CN107075458A - 抗真菌类芽孢杆菌菌株、杀镰孢菌素型化合物和它们的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新分离的细菌菌株，其是类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的成员，最初从土壤分离，显示出抗广谱病原体的拮抗活性并且能够产生抗微生物代谢物。发现菌株Lu16774和Lu17007属于名为多粘类芽孢杆菌植物亚种(Paenibacillus polymyxa ssp.plantarum)的新亚种，而菌株Lu17015属于认为是附生类芽孢杆菌(Paenibacillus epiphyticus)的新种。本发明还涉及微生物农药组合物，其包含至少一种此类新细菌菌株、其全培养液或无细胞提取物或级分或其至少一种代谢物、和/或显示出抗植物病原体的拮抗活性的、至少一种所述新细菌菌株的具有相应细菌菌株的全部鉴定特征的突变体、或其全培养液、无细胞提取物、级分和/或代谢物。本发明还涉及通过施用这种组合物控制或抑制植物病原体或防止植物病原体感染的方法。本发明还涉及新的杀镰孢菌素型化合物，其是本发明菌株产生的代谢物。

Description

抗真菌类芽孢杆菌菌株、杀镰孢菌素型化合物和它们的用途
发明领域
本发明涉及新分离的细菌菌株，其是类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的成员，最初从土壤分离，显示出抗广谱病原体的拮抗活性并且能够产生抗微生物代谢物。本发明还涉及微生物农药组合物，其包含该新细菌菌株、其全培养液或无细胞提取物或级分或其至少一种代谢物、和/或显示出抗植物病原体的拮抗活性的、至少一种所述新细菌菌株的具有相应细菌菌株的全部鉴定特征的突变体、或其全培养液、无细胞提取物、级分和/或代谢物。本发明还涉及通过施用这种组合物控制或抑制植物病原体或防止植物病原体感染的方法。本发明还涉及新的杀镰孢菌素型(fusaricidin-type)化合物，其是本发明菌株产生的代谢物。
发明背景
在控制影响植物或作物的植物病原真菌的技术领域中，熟知可以施用包含生物农药的活性化合物组合物，所述生物农药例如选自对待处理的植物或作物无害的细菌，如形成孢子的细菌，或真菌，并且所述生物控制剂可以进一步与植物病原体的经典有机化学拮抗剂组合。
已经将生物农药定义为基于微生物(细菌、真菌、病毒、线虫等)或天然产物(来自生物来源的化合物或提取物)的农药形式(U.S.Environmental Protection Agency(美国环保署):http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides/)。
生物农药通常通过生长和浓缩天然产生的生物体和/或其代谢物来形成，包括细菌和其他微生物、真菌、病毒、线虫、蛋白质等。它们经常被认为是综合病虫害治理(IPM)项目的重要组成部分，并且作为合成的化学植物保护产品(PPP)的替代，已经受到了很多实际关注。
生物农药分成两个主要的类别，微生物和生物化学农药：
(1)微生物农药由细菌、真菌或病毒(并且常常包括细菌和真菌产生的代谢物)组成。昆虫病原线虫也归为微生物农药，尽管它们是多细胞的。
(2)生物化学农药是可以控制农害(pest)或提供其他作物保护用途(见以下定义)、但对哺乳动物相对无毒的天然物质。
为了控制植物病原真菌，之前已经描述了几种微生物农药，包括形成孢子的细菌(如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))，参见，例如，WO 1988/050422；WO 2000/029426；WO 1998/50422和WO 2000/58442。
WO 2009/0126473公开了包含细菌或真菌孢子的农业上可接受的含水组合物，所述细菌或真菌孢子包含在水性/有机溶剂中，并且所述组合物可以进一步包含昆虫控制剂、杀虫剂、杀真菌剂或其组合。芽孢杆菌(Bacillus)属细菌的孢子是优选的。
WO 2006/017361公开了用于控制植物病原体的组合物，其包含至少一种有益细菌、至少一种有益真菌、至少一种营养素和至少一种延长所述组合物的有效期的化合物。有益细菌组例如包含多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)和坚韧类芽孢杆菌(Paenibacillus durum)的细菌。
