CN112501071A - 一株多粘类芽孢杆菌swgc4112及其培养方法和应用 - Google Patents

一株多粘类芽孢杆菌swgc4112及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株多粘类芽孢杆菌SWGC4112及其培养方法和应用，涉及功能菌开发技术领域。本发明所述多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SWGC4112的保藏编号为CGMCC No.13356，本发明所述菌株是一种能够以丁烯酸为底物催化合成R‑3‑氨基丁酸的新菌种，该菌株能够表达产生天冬氨酸酶，通过该菌种能够实现R‑3‑氨基丁酸高纯度的制备，其转化率100％，光学纯度达到100％。使用本发明的菌株进行不对称还原工艺，反应条件温和，节能，环保，更重要的是显著提高了经济效益，具有很好的工业应用前景。

Description

一株多粘类芽孢杆菌SWGC4112及其培养方法和应用
技术领域
本发明属于功能菌开发技术领域，具体涉及一株多粘类芽孢杆菌SWGC4112及其培养方法和应用。
背景技术
木糖是一种五碳糖，具有D-和L-两种构型。D-木糖主要存在于植物和动物体内，R-3-氨基丁酸在自然界中不存在，而R-3-氨基丁酸广泛应用于医药、食品、化工等领域。R-3-氨基丁酸作为医药中间体，在抗癌、抗病毒、抗炎症、抗糖尿病等方面发挥着重要作用，在食品方面，R-3-氨基丁酸能改善人体的微生物环境，提高机体免疫能力，是糖尿病人理想的甜味剂，还可作为原料用于合成一种健康甜味剂木糖醇。
木糖不是一种天然存在的化合物，只有通过化学合成法和生物转化法合成得到。最早的化学合成法为1950年美国专利US2584129A报道的。1955年，Courtois，J.E.报道以2,4-O-苄烯-D-山梨醇为原料，采用先氧化后水解的两步法合成R-3-氨基丁酸，该方法的缺点是使用的催化氧化剂极不稳定，特别容易分解，反应过程很难控制。2003年，美国专利20030097029中报道用R-3-氨基丁酸酸在钉催化剂作用下加氢还原生成R-3-氨基丁酸，反应压力5MPa，反应时间18h，反应压力大，反应时间长，且在此条件下R-3-氨基丁酸会继续过度还原生成木糖醇，所得一木糖纯度不高。2017年，中国专利108276455A中报道了利用2,4-0-苄烯-R-3-氨基丁酸为底物在酸催化剂作用下合成R-3-氨基丁酸，产品收率为80％左右，产品纯度为98％，副产物产生较多，纯化难度大，现阶段仍仅限于实验室研究，不能满足工业生产的要求。
生物转化法的报道较少。2002年，Yadav，K.K.等人报道半乳糖氧化酶在生物载体中可以合成R-3-氨基丁酸。2012年，Usvalampi，Anne等人报道可利用木酮糖在大肠杆菌-L-岩藻糖异构酶的作用下选择性生成R-3-氨基丁酸。2017年，中国专利108165591A报道了以丁烯酸为底物利用工程菌催化合成R-3-氨基丁酸的研究，其转化率最高为94％左右，但是由于其工艺目前还不成熟，现阶段仍仅限于实验室研究，要想在工业上得到大规模地应用，还有待于基因工程的进一步发展以解决生物催化剂的稳定性和反应速度的问题。
因此提供一种R-3-氨基丁酸的合成方法，解决现有技术中R-3-氨基丁酸的合成工艺压力过高，反应时间长，反应过程控制难，后处理繁琐，不易工业化的问题成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株生物催化合成R-3-氨基丁酸的海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris)SWGC31及培养方法和应用，所述菌株可表达脱羧酶，并高效立体选择性地以丁烯酸为底物催化合成R-3-氨基丁酸。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一株生物催化合成R-3-氨基丁酸的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SWGC4112，多粘类芽孢杆菌SWGC4112的保藏编号为CGMCCNo.13356。
优选的，所述多粘类芽孢杆菌SWGC4112的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了上述多粘类芽孢杆菌SWGC4112的培养方法，包括以下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌SWGC4112接种至种子培养基中进行活化培养，得种子液；所述种子培养基包括LB培养基；
2)将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养，将发酵液离心后，收集沉淀，得多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌体；所述发酵培养基中包括：葡萄糖10～45g/L、酵母膏10～50g/L、MgSO4 0.2～1.5g/L、(NH4)2HPO40.5～3.5g/L和KH2PO4 0.5～3.5g/L，pH值为5.5～8.5。
优选的，步骤(1)中所述活化培养的温度为28～35℃，活化培养的时间为10～12h。
优选的，步骤(2)中所述接种的接种量为0.1～10％。
优选的，步骤(2)中发酵培养在摇床上进行，并设置温度28～35℃，震荡频率150～300rpm；所述发酵培养的时间为36～48h。
