CN111172065A

CN111172065A - 一株高产多粘类芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN111172065A
Application number: CN202010009952.5A
Authority: CN
Inventors: 孙利鹏; 焦国宝; 管宁; 崔怡; 梁颖杰; 崔红建; 郭蒙恩; 朱飞帆
Original assignee: Henan New Yangshao Biological Technology Co ltd
Current assignee: Henan New Yangshao Biological Technology Co ltd
Priority date: 2020-01-06
Filing date: 2020-01-06
Publication date: 2020-05-19
Anticipated expiration: 2040-01-06
Also published as: CN111172065B

Abstract

本发明属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一株高产多粘类芽孢杆菌及其应用专利申请。多粘类芽孢杆菌YSD7，于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 19087。该菌可防治：大白菜软腐病菌、芋头软腐病菌、烟草疫霉、花卉根腐病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌或玉竹根腐病菌。发明人在现有菌株基础上，通过紫外诱变和硫酸二乙酯诱变技术的组合应用及定性筛选育种，最终获得了一株具有较好生长活力的多粘类芽孢杆菌YSD7菌株。初步实验结果表明，YSD7菌株最高发酵活力可达95亿/mL，表现出较好生长效果，可为多粘类芽孢杆菌微生物制剂产品的制备奠定良好的技术基础。

Description

一株高产多粘类芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一株高产多粘类芽孢杆菌及其应用专利申请。

背景技术

多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa），是一种可产芽孢的、生理特性多样的、革兰氏阳性杆状细菌，当其以芽孢形式存在时，具有耐温性好、质量稳定优点。多粘类芽孢杆菌也是一种土壤与植物微生态之间的常见优势菌，因此在青枯病、枯萎病、根腐病、软腐病等土传病害防治方面有较多研究和应用，加之其具有促生长、提产量、改善品质、无残留等特点，因此以多粘类芽孢杆菌为主的微生物制剂是无公害、绿色、有机蔬菜生产中首选防治药剂。美国环境保护署(EPA)也将其列为可商业上应用的微生物种类之一。

多粘类芽孢杆菌虽然是一种良好的生防促生菌，具有较好的市场前景和极高的应用价值，但受限于现有多粘类芽孢杆菌发酵产量偏低等技术问题，实际的以多粘类芽孢杆菌为主的微生物制剂产品类型仍然较为有限，进而限制了此类微生物制剂产品在实际生产中的推广应用，因而极有必要筛选具有更好生长效果的多粘类芽孢杆菌菌株以及对该菌株的发酵工艺进行进一步优化，从而为相关微生物制剂产品的生产应用奠定技术基础。

发明内容

基于现有多粘类芽孢杆菌，通过对其诱变、筛选，本申请目的在于提供一株具有更好生长活力的多粘类芽孢杆菌菌株，从而为相关微生物制剂产品的生产、制备奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一株高产多粘类芽孢杆菌，其名称为：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）YSD7，该菌株已于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC 19087；

该菌株是通过对原始出发菌株多粘类芽孢杆菌YSD5进行多次紫外诱变和硫酸二乙酯复合诱变育种选育获得的。

利用所述高产多粘类芽孢杆菌所制备发酵液，通过如下步骤制备获得：

（1）菌株活化和制备种子液

将所保存的多粘类芽孢杆菌YSD7菌株在LB平板培养基中，30℃活化培养2d后，搜集菌苔转接于LB液体培养基中进一步扩增后，转接于种子罐的种子培养基中，30℃、180-300rpm发酵 18h左右作为种子液；

所述种子培养基为：葡萄糖2%，玉米粉 3％，豆饼粉5％，玉米浆干粉1%，磷酸二氢钾0.2％，酵母粉1.5%，pH7.0；

（2）制备发酵液

按照6%体积比接种量，将步骤（1）中所制备种子液转接于发酵培养基中，在发酵罐内，28~35℃、180-200rpm发酵24~48h（优选条件下，30℃、180-200rpm发酵至 35h 左右即可）左右至芽孢形成率在80%以上（同时发酵液的pH会明显升高）时放罐，即为发酵液；

为便于后续制备微生物制剂成品，可将发酵醪液进一步转入乳化罐中，采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥处理（喷雾干燥具体处理参数可参考设置为，进风温度控制在：140-170℃，排风温度控制在65-70℃，负压200-400pa），进一步制备成粉末状原粉，并与其他辅料或有效成分复配后作为多粘类芽孢杆菌成品制剂；

所述发酵培养基，为液态，以质量比计，具体成分包括：葡萄糖0.5~2%，玉米粉 4~6%，玉米浆干粉1~2%，豆饼粉3~6%，酵母粉1~3%，磷酸二氢钾0.1~0.5%，氯化锰0.01~0.03%，pH 6.5~7.0。