EP-A-1 168 922涉及用于影响植物生长和/或赋予抗病性的组合物，其包含至少两种植物根际促生菌(plant-growth promoting Rhizobacteria)菌株和几丁质化合物，其中所述菌株选自芽孢杆菌属(Bacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)和硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)。然而，没有给出具体类芽孢杆菌菌株的例子以支持该声称的组合。
WO 1999/059412公开了多粘类芽孢杆菌菌株PKB1(具有ATCC登录号202127)，其具有对抗几种植物病原真菌的活性。
WO 2006/016558公开了类芽孢杆菌属菌株BS-0048、BS-0074、BS-0277和多粘类芽孢杆菌菌株BS-0105以及杀镰孢菌素A和杀镰孢菌素B，用于保护植物免受真菌感染。另一个抗真菌类芽孢杆菌菌株BRF-1已经从大豆根际分离(African J.Microbiol.Res.4(24)，2692-2698，2010)。
WO 2011/069227公开了多粘类芽孢杆菌菌株JB05-01-1(具有ATCC登录号PTA-10436)，其具有对抗病原细菌(主要是经食物传播的人病原细菌)的高度抑制作用。
Budi等(Appl Environ Microbiol，1999，65，5148-5150)已经从高粱(Sorghumbicolor)的菌根际分离了类芽孢杆菌菌株B2，其具有针对土壤传播的真菌病原体，如寄生疫霉(Phytophthora parasitica)，的拮抗活性。
由Delaporte,B.(Lab Cytol Veg，巴黎，法国)从科特迪瓦(Cote d’Ivoire)土壤分离并且以NRRL保藏号BD-62保藏在农业研究所(Agricultural Research Service)开放保藏中心USDA(美国)的皮尔瑞俄类芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)菌株11.D.3(Int.J.Syst Bacteriol.46(4),988-1003,1996，下文中也称为菌株BD-62)，显示出对抗几种植物病原细菌和真菌的抗菌活性(J.Appl.Microbiol.95，1143-1151，2003)。NRRL是农业研究所培养物保藏中心的缩写，是在关于国际认可的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约下用于保藏微生物株目的的国际保藏单位，地址是美国农业部农业研究院国家农业应用研究中心，大学北街1815号，皮奥里亚，伊利诺伊，61604，USA。
别处也报道了各种类芽孢杆菌菌株，例如，皮尔瑞俄类芽孢杆菌菌株，对抗各种细菌、真菌和酵母病原体的抗微生物活性(Lett.Appl.Microbiol.43，541-547，2006)。
Raza等(Brazilian Arch.Biol.Techol.53，1145-1154，2010；Eur.J.PlantPathol.125:471-483，2009)描述了有效对抗尖镰孢(Fusarium oxysporum)的、产生杀镰孢菌素型化合物的多粘类芽孢杆菌菌株SQR-21。
杀镰孢菌素(fusaricidin)是一组从类芽孢杆菌属物种分离的抗生素，其属于环状脂缩酚酸肽(lipodepsipeptide)类。在整个家族中保守的其共同结构特征如下：由6个氨基酸残基组成的大环，其中三个是L-Thr、D-allo-Thr和D-Ala，以及通过酰胺键连接N-末端L-Thr残基的15-胍基-3-羟基十五酸尾部(ChemMedChem 7，871-882，2012；J.Microbiol.Meth.85，175-182，2011，本文中的表1)。这些化合物通过N-末端L-Thr羟基基团和C-末端D-Ala羰基基团之间的内酯桥环化。缩酚酸肽(depsipeptide)环内氨基酸残基的位置通常从上述L-Thr(其自身也携带GHPD链)开始编号，并结束于C-末端D-Ala。从类芽孢杆菌分离的杀镰孢菌素的非限制性实例称为LI-F03、LI-F04、LI-F05、LI-F07和LI-F08(J.Antibiotics 40(11)，1506-1514，1987；Heterocycles 53(7)，1533-1549，2000；Peptides 32，1917-1923，2011)以及杀镰孢菌素A(也称为LI-F04a)、杀镰孢菌素B(也称为LI-F04b)、杀镰孢菌素C(也称为LI-F03a)和杀镰孢菌素D(也称为LI-F03b)(J.Antibiotics49(2)，129-135，1996；J.Antibiotics 50(3)，220-228，1997)。杀镰孢菌素的氨基酸链不是通过核糖体产生的，而是通过非核糖体肽合成酶产生的。已知的杀镰孢菌素的结构式显示于表1中(Biotechnol Lett.34，1327-1334，2012；其中的图1)。称为LI-F03a、LI-F03b直至LI-F08a和LI-F08b的化合物，由于其在杀镰孢菌素家族内的结构(参见表1)，在本文中也称为杀镰孢菌素LI-F03a、LI-F03b直至LI-F08a和LI-F08b。
