CN116814482A - 胞外多糖明串珠菌及其发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种胞外多糖明串珠菌及其发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其胞外多糖明串珠菌M1的DNA为序列表中序列<210>1所示，将本发明的胞外多糖明串珠菌M1应用于生产胞外多糖产品中，特别是利用甜菜糖蜜生产胞外多糖的过程中，能够很好适应甜菜糖蜜的基质环境，并高效地利用甜菜糖蜜转化生产胞外多糖。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种高产胞外多糖的明串珠菌，及其利用该明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法。
背景技术
甜菜糖蜜是甜菜制取蔗糖过程产生的高度浓缩褐色液体副产物，水分活度低，含有丰富的碳水化合物、氨基酸、矿质离子等可生物转化利用的营养成分。目前甜菜糖蜜的利用途径主要为加工畜牧业饲料，转化价值低。开发甜菜糖蜜的高值化产品是目前甜菜制糖产业链亟待拓展的重要方向，对于提高下游副产物附加值和综合经济效益具有重要意义。
微生物多糖较植物来源的多糖具有生产方便，不受栽培地气候等条件制约等优势，同时具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、改善肠道菌群等诸多特殊生理活性，在发酵制品、保健品和医药等领域研究开发前景广阔。目前已报道的一些微生物具有合成葡萄糖聚合物的能力，其中乳酸菌(Lactobacillus)、链球菌(Streptococcus)和明串珠菌Leuconostoc)等菌株可利用蔗糖合成葡聚糖，分子式为(C6H10O5)n。
其中，乳酸菌作为全球公认的对人体安全、可食用的一类细菌，是目前微生物多糖研究开发领域的热点。因此，利用产胞外多糖乳酸菌发酵转化甜菜糖蜜生产功能性乳酸菌胞外多糖，是一条进行甜菜糖蜜副产物增值加工利用的潜在途径。目前，国内外鲜见对此技术领域的相关文献资料报道。
乳酸菌胞外多糖产量低是限制规模工业化生产的重要瓶颈。影响乳酸菌胞外多糖产量的因素包括菌种遗传特性、培养基营养环境和发酵工艺条件等。
目前按在高纯度的蔗糖体系里生产多糖有所报导，但针对高盐、偏碱的糖蜜体系，菌种的耐受性和发酵性能受到挑战，获得具有优良发酵特性，能够适应甜菜糖蜜这种高盐基质环境的菌种，并高效转化甜菜糖蜜生产微生物多糖的乳酸菌菌株具有重要应用价值和意义。
因此，一种适应高盐、偏碱营养基质特性的高产胞外多糖明串珠菌及其利用该明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法对于甜菜糖蜜规模化高值转化利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够很好适应甜菜糖蜜基质环境，并高效利用甜菜糖蜜，转化生产胞外多糖的高产胞外多糖乳酸菌菌种及其发酵功能性胞外多糖的方法。
本发明的胞外多糖明串珠菌16S rRNA序列为序列表中序列<210>1所示。
本发明的胞外多糖明串珠菌菌株已经保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏日期为：2022年11月4日；保藏名称为：苏奥古姆明串珠菌，拉丁文学名：Leuconostocsuionicum(以下简称M1)，保藏编号为：CGMCC No.26046。
上述的胞外多糖明串珠菌M1是从中粮糖业控股股份有限公司所属糖厂的甜菜糖蜜副产物中分离得到，并经试验验证其在生产胞外多糖产品的应用中，能够很好适应甜菜糖蜜基质环境，并高效利用甜菜糖蜜，转化生产胞外多糖。
进一步地，本发明还提供了一种利用所述的产胞外多糖明串珠菌M1发酵制备胞外多糖的方法，该方法包括：将上所述胞外多糖明串珠菌M1菌种接种至含有甜菜糖蜜培养基种进行发酵，得到胞外多糖粗提物。
进一步地，本发明的利用所述的胞外多糖明串珠菌M1发酵制备胞外多糖的方法，具体步骤如下。
S1：从菌种保藏斜面挑取菌苔，接种于种子液体培养基中培养获得种子液。
S2：将步骤S1制备的种子液接种于含有甜菜糖蜜的发酵培养基中，培养获得发酵液。
S3：将S2获得的发酵液分离去除菌体，获得无细胞发酵液，加入乙醇进行沉淀，收集沉淀即为胞外多糖粗提物。
S4：将S3获得的胞外多糖粗提物通过冷冻干燥方式进行干燥。
进一步地，所述步骤S1中种子液体培养基包括以下常规MRS菌种培养基，优选的，其组成包括：蛋白胨5～30g，牛肉膏5～20g，酵母提取物3～10g，葡萄糖10～50g，pH 5.0～8.0。
进一步地，所述步骤S1中的培养条件为：培养温度20～45℃，培养时间5～20h，摇床转速10～200r/min。
进一步地，所述步骤S2中发酵培养基包括以下重量的成分，优选的，其组成包括：甜菜糖蜜100～500g，酵母提取物10～30g。所述发酵培养基的pH值为6.0～9.0。
进一步地，所述步骤S2中接种和培养条件为：接种量培养基体积的1％～10％进行接种，装液量200～900mL/L，培养温度25～45℃，初始pH值7～8，培养时间20～50h，摇床转速0～100r/min。
