CN112501073B

CN112501073B - 一株海水芽孢杆菌swgc31及其培养方法和应用

Info

Publication number: CN112501073B
Application number: CN202011472053.5A
Authority: CN
Inventors: 贾振华; 李冉; 宋聪; 张翔; 宋水山; 孙劲冲
Original assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority date: 2020-12-15
Filing date: 2020-12-15
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-12-15
Also published as: CN112501073A

Abstract

本发明提供了一株海水芽孢杆菌SWGC31及其培养方法和应用，属于功能菌开发技术领域。生物催化合成L‑木糖的海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)，SWGC31，保藏编号为CGMCC No.13351。所述菌株是一种能够以2‑酮基‑L‑古龙酸为底物催化合成L‑木糖的新菌种，该菌株能够表达产生脱羧酶，通过该菌种能够实现L‑木糖高纯度的制备，其转化率100％，光学纯度达到100％。使用本发明的菌株进行不对称还原工艺，反应条件温和，节能，环保，更重要的是显著提高L‑木糖的经济效益，具有很好的工业应用前景。

Description

一株海水芽孢杆菌SWGC31及其培养方法和应用

技术领域

本发明属于功能菌开发技术领域，具体涉及一株海水芽孢杆菌SWGC31及其培养方法和应用。

背景技术

木糖是一种五碳糖，具有D-和L-两种构型。D-木糖主要存在于植物和动物体内，L-木糖在自然界中不存在，而L-木糖广泛应用于医药、食品、化工等领域。L-木糖作为医药中间体，在抗癌、抗病毒、抗炎症、抗糖尿病等方面发挥着重要作用，在食品方面，L-木糖能改善人体的微生物环境，提高机体免疫能力，是糖尿病人理想的甜味剂，还可作为原料用于合成一种健康甜味剂木糖醇。

木糖不是一种天然存在的化合物，只有通过化学合成法和生物转化法合成得到。最早的化学合成法为1950年美国专利US2584129A报道的。1955年，Courtois，J.E.报道以2,4-O-苄烯-D-山梨醇为原料，采用先氧化后水解的两步法合成L-木糖，该方法的缺点是使用的催化氧化剂极不稳定，特别容易分解，反应过程很难控制。2003年，美国专利20030097029中报道用L-木糖酸在钉催化剂作用下加氢还原生成L-木糖，反应压力5MPa，反应时间18h，反应压力大，反应时间长，且在此条件下L-木糖会继续过度还原生成木糖醇，所得一木糖纯度不高。2017年，中国专利108276455A中报道了利用2,4-0-苄烯-L-木糖为底物在酸催化剂作用下合成L-木糖，产品收率为80％左右，产品纯度为98％，副产物产生较多，纯化难度大，现阶段仍仅限于实验室研究，不能满足工业生产的要求。

生物转化法的报道较少。2002年，Yadav，K.K.等人报道半乳糖氧化酶在生物载体中可以合成L-木糖。2012年，Usvalampi，Anne等人报道可利用木酮糖在大肠杆菌-L-岩藻糖异构酶的作用下选择性生成L-木糖。2017年，中国专利108165591A报道了以2-酮基-L-古龙酸为底物利用工程菌催化合成L-木糖的研究，其转化率最高为94％左右，但是由于其工艺目前还不成熟，现阶段仍仅限于实验室研究，要想在工业上得到大规模地应用，还有待于基因工程的进一步发展以解决生物催化剂的稳定性和反应速度的问题。

因此提供一种L-木糖的合成方法，解决现有技术中L-木糖的合成工艺压力过高，反应时间长，反应过程控制难，后处理繁琐，不易工业化的问题成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一株生物催化合成L-木糖的海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)SWGC31及培养方法和应用，所述菌株可表达脱羧酶，并高效立体选择性地以2-酮基-L-古龙酸为底物催化合成L-木糖。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一株生物催化合成L-木糖的海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)SWGC31，海水芽孢杆菌SWGC31的保藏编号为CGMCC No.13351。

优选的是，所述海水芽孢杆菌SWGC31的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的另一个目的是提供上述海水芽孢杆菌SWGC31的培养方法，包括以下步骤：(1)将海水芽孢杆菌SWGC31接种至种子培养基中进行活化培养，得种子液；所述种子培养基包括LB培养基；

2)将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养，将发酵液离心后，收集沉淀，得海水芽孢杆菌SWGC31菌体；所述发酵培养基为包含葡萄糖和酵母膏的海水溶液，pH值为6～8。