所述高产多粘类芽孢杆菌在制备植物病原菌防治药剂中的应用，用于防治：大白菜软腐病菌、芋头软腐病菌、烟草疫霉、花卉根腐病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌或玉竹根腐病菌等病原菌；

以防治大白菜软腐病菌为例，具体用法为：将YSD7菌株制备成活菌数为2.0-8.0亿个/mL的菌液，按每100g大白菜种子15ml菌液量，将大白菜种子在菌液中浸泡不少于1h。

本申请中，发明人在现有多粘类芽孢杆菌YSD5菌株（早期由申请人韶山工厂附近林地腐殖土中筛选获得，表型特征为：菌落呈圆形，微隆起，边缘整齐，表面粘稠、湿润、色暗）基础上，通过紫外诱变和硫酸二乙酯诱变技术的组合应用及定性筛选育种，最终获得了一株具有较好生长活力的多粘类芽孢杆菌YSD7菌株。初步实验结果表明，YSD7菌株最高发酵活力可达95亿/mL，表现出较好生长效果，可为多粘类芽孢杆菌微生物制剂产品的制备奠定良好的技术基础。

附图说明

图1为多粘类芽孢杆菌发酵生长曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分实验背景情况简要说明如下。

培养基：

营养琼脂培养基（Nutrient Agar.NA）：蛋白胨10.00 g，牛肉提取物3.00 g，氯化钠5.00 g，琼脂15.0 0g，蒸馏水1.00 L，pH 7.0；

牛肉浸汁培养基（Bee4.3 extract Agar）：取去脂肪的瘦肉500.00 g，切碎，于烧杯中加蒸馏水1.00 L，置4 ℃冰箱中过夜，用棉花过滤，将滤液于水浴中煮沸1 h，使蛋白质凝固，过滤，在滤液中加入10.00 g蛋白胨和5.00 g氯化钠，调pH 7.4，并将液体补足1.00 L，琼脂15.00 g，分装后灭菌，备用；

多粘类芽孢杆菌活力测定方法

采用稀释倒平板法，按10倍稀释法制成不同浓度稀释液，从稀释液中分别吸取一定体积置于无菌培养皿中，每一稀释度做3次重复；

随后将事先融化并冷却至50℃左右的营养琼脂培养基，向每个培养皿中倒入约12 mL，摇匀，待凝固后，倒置培养24 h，进行菌落计数；

对培养后的每个稀释度取5～10个菌落的菌体，涂片染色，进行显微镜识别；

选择适宜的稀释度、菌落在30～300个之间的平板进行计数；

结果计算方法：

。

实施例1

本实施例就本申请所提供的多粘类芽孢杆菌YSD7菌株诱变筛选获得过程简要介绍如下。

本申请所提供的多粘类芽孢杆菌YSD7主要是通过对现有出发菌株多粘类芽孢杆菌YSD5的紫外线诱变和硫酸二乙酯(DES)诱变筛选获得的，具体诱变、筛选过程简要说明如下。

（1）紫外线诱变

首先是对出发菌株YSD5进行紫外线诱变育种，其主要过程为：

取30℃培养至对手生长期的YSD5菌悬液4ml，采用15 W紫外线灯在28 cm距离处照射，照射过程中，随着紫外线照射时间的延长，菌株存活率逐渐降低。辐射诱变过程中，以辐照40s时长作为紫外线诱变剂量（测定结果表明，当照射时间超过40s时，存活率低于10 %，因此选择此时长作为最佳时长）。

经过多轮辐照、初筛、复筛等诱变筛选后，获得一株具有较高活力突变菌株，将其命名为YSD5-189。测定结果表明，其发酵活力为57亿/mL。

（2）硫酸二乙酯(DES)诱变

以紫外诱变获得的YSD5-189菌株作为硫酸二乙酯诱变的出发菌株，具体诱变、筛选过程为：

将活化后的出发菌株YSD5-189接种到盛有 100mL 牛肉膏蛋白胨的 250mL 三角瓶中，30℃、180r/min 振荡培养10h后，5000r/min离心10分钟，弃上清，沉淀用 pH6.0 的磷酸缓冲液洗涤三次，最后用缓冲液制成约 10⁸个/mL 的菌悬液；

在10mL 的菌悬液，分别加入 5μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL的DES，形成 DES 含量分别为 0.05%、0.10%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的 6 个诱变梯度，以不加 DES 的处理组为空白对照；

30℃、180r/min摇床振荡处理30min，然后加入1mL的2%硫代硫酸钠终止诱变反应；处理后稀释涂平板，每个处理涂三个平板，30℃下培养 48 h，统计菌落，计算致死率。