进一步地，所述步骤S3中粗多糖提取条件为：3000～10000r/min离心5～30min；所述乙醇浓度为60％～100％，乙醇与上清液的体积比为1:1～5:1。
进一步地，所述步骤S4中冷冻干燥条件为：冷阱温度-60～-30℃，真空度10～50Pa，冻干时间24～96h。
进一步地，本发明还提供了一种胞外多糖的益生元配料，该配料含有如上所述的胞外多糖明串珠菌M1发酵所得胞外多糖，或者由上述的胞外多糖明串珠菌M1发酵所得。经过抗氧化性活性检测，发现该多糖具有良好的抗氧化性及益生菌发酵性能，具有开发益生元的潜力。
通过本发明的技术方案，能够获得如下的有益效果。
(1)本发明提供的胞外多糖明串珠菌M1具有较高的抗胁迫能力，可在9％v/v的高盐环境，菌株在高达60％浓度蔗糖环境中依然具备良好的生长繁殖能力，同时可以在较宽的酸、碱范围内生长繁殖区间，耐受pH可达8，胆盐耐受浓度可达0.15％，可保证胞外多糖的的正常发酵生产。
(2)与商业菌种CICC21725(肠膜明串珠菌，常用于泡菜一类生产中的发酵)相比，利用本发明胞外多糖明串珠菌M1生产出的胞外多糖优点在于，在糖蜜发酵生产过程中，其发酵速度快，本发明的胞外多糖明串珠菌M1的生长繁殖能力较强，延滞期较短，仅有2h，培养9h作用即可达到生长稳定期。
(3)通过检测评价，利用本发明提供胞外多糖明串珠菌M1所产的胞外多糖作为益生元。
(4)具有潜在的益生元产品潜力。将提取的胞外粗多糖以20g/L的添加量替代MRS培养基中葡萄糖，考察多糖的体外促益生菌增殖活性，发现本发明的胞外多糖明串珠菌M1生产的胞外粗多糖对5株益生菌均有不同程度的促生长增殖作用。充分地体现了所述胞外多糖明串珠菌M1生产胞外多糖促进益生菌生长的典型品质，表现出了良好的益生元潜力。
附图说明
图1为本发明在培养基上的菌落形态图。
图2为本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株16S rRNA系统发育树示意图。
图3为本发明的胞外多糖明串珠菌M1不同培养温度下的生长能力示意图。
图4为本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株不同pH值条件下生长能力示意图。
图5为本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株NaCl耐受实验结果示意图。
图6为本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株蔗糖耐受实验结果示意图。
图7为本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株胆盐耐受实验结果示意图。
图8为本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株和CICC21725 37℃生长比较曲线图。
图9为本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株和CICC21725 EPS产量比较示意图。
图10为本发明的胞外多糖明串珠菌M1发酵生产的胞外粗多糖冻干粉末产品图。
图11为表1，为本发明的胞外多糖明串珠菌M1不同发酵条件下胞外多糖产量比较。
图12为表2，为本发明的胞外多糖明串珠菌M1发酵生产的胞外粗多糖体外抗氧化活性结果。
图13为表3，为本发明的胞外多糖明串珠菌M1发酵生产的胞外粗多糖对5种益生菌的促生长作用结果。
具体实施方式
下面通过本发明的具体实施方式，进一步详述本发明的特征和优点。
生物保藏：本发明的胞外多糖明串珠菌菌株已经于2022年11月4日保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所(缩写为CGMCC)，保藏名称为：苏奥古姆明串珠菌，拉丁文学名：Leuconostocsuionicum，保藏编号为：CGMCC No.26046。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明的胞外多糖明串珠菌M1是从中粮糖业控股股份有限公司相关糖厂的甜菜糖蜜副产物中取样筛选出的可用于食品的安全菌株。
具体的，本发明的胞外多糖明串珠菌M1的菌株分离、纯化及鉴定过程如下。
实施例1：本实施例用于说明M1菌株的筛选及鉴定。
菌株分离：取5～25g甜菜糖蜜，加入45mL无菌生理盐水锥形瓶振荡混匀，5倍梯度稀释至5倍、25倍、125倍，取0.5mL涂布于分离平板培养基(甜菜糖蜜300g，蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，酵母浸粉4.0g，葡萄糖20.0g，磷酸氢二钾2.0g，柠檬酸铵2.0g，醋酸钠5.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温-80 1.0mL，碳酸钙7.5g，琼脂粉15g，蒸馏水650mL，pH自然)，37℃培养24～48h。挑取平板上具有溶钙圈的单菌落，采用平板划线法对初筛获得的菌株反复纯化3次。将纯化菌株接种到复筛培养基中(蔗糖20.0g，酵母提取物20.0g，磷酸氢二钾20.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.01g，硫酸亚铁0.01g，氯化钙0.01g，氯化钠0.01g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL)，37℃培养48h，用接种环挑拉菌落，观察产粘拉丝情况，挑选相对粘稠且拉丝长度较大的产粘单菌落，进一步划线纯化并保存。