优选的是，步骤(1)中所述活化培养的温度为25～35℃，活化培养的时间为8～12h。

优选的是，步骤(2)中所述接种的接种量为0.1～10％。

优选的是，步骤(2)中发酵培养在摇床上进行，并设置温度25～35℃，震荡频率150～300rpm；所述发酵培养的时间为36～48h。

优选的是，所述发酵培养基中葡萄糖的浓度为10～45g/L，酵母膏的浓度为10～50g/L。

本发明的另一个目的是提供上述海水芽孢杆菌SWGC31或利用上述培养方法培养得到的海水芽孢杆菌SWGC31菌体在生物合成L-木糖中的应用。

本发明的最后一个目的是提供一种生物合成L-木糖的方法，以2-酮基-L-古龙酸为底物，以上述海水芽孢杆菌SWGC31或利用上述培养方法培养得到的海水芽孢杆菌SWGC31菌体为催化剂，在磷酸盐缓冲液的环境中进行还原反应5～60h，分离纯化后得所述L-木糖。

优选的是，所述还原反应的温度为20～50℃，pH值为5.0～7.0；

所述底物和催化剂的质量比为1～100：0.1～20。

本发明提供一株生物催化合成L-木糖的海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)SWGC31，菌体直杆状，链状排列；椭圆形，膨大孢子囊，革兰氏阳性；生理生化特性中，阳性项目：生长温度为4～40℃，能够耐受7～10％氯化钠，能够V-P，硝酸盐还原，淀粉水解，明胶液化，可以利用柠檬酸，果糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，葡萄糖，蔗糖，络氨酸为碳源；阴性项目：吲哚反应，木糖，D-阿拉伯糖，苯丙氨酸。甲基红试验、接触妹和氧化酶试验为阳性，不产过氧化氢和硫化氢。所述菌株SWGC31的菌落如图2所示，呈乳橙色，表面光滑，低凸起，不透明，边缘整齐。

本发明所述菌株SWGC31能表达脱羧酶，并以2-酮基-L-古龙酸为底物催化合成L-木糖，其转化率100％，光学纯度达到100％。使用本发明所述菌株SWGC31进行不对称还原工艺(图1)，反应条件温和，节能，环保，更重要的是显著提高了经济效益，具有很好的工业应用前景。

生物保藏信息

海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)，菌株编号为SWGC31，于2016年11月28日保藏至保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号为CGMCC No.13351。

附图说明

图1为生物合成L-木糖的流程和反应表达式；

图2为海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)SWGC31的菌落形态。

具体实施方式

本发明所述菌株SWGC31菌体直杆状，链状排列；椭圆形，膨大孢子囊，革兰氏阳性；生理生化特性中，阳性项目：生长温度为4～40℃，能够耐受7～10％氯化钠，能够V-P，硝酸盐还原，淀粉水解，明胶液化，可以利用柠檬酸，果糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，葡萄糖，蔗糖，络氨酸为碳源；阴性项目：吲哚反应，木糖，D-阿拉伯糖，苯丙氨酸。甲基红试验、接触妹和氧化酶试验为阳性，不产过氧化氢和硫化氢。所述菌株SWGC31的菌落如图2所示，呈乳橙色，表面光滑，低凸起，不透明，边缘整齐；经16S rDNA测序，其序列优选如SEQ ID No.1所示(1284bp)：ACCTACGTGGGTAGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCCGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACTCATTTCCTCGCATGAGGAAATGTTGAAAGGTGGCTTTTAGCTATCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTTTAAGGTGATCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGCATTTGGAAACTGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTCTAGCAGACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAGGAATTGACGGGGCCCGCACAAGCTGTGGTGGAGCATGTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGATGACTGCCGGGGATGACAAACCGGAGGAAGGTGGTGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACCAAGGGCAGCAAGGCGAGGTTTAGCCAATCCCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCGCGGTGAATACGTTCCGGACCGCCCTTGTACACGA。

本发明还提供了上述海水芽孢杆菌SWGC31的培养方法，包括以下步骤：(1)将海水芽孢杆菌SWGC31接种至种子培养基中进行活化培养，得种子液；所述种子培养基包括LB培养基；

本发明将海水芽孢杆菌SWGC31接种至种子培养基中进行活化培养，得种子液；所述种子培养基包括LB培养基。本发明所述接种时，优选接种单菌落。本发明所述活化培养的温度优选为25～35℃，活化培养的时间优选为8～12h。本发明在进行所述活化培养时，优选在摇床上进行，转速优选为250rpm。