最终选择死亡率70~80%下生长出的单菌落100株，将其转接到斜面培养基，以原始出发菌株作为对照，30℃培养2天后，最终筛选确定5株菌落形态好、生长速度快的新菌株，分别命名为：YSD6-158、YSD6-193、YSD6-206、YSD6-217、YSD6-327。

对这5株菌株的生长性能（即生长活力作为主要指标）进行评价，具体过程为：

将选出的 5 株菌进行摇瓶发酵培养35h，培养基配方为：葡萄糖1%，玉米粉 4%，玉米浆干粉1%，豆饼粉5%，酵母粉1.5%，磷酸二氢钾0.1%，氯化锰0.02%，pH7.0；培养结束后测发酵液中多粘类芽孢杆菌的活力，具体培养结果如下表所示。

表1，多粘类芽孢杆菌5株摇瓶实验结果

。

进一步进行初筛、复筛、并连续转接10代，以对菌株生长活力进行评价。

其中YSD6-217菌株连续传代10次的菌株活力结果如下表2所示。

表2，多粘类芽孢杆菌YSD6-217菌株生长活力稳定性评价

。

结果表明，YSD6-217菌株的生长活力较为稳定，发酵35h后，菌体数量稳定在80亿/mL左右（原始出发菌株多粘类芽孢杆菌YSD5，相同条件下发酵活力仅有30亿/mL左右），因此，发明人对该菌株进行了生物保藏，并将该菌株重新命名为多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）YSD7，该菌株目前已于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC 19087。

该菌株的部分表型特征如下：在营养肉汤琼脂培养基上，生长48h后菌落呈圆形，微隆起，边缘整齐，表面粘稠、湿润、色暗；镜检菌形杆状、革兰氏染色阳性、芽孢椭圆形、孢囊膨大，芽孢中生到端生。

实施例2

在实施例1筛选所得菌株基础上，发明人对其所适配发酵工艺进行了进一步优化，以进一步提高该菌株的生长发酵能力。具体过程简介如下。

（1）菌株活化和制备种子液

将所保存的多粘类芽孢杆菌YSD7菌株在LB平板培养基中，30℃活化培养2d后，搜集菌苔转接于LB液体培养基中进一步扩增后，转接于种子罐的种子培养基中，30℃、200rpm发酵18h左右作为种子液；

（2）制备发酵液

按照6%体积比接种量，将步骤（1）中所制备种子液转接于发酵培养基中，在发酵罐内，30℃、180rpm发酵左右至芽孢形成率在80%以上（同时发酵液的pH会明显升高）时放罐，即为发酵液；

为便于后续制备微生物制剂成品，可将发酵醪液进一步转入乳化罐中，采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥处理，进一步制备成粉末状原粉，并与其他辅料或有效成分复配后作为多粘类芽孢杆菌成品制剂；

所述发酵培养基，为液态，以质量比计，具体成分包括：葡萄糖1.5%，玉米粉6%，玉米浆干粉1%，豆饼粉5%，酵母粉1.5%，磷酸二氢钾0.2%，氯化锰0.03%，pH7.0。

对5批次发酵生产试验结果统计列表如下表3所示。

表3，多粘类芽孢杆菌35m³ 发酵罐5批次发酵生产实验结果

从上表结果可以看出，发酵活力较为稳定，平均发酵活力稳定在90亿/mL以上。

进一步地，在某批次发酵过程中，每隔 4h 取一次发酵液，在600nm条件下测定吸光度即OD值，绘出 OD 值的变化曲线如图 1所示。可以看出，该菌株生长迅速，发酵周期可缩短至 35h 左右。

（3）制备多粘类芽孢杆菌产品

为便于后续制备微生物制剂成品，发明人进一步将发酵醪液转入乳化罐中，采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥处理制备成粉末状原粉，具体参数设置为：进风温度控制在：150℃，排风温度控制在65℃，负压400pa。

作为对照，采用相同发酵工艺，发明人以原始出发菌株多粘类芽孢杆菌YSD5为例，同样制备了粉末状原粉。

制备过程中，发明人对不同批次所制备最终产品的综合收率进行了测定，结果如下表4、表5所示。

表4，多粘类芽孢杆菌YSD5菌株在35m³发酵罐发酵及收率情况表

表5，多粘类芽孢杆菌菌株YSD7在35m³发酵罐发酵及收率情况表

从上表结果可以看出，原始出发菌株多粘类芽孢杆菌YSD5综合收率为81%，而本申请诱变筛选后YSD7菌株综合收率可达93%，即，较好的生长发酵活力确保了较高收率，可为多粘类芽孢杆菌微生物制剂产品的制备奠定良好的技术基础。