菌株鉴定。形态学特征观察：将菌株划线于分离平板培养基，37℃培养48h，观察菌株形态特征，并对菌体细胞进行革兰氏染色实验。同时，取菌体进行固定、脱水和喷金处理，用扫描电镜观察细胞大小和形态。
所形成的菌落为乳白色，圆形，边缘整齐，表面光滑、湿润。通过扫描电镜观察，菌体细胞呈圆形至椭圆状，大小为(0.7～1.0)×(0.9～1.4)μm，革兰氏染色阳性，见图1。
16S rRNA序列分析鉴定：将菌株接种于MRS培养基，37℃培养24h，取2mL培养液，12000r/min离心1min，获得菌体沉淀。利用细菌基因组提取试剂盒提取菌株基因DNA。利用16S rRNA通用引物(27F:5'-GAGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3')进行PCR扩增。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳验证后，进行一代DNA测序，将测序结果与GenBank数据库中已有模式菌株和代表性菌株核苷酸序列进行同源比对，并使用MEGA 5.0软件构建基于16S rRNA的菌株M1系统发育树，鉴定菌株的种属水平。系统发育树见图2，为本发明胞外多糖明串珠菌M1菌株16S rRNA系统发育树示意图。
本发明的胞外多糖明串珠菌M1的16S rRNA基因测序的结果见序列表中的序列<210>所示。
实施例2：本实施例用于说明M1菌株的耐受性评价。
菌株在MRS液体培养基中的最适生长温度为35℃，最适pH值为8.0，且在pH3～10范围内均可正常生长，耐盐生长能力强，可耐受9％的NaCl。
最适生长温度：图3是菌株M1在不同培养温度下的生长能力结果。由图3可见，本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株生长温度范围较宽，在20～40℃条件下均可很好的生长，最适生长温度35℃，在45℃条件下生长较为缓慢。
生长pH值范围：菌株在不同pH条件下生长结果见图4。由图4可知，本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株能够在较宽的酸、碱范围内生长繁殖，在pH值为5～10范围内均可较好地生长繁殖，其中最适pH值班为8左右的较酸环境中生长。
NaCl耐受能力：本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株对不同浓度NaCl具有较强的耐受能力，在低于5％的NaCl环境中能很好生长，其中最高可耐受9％的NaCl，见图5，能较好适应高盐离子基质环境。
图6是本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株对不同浓度蔗糖的耐受结果。由图6可见，菌株在高达60％浓度蔗糖环境中依然具备良好的生长繁殖能力，在利用甜菜糖蜜基质进行生物转化方面具有良好的潜力。
胆盐耐受能力：为进一步考察本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株在动物肠道内的耐受能力，分析了不同胆盐浓度下的生长增殖情况，结果见图7。由图7可知，超过0.15％的胆盐抑制了菌株增殖。
实施例3：本实施例用于说明本发明的明串珠菌M1菌株与商业菌株生产胞外多糖对比实验。
图8是本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株和CICC21725的生长曲线图。由图8可见，两株明串珠菌在MRS培养基中生长呈现典型的S生长曲线，本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株较CICC21725的延滞期更短，仅有2h，8h左右即生长至稳定期，而CICC21725的延滞期约为3h，13h才到达稳定期。因此，本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株在未来工业化应用时，可快速制备发酵种子液，提升生产效率。
为比较2株明串珠菌的胞外多糖(EPS)合成能力，在前期最优发酵工艺条件下进行发酵分析，结果见图9。由图9可见，本发明的胞外多糖明串珠菌M1菌株的EPS产量显著高于CICC21725。
实施例4：本实施例用于说明采用菌株的发酵条件及生产情况。
进一步地，利用本发明的胞外多糖明串珠菌M1进行胞外多糖制备，包含以下步骤。
S1：从菌种保藏斜面挑取菌苔，接种于种子液体培养基中培养获得种子液。
S2：将步骤S1制备的种子液接种于含有甜菜糖蜜的发酵培养基中，培养获得发酵液。
S3：将S2获得的发酵液分离去除菌体，获得无细胞发酵液，加入乙醇进行沉淀，收集沉淀即为胞外多糖粗提物。