得种子液后，本发明将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养，将发酵液离心后，收集沉淀，得海水芽孢杆菌SWGC31菌体；所述发酵培养基为包含葡萄糖和酵母膏的海水溶液，pH值为6～8。本发明所述接种的接种量优选为0.1～10％，更优选为1～5％。本发明所述发酵培养优选在摇床上进行，并设置温度25～35℃，震荡频率150～300rpm，更优选250rpm；所述发酵培养的时间为36～48h。

本发明所述发酵培养基中葡萄糖的浓度优选为10～45g/L，酵母膏的浓度优选为10～50g/L。

本发明所述离心的转速优选7000～9000rpm，所述离心的时间优选为15～20min，将固液分离后得到的固相经生理盐水洗涤后，得到菌体。

本发明还提供了上述海水芽孢杆菌SWGC31或利用上述培养方法培养得到的海水芽孢杆菌SWGC31菌体在生物合成L-木糖中的应用。

本发明还提供一种生物合成L-木糖的方法，以2-酮基-L-古龙酸为底物，以上述海水芽孢杆菌SWGC31或利用上述培养方法培养得到的海水芽孢杆菌SWGC31菌体为催化剂，在磷酸盐缓冲液的环境中进行还原反应5～60h，分离纯化后得所述L-木糖。

本发明所述底物和催化剂的质量比优选为1～100：0.1～20，更优选为50～80：5～15，最优选为60：10。

本发明所述磷酸盐缓冲液中优选还包括氯化镁和焦磷酸硫胺素，所述氯化镁的浓度优选为1～10mM，更优选为2～8mM，最优选为3～6mM；所述焦磷酸硫胺素的浓度优选为0～3M，更优选为0.5～2.5M，最优选为1～2M。

本发明所述还原反应的温度优选为20～50℃，pH值优选为5.0～7.0。

在本发明中，所述分离纯化的方法优选包括低温结晶方法；经过高压液相色谱方法鉴定，所得发酵产物为手性化合物L-木糖。

下面结合实施例对本发明提供的一株海水芽孢杆菌SWGC31及其培养方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

海水芽孢杆菌SWGC31的发酵培养

种子培养基：LB培养基；发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏50g/L，溶剂为海水，pH值调至7.0。种子培养基在121℃高温灭菌20min，冷却后接种，摇瓶培养，装液量为30％。

具体的培养步骤：取-70℃保存的菌种在LB固体平板上划线，挑取单菌落接于LB种子液体培养基中，30℃，250rpm转速培养12小时，将种子按照5％的接种量接种于发酵培养基中，30℃，250rpm振荡培养24小时，培养结束后发酵液离心并利用生理盐水洗涤2次，收集湿菌体细胞，菌体湿重达到20g/L。

(1)经生理生化特性试验结果，所述菌株的主要特征如下：

菌落形态：CYC琼脂30℃培养2天，菌落乳橙色，表面光滑，低凸起，不透明，边缘整齐(如图2)。

细胞形态：菌体直杆状，链状排列；椭圆形，膨大孢子囊，革兰氏阳性。

生理生化特性：阳性项目：生长温度为4～40℃，能够耐受7～10％氯化钠，能够V-P，硝酸盐还原，淀粉水解，明胶液化，可以利用柠檬酸，果糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，葡萄糖，蔗糖，络氨酸为碳源；阴性项目：吲哚反应，木糖，D-阿拉伯糖，苯丙氨酸。甲基红试验、接触妹和氧化酶试验为阳性，不产过氧化氢和硫化氢。

(2)采用16SrDNA测序，引物为F：5′agagtttgatcctggctcag3′(SEQ ID No.2)；R：5′ggttaccttgttacgactt3′(SEQ ID No.3)，该菌株16S rDNA扩增产物序列长度为1284bp，鉴定为Bacillus aquimaris，命名为海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)，SWGC31。

序列如下(SEQ ID No.1)：

ACCTACGTGGGTAGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCCGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACTCATTTCCTCGCATGAGGAAATGTTGAAAGGTGGCTTTTAGCTATCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTTTAAGGTGATCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGCATTTGGAAACTGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTCTAGCAGACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAGGAATTGACGGGGCCCGCACAAGCTGTGGTGGAGCATGTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCCTTCGGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGATGACTGCCGGGGATGACAAACCGGAGGAAGGTGGTGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACCAAGGGCAGCAAGGCGAGGTTTAGCCAATCCCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCGCGGTGAATACGTTCCGGACCGCCCTTGTACACGA(SEQ ID No.1)。