表1：杀镰孢菌素家族的结构
杀镰孢菌素 X2 X3 X5
A(LI-F04a) D-Val L-Val D-Asn
B(LI-F04b) D-Val L-Val D-Gln
C(LI-F03a) D-Val L-Tyr D-Asn
D(LI-F03b) D-Val L-Tyr D-Gln
LI-F05a D-Val L-Ile D-Asn
LI-F05b D-Val L-Ile D-Gln
LI-F06a D-allo-Ile L-Val D-Asn
LI-F06b D-allo-Ile L-Val D-Gln
LI-F07a D-Val L-Phe D-Asn
LI-F07b D-Val L-Phe D-Gln
LI-F08a D-Ile L-allo-Ile D-Asn
LI-F08b D-Ile L-allo-Ile D-Gln
其中箭头定义在GHPD的羰基部分和L-Thr(L-苏氨酸)的氨基基团之间或在一个氨基酸的羰基基团和相邻氨基酸的氨基基团之间的单个(酰胺)键，其中箭头的尖端表示连接到所述氨基酸L-Thr或所述相邻氨基酸的氨基基团；且
其中单线(不带箭头)定义D-Ala(D-丙氨酸)的羰基基团和L-Thr的羟基基团之间的单个(酯)键；
其中GHPD是15-胍基-3-羟基十五烷酸。
在分离的杀镰孢菌素抗生素中，杀镰孢菌素A已经显示出最有前景的抗微生物活性，对抗各种临床上相关的真菌和革兰氏阳性细菌，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MIC值范围：0.78-3.12μg/ml)(ChemMedChem 7，871-882，2012)。已经建立了含有替代天然GHPD的12-胍基-十二烷酸(12-GDA)或12-氨基-十二烷酸(12-ADA)的杀镰孢菌素类似物的合成，但12-ADA替代GHPD导致抗微生物活性的完全失去，而12-GDA替代GHPD保留了抗微生物活性(Tetrahedron Lett.47，8587-8590，2006；ChemMedChem 7，871-882，2012)。
杀镰孢菌素A、B、C和D也被报道了可以抑制植物病原真菌，如尖镰孢、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)和托姆青霉(Penicillus thomii)(J.Antibiotics 49(2)，129-135，1996；J.Antibiotics 50(3)，220-228，1997)。杀镰孢菌素，如Li-F05、LI-F07和LI-F08，已经被发现具有对抗各种植物病原真菌(如串珠镰孢(Fusarium moniliforme)、尖镰孢、粉红镰孢(F.roseum)、藤仓赤霉(Giberellafujkuroi)、芝麻长蠕孢(Helminthosporium sesamum)和扩展青霉(Penicilliumexpansum))的一些抗真菌活性(J.Antibiotics 40(11)，1506-1514，1987)。杀镰孢菌素还具有对抗革兰氏阳性细菌(包括金黄色葡萄球菌)的抗细菌活性(J.Antibiotics 49，129-135，1996；J.Antibiotics 50，220-228，1997)。此外，杀镰孢菌素具有对抗斑点小球腔菌(Leptosphaeria maculans)的抗真菌活性(Can.J.Microbiol.48，159-169，2002)，斑点小球腔菌引起卡诺拉油菜(canola)的根黑腐病。此外，发现某些类芽孢杆菌菌株产生的杀镰孢菌素A和B及其相关的两种化合物(其中，D-allo-Thr经由其羟基基团，使用酯桥，与另外的丙氨酸键接)，在培养的欧芹细胞中诱导抗性反应并且抑制尖镰孢的生长(WO 2006/016558；EP 1788074 A1)。
WO 2007/086645描述了从多粘类芽孢杆菌菌株E681分离的杀镰孢菌素合成酶及其编码基因，该酶参与杀镰孢菌素A、B、C、D、LI-F03、LI-F04、LI-F05、LI-F07和LI-F08的合成。