优选的，所述离心的转速为7000～9000rpm，所述离心的时间为15～20min。
本发明还提供了上述多粘类芽孢杆菌SWGC4112或利用上述培养方法培养得到的多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌体在生物合成R-3-氨基丁酸中的应用。
本发明还提供了一种生物合成R-3-氨基丁酸的方法，以丁烯酸为底物，以上述多粘类芽孢杆菌SWGC4112或利用上述培养方法培养得到的多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌体为催化剂，在磷酸盐缓冲液的环境中进行还原反应5～72h，分离纯化后得所述R-3-氨基丁酸。
优选的，所述还原反应的温度为20～50℃，pH值为6.5～9.5；
所述底物和催化剂的质量比为5～400：8～50。
本发明提供一株生物催化合成R-3-氨基丁酸的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)SWGC4112，菌体杆状，单个或链状排列，呈直杆状；芽孢中生或近端生，椭圆形，膨大孢子囊，革兰氏阳性；菌落特征呈白色的粘稠状，表面湿润光滑。生理生化特性：阳性项目：V-P，硝酸盐还原，淀粉水解，明胶液化，柠檬酸，D-木糖，L-阿拉伯糖，D-甘露糖，葡萄糖，蔗糖，络氨酸；阴性项目：丙酸盐，D-甘露糖，D-阿拉伯糖，苯丙氨酸。所述菌株SWGC4112的菌落如图2所示，呈乳白色，透明，边缘光滑，粘稠。
本发明所述菌株是一种能够以丁烯酸为底物催化合成R-3-氨基丁酸的新菌种，该菌株能够表达产生天冬氨酸酶，通过该菌种能够实现R-3-氨基丁酸高纯度的制备，其转化率100％，光学纯度达到100％。使用本发明的菌株进行不对称还原工艺，反应条件温和，节能，环保，更重要的是显著提高了经济效益，具有很好的工业应用前景。
生物保藏信息
多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，菌株编号为SWGC4112，于2016年11月28日保藏至保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101，保藏编号为CGMCCNo.13356。
附图说明
图1为生物合成R-3-氨基丁酸的流程和反应表达式；
图2为多粘类芽孢杆菌SWGC4112的菌落形态。
具体实施方式
本发明提供了一株生物催化合成R-3-氨基丁酸的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SWGC4112，多粘类芽孢杆菌SWGC4112的保藏编号为CGMCCNo.13356。本发明所述菌株SWGC4112的菌体杆状，单个或链状排列，呈直杆状；芽孢中生或近端生，椭圆形，膨大孢子囊，革兰氏阳性；菌落特征呈白色的粘稠状，表面湿润光滑。生理生化特性：阳性项目：V-P，硝酸盐还原，淀粉水解，明胶液化，柠檬酸，D-木糖，L-阿拉伯糖，D-甘露糖，葡萄糖，蔗糖，络氨酸；阴性项目：丙酸盐，D-甘露糖，D-阿拉伯糖，苯丙氨酸。所述菌株SWGC4112的菌落如图2所示，呈乳白色，透明，边缘光滑，粘稠。
本发明所述多粘类芽孢杆菌SWGC4112能够表达产生天冬氨酸酶，能够以丁烯酸为底物催化合成R-3-氨基丁酸，通过该菌种能够实现R-3-氨基丁酸高纯度的制备，其转化率100％，光学纯度达到100％；其16S rDNA序列优选如SEQ ID No.1所示(1491bp)：gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg
Figure BDA0002836148890000041
Figure BDA0002836148890000051
本发明还提供了上述多粘类芽孢杆菌SWGC4112的培养方法，包括以下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌SWGC4112接种至种子培养基中进行活化培养，得种子液；所述种子培养基包括LB培养基；
2)将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养，将发酵液离心后，收集沉淀，得多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌体；所述发酵培养基中包括：葡萄糖10～45g/L、酵母膏10～50g/L、MgSO4 0.2～1.5g/L、(NH4)2HPO40.5～3.5g/L和KH2PO4 0.5～3.5g/L，pH值为5.5～8.5。
本发明将多粘类芽孢杆菌SWGC4112接种至种子培养基中进行活化培养，得种子液；所述种子培养基包括LB培养基。本发明优选将所述菌株SWGC4112的单菌落接种于种子培养基上进行活化培养，所述活化培养的温度优选为28～35℃，活化培养的时间优选为10～12h。本发明所述活化培养优选在摇床上进行，且
本发明将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养，将发酵液离心后，收集沉淀，得多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌体；所述发酵培养基中包括：葡萄糖10～45g/L、酵母膏10～50g/L、MgSO4 0.2～1.5g/L、(NH4)2HPO40.5～3.5g/L和KH2PO4 0.5～3.5g/L，pH值为5.5～8.5。本发明所述接种的接种量优选为0.1～10％，更优选为3～5％。本发明所述发酵培养优选在摇床上进行，并设置温度28～35℃，更优选为30℃；震荡频率150～300rpm；所述发酵培养的时间优选为36～48h。