S4：将S3获得的胞外多糖粗提物通过冷冻干燥方式进行干燥。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤S1中种子液体培养基包括以下常规MRS菌种培养基，优选的，其组成包括：蛋白胨5～30g，牛肉膏5～20g，酵母提取物3～10g，葡萄糖10～50g，pH 5.0～8.0。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤S1中的培养条件为：培养温度20～45℃，培养时间5～20h，摇床转速10～300r/min。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤S2中发酵培养基包括以下重量的成分，优选的，其组成包括：甜菜糖蜜100～500g，酵母提取物10～30g。所述发酵培养基的pH值为6.0～9.0。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤S2中接种和培养条件为：按甜菜糖蜜的发酵培养基体积比的1～10％接种种子液，装液量200～1000mL/L，培养温度25～45℃，初始pH值7～8，培养时间20～50h，摇床转速0～100r/min。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤S3中粗多糖提取条件为：3000～10000r/min离心5～30min；所述乙醇浓度为60％～100％，乙醇与上清液的体积比为1:1～5:1。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述步骤S4中冷冻干燥条件为：冷阱温度-60～-30℃，真空度10～50Pa，冻干时间24～96h。
本发明的胞外多糖明串珠菌M1发酵产生的胞外粗多糖样品见图10，所显示的为本发明的胞外多糖明串珠菌M1发酵生产的胞外粗多糖冻干粉末。
不同发酵条件及其粗多糖EPS的产量如表1所示，显示了不同发酵条件下胞外多糖产量。
实施例5：本实施例用于说明菌株M1发酵甜菜糖蜜所得的胞外多糖的活性评估。
最优发酵条件制备的胞外粗多糖体外抗氧化活性和促益生菌生长评价结果分别见表2和表3。
表2所显示为胞外粗多糖体外抗氧化活性结果。表3所显示为胞外粗多糖对5种益生菌的促生长作用结果。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种胞外多糖明串珠菌，其特征在于：菌株的DNA为序列表中序列<210>1所示。
2.一种产胞外多糖明串珠菌的应用，其特征在于：将权利要求1所述的胞外多糖明串珠菌应用于生产胞外多糖产品。
3.根据权利要求2所述的产胞外多糖明串珠菌的应用，其特征在于：所述应用于生产胞外多糖产品为：用甜菜糖蜜生产获得的胞外多糖。
4.一种利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：包含：将所述胞外多糖明串珠菌接种至含有甜菜糖蜜的培养基中进行发酵，得到胞外多糖粗提物，具体步骤如下：
S1：从菌种保藏斜面挑取菌苔，接种于种子液体培养基中培养获得种子液；
S2：将步骤S1制备的种子液接种于含有甜菜糖蜜的发酵培养基中，培养获得发酵液；
S3：将S2获得的发酵液分离去除菌体，获得无细胞发酵液，加入乙醇进行沉淀，收集沉淀即为胞外多糖粗提物；
S4：将S3获得的胞外多糖粗提物通过冷冻干燥方式进行干燥。
5.根据权利要求4所述的利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：
所述步骤S1中种子液体培养基包括MRS菌种培养基，其组成包括：蛋白胨5～30g，牛肉膏5～20g，酵母提取物3～10g，葡萄糖10～50g，pH 5.0～8.0。
6.根据权利要求4所述的利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤S1中的培养条件为：培养温度20～45℃，培养时间5～20h，摇床转速10～200r/min。
7.根据权利要求4所述的利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤S2中发酵培养基包含以下重量的成分，甜菜糖蜜100～500g，酵母提取物10～30g。所述发酵培养基的pH值为6.0～9.0。
8.根据权利要求4所述的利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤S2中接种和培养为：接种量培养基体积的1％～10％进行接种，培养温度25～45℃，初始pH值7～8，培养时间20～50h，摇床转速0～100r/min。
9.根据权利要求4所述的利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤S3中粗多糖提取条件为：3000～10000r/min离心5～30min；所述乙醇浓度为60％～100％，乙醇与上清液的体积比为1:1～5:1。
10.根据权利要求4所述的利用产胞外多糖明串珠菌发酵甜菜糖蜜生产胞外多糖的方法，其特征在于：所述步骤S4中冷冻干燥条件为：冷阱温度-60～-30℃，真空度10～50Pa，冻干时间24～96h。
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