迄今为止已经公开了几个多粘类芽孢杆菌菌株的基因组：例如，菌株M-1(NCBI登录号NC_017542；J.Bacteriol.193(29)，5862-63，2011；BMC Microbiol.13，137，2013)、菌株CR1(GenBank登录号CP006941；Genome Announcements 2(1)，1，2014)和菌株SC2(GenBank登录号CP002213和CP002214；NCBI登录号NC_014622；J.Bacteriol.193(1)，311-312，2011)，关于更多菌株，参见本文中图12的图例。多粘类芽孢杆菌菌株M-1已经以保藏号CGMCC 7581保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
Montefusco等在Int.J.Systematic Bacteriol.(43，388-390，1993)中描述了一个新的芽孢杆菌属细菌种并且建议命名为Bacillus peoriae，其可以与诸如栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)、凝固芽孢杆菌(B.coagulans)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)等其他芽孢杆菌菌株区分开来。据报道，所述新芽孢杆菌菌株产生孢子，为革兰氏阳性且产生过氧化氢酶，不产生氧化酶。其中概括了更多的生物化学特征。所述菌株可以从土壤或腐烂的蔬菜材料分离，命名为BD-57，并且以NRRL B-14750保藏于农业研究所(USDA，U.S.A.)，以及还以菌株DSM 8320保藏于DSMZ(参见下文)。基于进一步的生物化学和遗传分析，所述菌株之后被重新命名为皮尔瑞俄类芽孢杆菌(参见Int.J.Systematic Bacteriol.46，988-1003，1996)。最近使用PCR-DGGE方法评价了在玉米根际中类芽孢杆菌的多样性，描述于J.Microbiol.Methods 54，213-231，2003中。
已经在各种作物上建立了用于对抗作物疾病的生物农药。例如，生物农药已经在控制霜霉病中起着重要作用。它们的益处包括：0-天安全间隔期(pre-harvestinterval,PHI)以及能够用于中度至重度疾病压力下。
用于生物农药的主要生长区域是在种子处理和土壤改良的区域中。生物农药种子处理例如用于控制引起种子腐烂、猝倒、根腐和苗枯的土传真菌病原体。它们也可以用于控制种子内部携带的真菌病原体以及在种子表面上的真菌病原体。许多生物农药产品还显示出刺激植物宿主防御和其他生理过程的能力，这可以使得处理过的作物更加能够抵抗各种生物和非生物胁迫。
然而，生物农药在一些条件下也会具有缺陷，如特异性高(要求农害/病原体的准确识别和使用多重产品)、作用速度慢(因此，如果作物受到农害爆发的即时威胁，其是不合适的)、由于各种生物和非生物因素的影响而功效不定(因为生物农药通常是活的生物体，其通过在靶标昆虫害虫/病原体内繁殖来实现害虫/病原体控制)、和抗性产生。
因此，还需要对抗植物病原性微生物，特别是真菌的其它细菌菌株和其它抗微生物代谢物，其特征在于对抗所有种类的植物病原真菌的广谱活性。
发明概述
通过提供新的类芽胞杆菌属细菌菌株，令人惊讶地解决了所述问题，所述新菌株的特征在于独特的对抗植物病原真菌的拮抗活性谱，还延及植物叶病原体，例如选自链格孢属(Alternaria)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、致病疫霉(Phytophthora infestans)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。所述细菌菌株已经保藏于国际保藏单位：德意志微生物和培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)，Inhoffenstraβe 7B，38124Braunschweig，德国(下文称为DSMZ)。
此外，这些细菌菌株的全培养液、培养物基质和无细胞提取物显示出至少对抗链格孢属、灰葡萄孢和致病疫霉的抑制活性。有机提取物的生物活性导向分离导致了两种新的杀镰孢菌素型化合物(化合物1A和1B)的分离，其结构通过1D-和2D-NMR光谱以及质谱进行了阐明。
因此，本发明涉及分离的微生物，其是类芽孢杆菌家族的成员，具有以下菌株之一的至少一个鉴别性特征(identifying characteristics)：
1)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的类芽孢杆菌属菌株Lu16774，