实施例2

L-木糖的生产

在10L催化体系中，加入600g2-酮基-L-古龙酸，4mM氯化镁，1.5mM焦磷酸硫胺素，缓冲液用pH7.0磷酸缓冲溶液，搅拌，加入为海水芽孢杆菌SWGC31菌株10g，开始反应。35℃反应12h结束后，经检测溶液中的L-木糖浓度可达44.79g/L，转化率达到96.54％以上。反应结束后，反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到427.72g成品。经检测该成品L-木糖手性纯度为100％，产品纯度为99.90％，产品收率为95.5％。

实施例3

L-木糖的生产

在10L催化体系中，加入600g 2-酮基-L-古龙酸，4mM氯化镁，1.5mM焦磷酸硫胺素，缓冲液用pH7.0磷酸缓冲溶液，搅拌，加入为海水芽孢杆菌SWGC31菌株10g，开始反应。40℃反应12h结束后，经检测溶液中的L-木糖浓度可达46.39g/L，转化率达到100％以上。反应结束后，反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到443.97g成品。经检测该成品L-木糖手性纯度为100％，产品纯度为99.93％，产品收率为95.7％。

实施例4

L-木糖的生产

在10L催化体系中，加入600g2-酮基-L-古龙酸，4mM氯化镁，1.5mM焦磷酸硫胺素，缓冲液用pH7.0磷酸缓冲溶液，搅拌，加入为海水芽孢杆菌SWGC31菌株10g，开始反应。50℃反应12h结束后，经检测溶液中的L-木糖浓度可达42.32g/L，转化率达到91.23％以上。反应结束后，反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到382.18g成品。经检测该成品L-木糖手性纯度为100％，产品纯度为99.32％，产品收率为90.3％。

实施例5

L-木糖的生产

在10L催化体系中，加入600g2-酮基-L-古龙酸，4mM氯化镁，1.5mM焦磷酸硫胺素，缓冲液用pH7.5磷酸缓冲溶液，搅拌，加入为海水芽孢杆菌SWGC31菌株10g，开始反应。40℃反应12h结束后，经检测溶液中的L-木糖浓度可达40.43g/L，转化率达到87.15％以上。反应结束后，反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到368.32g成品。经检测该成品L-木糖手性纯度为100％，产品纯度为99.32％，产品收率为91.1％。

从上述实施例可以看出，温度对底物转化为产物起到一定作用，将对转化率、收率以及产品的品质产生影响，而缓冲溶液的pH也是影响转化效率的一个因素。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一株生物催化合成L-木糖的海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)SWGC31，其特征在于，海水芽孢杆菌SWGC31的保藏编号为CGMCC No.13351。

2.权利要求1所述海水芽孢杆菌SWGC31的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将海水芽孢杆菌SWGC31接种至种子培养基中进行活化培养，得种子液；所述种子培养基包括LB培养基；

(2)将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养，将发酵液离心后，收集沉淀，得海水芽孢杆菌SWGC31菌体；所述发酵培养基为包含葡萄糖和酵母膏的海水溶液，pH值为6～8。

3.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述活化培养的温度为25～35℃，活化培养的时间为8～12h。

4.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述接种的接种量为0.1～10％。

5.根据权利要求2所述培养方法，其特征在于，步骤(2)中发酵培养在摇床上进行，并设置温度25～35℃，震荡频率150～300rpm；所述发酵培养的时间为36～48h。

6.根据权利要求2或5所述培养方法，其特征在于，所述发酵培养基中葡萄糖的浓度为10～45g/L，酵母膏的浓度为10～50g/L。

7.权利要求1所述海水芽孢杆菌SWGC31的菌体在以2-酮基-L-古龙酸为底物生物合成L-木糖中的应用。

8.一种生物合成L-木糖的方法，其特征在于，以2-酮基-L-古龙酸为底物，以权利要求1所述海水芽孢杆菌SWGC31的菌体为催化剂，在磷酸盐缓冲液的环境中进行还原反应5～60h，分离纯化后得所述L-木糖。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述还原反应的温度为20～50℃，pH值为5.0～7.0；

所述底物和催化剂的质量比为1～100：0.1～20。