实施例3

多粘芽孢杆菌是一种重要的生防微生物，能够产生抗菌素和抗菌蛋白等多种生物活性物质,在植物病害防治方面具有诱人的前景，基于实施例2所制备粉末状原粉和出发菌株YSD5发酵干燥制备的粉末状原粉，发明人就本申请多粘类芽孢杆菌YSD7对不同病原菌的抑制情况和出发菌株YSD5对不同病原菌的抑制情况进行了实验，具体实验情况简要介绍如下。

实验设计：

1、在V8 固体培养基平板中央，分别接种直径6mm的大白菜软腐病菌、芋头软腐病菌、烟草疫霉以及花卉根腐病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌、玉竹根腐病菌等不同病原菌菌饼；

然后在菌饼一侧2.5cm距离处接种本申请的多粘类芽孢杆菌菌株YSD7，接种完成后置于25℃培养箱中黑暗培养；同时设计空白对照组（即，不接种任何菌株）；每个试验菌株5次重复；

相同操作情况下，接种出发菌株的多粘类芽孢杆菌菌株YSD5进行实验。

培养7天后观察和测量抑菌带宽度，并计算抑菌率，

抑菌率=[（对照侧菌落半径—对峙侧菌落半径）/对照测菌落半径]×100%。

具体结果如下表6、表7所示。

表6，菌株YSD7对不同植物病原菌的抑菌率

注：数据后的不同字母表示0 .05水平差异显著。

表7，出发菌株YSD5对不同植物病原菌的抑菌率

注：数据后的不同字母表示0 .05水平差异显著。

从上表6、表7可以看出，本申请的YSD7菌株抑菌谱广，对多株病原菌均有抑菌作用，抑制率最低也在60%以上。而出发菌株YSD5抑菌谱虽然较广，但抑制率最高才58%。另一方面，不管YSD7菌株还是YSD5菌株，对于不同病原菌的抑制效果之间也存在显著差异，其中对大白菜软腐病菌的抑制作用最强。

为进一步考察本申请的YSD7对于病原菌抑制效果的稳定性，进一步将上述实验平板继续培养30天，结果表明，YSD7菌株能够持续抑制各病原菌的生长，尤其是能够强烈抑制大白菜软腐病菌的生长，抑菌效果较为持久和稳定。

基于上述抑制结果，以用于大白菜软腐病防治为例，具体应用方法为：将YSD7菌株制备成活菌数为2.0-8.0亿个/mL的菌液，按每100g大白菜种子15ml菌液量，将大白菜种子在菌液中充分浸泡不少于1h即可，进一步优选地，可在大白菜幼苗期，将上述菌液稀释后（一般稀释100000倍，即，稀释至2000~8000个/ml，按每株10~100ml用量）灌根施用，从而进一步增强和维持抗大白菜软腐病原菌效果。

Claims

1.一株高产多粘类芽孢杆菌，其特征在于，该菌株名称为：多粘类芽孢杆菌YSD7，该菌株已于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC 19087。

2.利用权利要求1所述高产多粘类芽孢杆菌所制备发酵产物，其特征在于，通过如下步骤制备获得：

（1）菌株活化和制备种子液

将所保存的多粘类芽孢杆菌YSD7菌株活化后，接种至种子培养基中发酵制备种子液；

（2）制备发酵液

将步骤（1）中所制备种子液转接于发酵培养基中，28~35℃、180-200rpm发酵制备发酵液。

3.如权利要求2所述发酵产物，其特征在于，步骤（1）中，质量百分比计，所述种子培养基为：葡萄糖2%，玉米粉 3％，豆饼粉5％，玉米浆干粉1%，磷酸二氢钾0.2％，酵母粉1.5%，pH7.0。

4.如权利要求2所述发酵产物，其特征在于，步骤（2）中，质量百分比计，所述发酵培养基，具体成分包括：葡萄糖0.5~2%，玉米粉 4~6%，玉米浆干粉1~2%，豆饼粉3~6%，酵母粉1~3%，磷酸二氢钾0.1~0.5%，氯化锰0.01~0.03%，pH 6.5~7.0。

5.如权利要求2所述发酵产物，其特征在于，步骤（2）中，将发酵液进一步转入乳化罐中，采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥处理，具体参数为：进风温度控制在：140-170℃，排风温度控制在65-70℃，负压200-400pa。

6.权利要求1所述高产多粘类芽孢杆菌在制备植物病原菌防治药剂中的应用，其特征在于，用于防治：大白菜软腐病菌、芋头软腐病菌、烟草疫霉、花卉根腐病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌或玉竹根腐病菌。

7.权利要求2~5任一项所述发酵产物在制备植物病原菌防治药剂中的应用，其特征在于，用于防治：大白菜软腐病菌、芋头软腐病菌、烟草疫霉、花卉根腐病菌、小麦根腐病菌、花生黑斑病菌或玉竹根腐病菌。