2)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的类芽孢杆菌属菌株Lu17007，和
3)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的类芽孢杆菌属菌株Lu17015。
如本文中使用的，术语类芽孢杆菌属菌株与术语类芽孢杆菌菌株相同。
如本文中使用的，“分离物”是指从其天然来源分离的纯微生物培养物，如通过培养微生物单菌落获得的分离物。分离物是源自异质的野生微生物群体的纯培养物。
如本文中使用的，“菌株”是指，呈现出属于相同谱系的表型、生理、代谢和/或遗传性状的分离物或一组分离物，其区别于相同物种的其他分离物或菌株。
再一实施方案涉及如上定义的至少一种微生物的全培养液、上清液或无细胞提取物或级分或至少一种代谢物，其优选呈现出对抗至少一种植物病原体的拮抗活性。
如本文中使用的，“全培养液”(whole culture broth)是指，含有悬浮在培养基中的营养细胞和/或孢子和任选地由相应微生物产生的代谢物的微生物液体培养物。
如本文中使用的，“培养物基质”(culture medium)是指，可通过如下方法获得的培养基:在培养基(优选液体肉汤)中培养微生物，在除去生长在培养基中的细胞后的剩余物，例如，通过离心、过滤、沉淀或本领域公知的其他方式除去生长在液体肉汤中的细胞后剩余的上清液；包含例如由相应微生物产生并分泌至培养基中的代谢物。可以例如通过以约5,000至20,000×g(更优选约15,000×g)，在约2至30℃的温度(更优选在4至20℃的温度)，离心约10至60分钟(更优选约15至30分钟)，获得有时候也称为“上清液”的“培养物基质”。
如本文中使用的，“无细胞提取物”是指，微生物的营养细胞、孢子和/或全培养液的提取物，其可以通过本领域已知的细胞破坏方法获得的，包含由相应微生物产生的细胞代谢物，所述细胞破坏方法如基于溶剂的(例如，有机溶剂，如醇类，有时候与合适的盐组合)、基于温度的、施加剪切力、使用超声发生器进行的细胞破坏。可以通过常规浓缩技术，如干燥、蒸发、离心等，来浓缩所需的提取物。优选在使用前，也可以使用基于有机溶剂和/或水的介质，对粗提物进行一些洗涤步骤。
如本文中使用的，术语“代谢物”是指，由微生物(如真菌和细菌，特别是本发明的菌株)产生的具有本文中所述的任何有益作用的任何组分、化合物、物质或副产物(包括但不限于小分子次生代谢物、聚酮、脂肪酸合酶产物、非核糖体肽、核糖体肽、蛋白质和酶)，所述有益作用如农药活性或改善植物生长、植物的水利用效率、植物健康、植物外观、或与本文植物活性有关的土壤中的有益微生物群体。
如本文中使用的，“分离物”是指从其天然来源分离的纯微生物培养物，如通过培养微生物单菌落获得的分离物。分离物是源自异质的、野生微生物群体的纯培养物。
如本文中使用的，“菌株”是指，呈现出属于相同谱系的，而不同于相同物种的其他分离物或菌株的、表型和/或遗传性状的分离物或一组分离物。
再一实施方案涉及式I的新化合物及其农业上可接受的盐，
其中
R选自15-胍基-3-羟基十五烷酸(GHPD)和12-胍基十二烷酸(12-GDA)；
X1是苏氨酸；
X2是异亮氨酸；
X3是酪氨酸；
X4是苏氨酸；
X5选自谷氨酰胺和天冬酰胺；
X6是丙氨酸；且
其中箭头定义R的羰基部分和氨基酸X1的氨基基团之间或一个氨基酸的羰基基团和相邻氨基酸的氨基基团之间的单个(酰胺)键，其中箭头的尖端表示连接到所述氨基酸X1或所述相邻氨基酸的氨基基团；且
其中单线(无箭头头部)定义X6的羰基基团和X1的羟基基团之间的单个(酯)键；
并且涉及制备本发明的式I的化合物的方法，该方法包括培养本发明的菌株以及从全培养液中分离所述式I的化合物。
根据再一实施方案，本发明还涉及化合物1A和1B，其具有式I，其中R是GHPD，其中在化合物1A的情况中，X5是天冬酰胺，在化合物1B的情况中，X5是谷氨酰胺：
本发明还涉及包含本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、或式I的化合物及其盐的组合物，以及涉及其用于控制或抑制植物病原体或预防植物病原体感染或用于保护材料以对抗有害微生物的侵染破坏的用途；并涉及相应的方法，包括用有效量的本发明的组合物、菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、或式I的化合物及其盐，处理病原体、其栖息地、或待接受抗病原体攻击保护的材料或植物，或土壤或繁殖材料。
以下的发明详述、权利要求和附图中公开了本发明的其它实施方案。
发明详述