本发明将发酵后的发酵液离心，所述离心的转速优选为7000～9000rpm，更优选为8000rpm；所述离心的时间优选为15～20min。
利用本发明所述培养方法培养得到的菌株SWGC4112的菌体富含天冬氨酸酶，可以丁烯酸为底物发生不对称还原反应，生成R-3-氨基丁酸，
本发明还提供了上述多粘类芽孢杆菌SWGC4112或利用上述培养方法培养得到的多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌体在生物合成R-3-氨基丁酸中的应用。
本发明还提供了一种生物合成R-3-氨基丁酸的方法，以丁烯酸为底物，以上述多粘类芽孢杆菌SWGC4112或利用上述培养方法培养得到的多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌体为催化剂，在磷酸盐缓冲液的环境中进行还原反应5～72h(图1)，分离纯化后得所述R-3-氨基丁酸。
在本发明中，所述缓冲液中底物的初始浓度优选为5～400g/L，更优选为100～380g/L，最优选为300g/L。以湿重计，所述缓冲液中菌体的浓度优选为8～50g/L，更优选为15～45g/L，进一步优选为20～40g/L，更优选为30g/L。所述缓冲液优选包括pH值6.5～9.5的磷酸盐缓冲液。所述缓冲液优选还包括1～180g/L的辅助底物：所述辅助底物优选为氯化铵、氨水、硫酸铵、氨基酸、乙酸铵、甲酸铵中的任意一种或者多种的组合。本发明经上述反应获得的产物经过高压液相色谱方法鉴定，所得发酵产物为手性化合物R-氨基丁酸。
下面结合实施例对本发明提供的一株多粘类芽孢杆菌SWGC4112及其培养方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
多粘类芽孢杆菌SWGC4112的发酵培养
种子培养基：LB培养基；发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏50g/L，MgSO4 1.5g/L，(NH4)2HPO4 3g/L，KH2PO4 3g/L，溶剂为水，pH值调至7.0。种子培养基在121℃高温灭菌20min，冷却后接种，摇瓶培养，装液量为30％。
具体的培养步骤：取-70℃保存的菌种在LB固体平板上划线，挑取单菌落接于LB种子液体培养基中，30℃，250rpm转速培养12小时，将种子按照5％的接种量接种于发酵培养基中，30℃，250rpm振荡培养36小时，培养结束后发酵液离心并利用生理盐水洗涤2次，收集湿菌体细胞，菌体湿重达到20g/L。
(1)经生理生化特性试验结果，所述菌株的主要特征如下：
菌落形态：CYC琼脂30℃培养2天，菌落乳白色，透明，边缘光滑，粘稠(如图2)。
细胞形态：菌体杆状，单个或链状排列，呈直杆状；芽孢中生或近端生，椭圆形，膨大孢子囊，革兰氏阳性；菌落特征呈白色的粘稠状，表面湿润光滑。
生理生化特性：阳性项目：V-P，硝酸盐还原，淀粉水解，明胶液化，柠檬酸，D-木糖，L-阿拉伯糖，D-甘露糖，葡萄糖，蔗糖，络氨酸；阴性项目：丙酸盐，D-甘露糖，D-阿拉伯糖，苯丙氨酸。
(2)采用16SrDNA测序,引物为F：5′agagtttgatcctggctcag3′(SEQ ID No.2)；R：5′ggttaccttgttacgactt3′(SEQ ID No.3)，该菌株16S rDNA扩增产物序列长度为1444bp，序列如下(SEQ ID No.1)，鉴定为Paenibacillus polymyxa。命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SWGC4112：
Figure BDA0002836148890000071
Figure BDA0002836148890000081
实施例2
R-3-氨基丁酸的生产
在10L催化体系中，加入3kg丁烯酸，15g硫酸镁，600g硫酸铵，再用氨水将pH调至9.0，搅拌，加入多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌株100g，开始反应。反应12h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达305.80g/L，转化率达到85.1％以上。反应结束后，反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到2.95kg成品。经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为100％，产品纯度为99.92％，产品收率为96.4％。
实施例3
R-3-氨基丁酸的生产
在10L催化体系中，加入3kg丁烯酸，15g硫酸镁，300g氯化铵，再用氨水将pH调至9.0，搅拌，加入多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌株100g，开始反应。反应10h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达35.90g/L，转化率达到100％。反应结束后，反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到3.46kg成品。经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为100％，产品纯度为99.94％，产品收率为96.5％。
