-96h。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵温度为28-32℃。

7、根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述方法中，发酵培养基含有碳源和氮源；所述碳源为木糖和葡萄糖；所述氮源为蛋白胨和/或酵母提取物和/或牛肉膏和/或玉米浆和/或铵盐。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述木糖来源于含木糖的半纤维素水解液或木糖母液。

9、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述葡萄糖来源于淀粉水解糖或纤维素水解糖。

10、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基包括5％～50％木糖母液，0～10％木糖和0～10％葡萄糖，0.3-3.0％氮源，pH4.0-6.5；所述百分含量均为质量百分含量。