本发明涉及微生物菌株
1)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的类芽孢杆菌属菌株Lu16774，
2)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的类芽孢杆菌属菌株Lu17007，和
3)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的类芽孢杆菌属菌株Lu17015。
已经从多个欧洲位置(包括德国)的土壤样品中分离出菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015，并且依据布达佩斯条约于2013年2月20日由BASF SE(德国)以上述保藏号保藏于德意志微生物保藏中心Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)。
类芽孢杆菌属(之前为rRNA 3组杆菌)已经通过以下特征在表型和生理学上进行表征(Antonie van Leeuwenhoek 64，253-260(1993))：
-革兰氏阳性结构的杆状细胞，
-革兰氏染色弱反应，常常甚至是阴性染色的，
-分化成椭圆形内生孢子，其明显胀大了孢子囊(母细胞)，
-兼性厌氧生长，在不存在空气的情况下强烈生长，与是否存在硝酸盐无关，
-发酵各种糖，
-从各种糖(包括葡萄糖)形成酸和气体，
-从核糖醇和山梨糖醇不产生酸，
-脲酶阴性(强壮类芽孢杆菌(P.validus)除外)，
-精氨酸二水解酶(dihydrolase)阴性，
-不利用柠檬酸盐，
-在10％氯化钠存在下不生长，
-分泌多种降解DNA、蛋白质、淀粉的胞外水解酶；和/或
-40％至54％的DNA的G+C含量。
还通过16S rDNA分析(Antonie van Leeuwenhoek 64，253-260(1993))，表征了类芽孢杆菌属(之前为rRNA 3组杆菌)：
-在16S rDNA的可变区V5中具有特定的22-碱基序列(5’至3’)：TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT(Antonie van Leeuwenhoek 64，253-260(1993)，参见其中的表3)；和/或
-分离的或PCR扩增的染色体DNA与BG3探针(5’-TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT-3’)杂交(参见Antonie van Leeuwenhoek 64，253-260(1993))。
基于以下的形态学和生理学观察(参见本文中的实施例2.3)，确定了本发明的保藏菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015属于类芽孢杆菌属：
-杆状细胞
-椭圆形孢子
-膨胀的孢子囊
-厌氧生长
-发酵各种糖，包括葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖醇(mannit)、果糖、棉子糖、海藻糖和甘油，伴随酸形成
-从葡萄糖产生气体
-精氨酸二水解酶阴性
-不利用柠檬酸盐
-在5％或更高氯化钠存在下不生长
-产生降解淀粉、明胶、酪蛋白和七叶苷(esculin)的胞外水解酶。
此外，还通过16S rDNA分析，通过在16S rDNA中具有类芽孢杆菌特定的22-碱基序列(5’至3’)：5’-TCGATACCCTTGGTGCCGAAGT-3’(参见本文序列表中的SEQ ID NO:1(核苷酸840-861)、SEQ ID NO:2(840-861)、SEQ ID NO:3(844-865)和SEQ ID NO:4(840-861))，确定了本发明的保藏菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015属于类芽孢杆菌属。
此外，与24个不同的类芽孢杆菌菌株比较，完整16S rDNA的测序导致了保藏菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015与模式菌株巴西类芽孢杆菌(Paenibacillus brasiliensis)、胶冻样类芽孢杆菌(P.kribbensis)、杰米拉类芽孢杆菌(P.jamilae)、皮尔瑞俄类芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌，更优选与皮尔瑞俄类芽孢杆菌，特别是皮尔瑞俄类芽孢杆菌菌株BD-62的聚类(参见本文中的图1和2)。已知,多粘类芽孢杆菌和皮尔瑞俄类芽孢杆菌具有99.6至99.7％的16S rDNA序列同一性(J.Gen.Appl.Microbiol.48，281-285(2002))。