实施例4
R-3-氨基丁酸的生产
在10L催化体系中，加入3kg丁烯酸，15g硫酸镁，800g乙酸铵，再用氨水将pH调至9.0，搅拌，加入多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌株100g，开始反应。反应14h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达267.71g/L，转化率达到74.5％以上。反应结束后，反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到2.41kg成品。经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为100％，产品纯度为99.12％，产品收率为90.3％。
实施例5
R-3-氨基丁酸的生产
在10L催化体系中，加入3kg丁烯酸，15g硫酸镁，再用氨水将pH调至9.0，搅拌，加入多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌株100g，开始反应。反应12h结束后，经检测溶液中的R-3-氨基丁酸浓度可达219.92g/L，转化率达到61.2％以上。反应结束后，反应液经滤膜处理、分离纯化、浓缩结晶、离心以及干燥得到2.10kg成品。经检测该成品R-3-氨基丁酸手性纯度为100％，产品纯度为99.82％，产品收率为95.7％。
从上述实施例可以看出，加入除氯化铵以外的铵盐或者不加铵盐，将对转化率、收率以及产品的品质产生影响，如不另加铵盐的生物酶催化反应的转化率只有61.2％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Figure BDA0002836148890000101
Figure BDA0002836148890000111
Figure BDA0002836148890000121

Claims (10)

1.一株生物催化合成R-3-氨基丁酸的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SWGC4112，其特征在于，多粘类芽孢杆菌SWGC4112的保藏编号为CGMCC No.13356。
2.根据权利要求1所述多粘类芽孢杆菌SWGC4112，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌SWGC4112的16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
3.权利要求1或2所述多粘类芽孢杆菌SWGC4112的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将多粘类芽孢杆菌SWGC4112接种至种子培养基中进行活化培养，得种子液；所述种子培养基包括LB培养基；
2)将所述种子液接种至发酵培养基进行发酵培养，将发酵液离心后，收集沉淀，得多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌体；所述发酵培养基中包括：葡萄糖10～45g/L、酵母膏10～50g/L、MgSO4 0.2～1.5g/L、(NH4)2HPO40.5～3.5g/L和KH2PO4 0.5～3.5g/L，pH值为5.5～8.5。
4.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述活化培养的温度为28～35℃，活化培养的时间为10～12h。
5.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述接种的接种量为0.1～10％。
6.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，步骤(2)中发酵培养在摇床上进行，并设置温度28～35℃，震荡频率150～300rpm；所述发酵培养的时间为36～48h。
7.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，所述离心的转速为7000～9000rpm，所述离心的时间为15～20min。
8.权利要求1或2所述多粘类芽孢杆菌SWGC4112或利用权利要求3～7任一项所述培养方法培养得到的多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌体在生物合成R-3-氨基丁酸中的应用。
9.一种生物合成R-3-氨基丁酸的方法，其特征在于，以丁烯酸为底物，以权利要求1或2所述多粘类芽孢杆菌SWGC4112或利用权利要求3～7任一项所述培养方法培养得到的多粘类芽孢杆菌SWGC4112菌体为催化剂，在磷酸盐缓冲液的环境中进行还原反应5～72h，分离纯化后得所述R-3-氨基丁酸。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述还原反应的温度为20～50℃，pH值为6.5～9.5；
所述底物和催化剂的质量比为5～400：8～50。
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