两个核苷酸序列之间的“同一性百分数”或“百分比相似性”表示，在比对序列的完整长度上残基的同一性百分数，通过在比较窗口(由两个序列之间的局部比对长度定义)中比较两个最佳局部对齐的序列来确定，如，例如，(对于十分相似的序列)借助程序AE2(比对编辑器2)人工比对后计算的同一性。两个序列之间的局部比对只包括根据标准认为足够相似的每个序列的区段，所述标准取决于用于进行比对的算法(例如，AE2、BLAST、rRNA分子的二级结构等)。同一性百分数计算如下：确定两个序列中出现相同核酸的位置的数量来产生匹配位置数，匹配位置数除以比较窗口中的总位置数，结果乘以100。
为了确定两个核酸序列(例如，表1的核苷酸序列之一及其同源物)的百分比序列同一性，为最佳比较目的而比对序列(例如，为了与另一核酸最佳对齐，可以在一个核酸序列中引入空位)。然后比较位于相应位置的碱基。当一个序列中的一个位置与另一序列中的相应位置被相同碱基占据时，则两个分子在该位置是相同的。可以理解，为确定序列同一性的目的，将DNA序列与RNA序列比较时，胸苷核苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。
为进行比对，将序列数据输入程序AE2(http://iubio.bio.indiana.edu/soft/ molbio/unix/ae2.readme)，根据所得到的rRNA分子的二级结构人工比对，并且与属于厚壁菌门(Firmicutes)的生物的代表性16S rRNA基因序列进行比较(Nucl.Acids Res.27，171-173，1999)。为了获得多个序列的％同一性值，将所有序列彼此比对(多重序列比对)。此外，与多重比对比较，为了获得在比对序列的更长链上两序列之间的％同一性值，按照以上所述的，使用AE2，进行了人工成对序列比对(成对序列比对)。
此外，使用限制性酶EcoRI，将类芽孢杆菌菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015与皮尔瑞俄类芽孢杆菌BD-62相比，使用Qualicon RiboPrintersystem，进行了自动化核糖体分型(ribotyping)，获得了所有三个新菌株与皮尔瑞俄类芽孢杆菌BD-62的0.24至0.5之间的相似性(实施例2.2和图12)。
总之，这些菌株已经被指定到以下的分类学组。
类芽孢杆菌菌株Lu16774和Lu17007都属于物种多粘类芽孢杆菌。
因此，本发明涉及微生物菌株
1)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的类芽孢杆菌属菌株Lu16774，
2)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的类芽孢杆菌属菌株Lu17007，和
3)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的类芽孢杆菌属菌株Lu17015。
根据本文中呈现的系统发生分析的结果(图12至22)和德国Borriss教授的未公开结果，提出异质物种多粘类芽孢杆菌需要新的分类学分类，分成两个亚种：
1)多粘类芽孢杆菌多粘亚种(Paenibacillus polymyxa ssp.polymyxa)和2)多粘类芽孢杆菌植物亚种(Paenibacillus polymyxa ssp.plantarum)和3)新物种－即，类芽孢杆菌附生新物种(Paenibacillus nov.spec.epiphyticus)。
模式菌株多粘类芽孢杆菌DSM36，与多粘类芽孢杆菌菌株SQR-21、CF05、CICC10580、NRRL B-30509和A18一起，在针对五个保守的管家基因(dnaN、gyrB、recA、recN和rpoA)分析的最大可能性树状图之每一个中，形成分开的簇(图17-21)。
通过测定平均氨基酸同一性(AAI)获得了非常相似的结果，平均氨基酸同一性常常用于确定细菌物种之间的系统发生关系。该方法基于氨基酸水平上核心基因组的平均同一性的计算(Proc.Natl.Acad.USA 102，2567-2572，2005)。根据图22中得到的AAI-矩阵，多粘类芽孢杆菌DSM36与多粘类芽孢杆菌SQR-21菌株一起形成亚簇，不同于其中所示的另两个亚簇。
菌株Lu16674和Lu17007与菌株多粘类芽孢杆菌M-1、1-43、SC2和Sb3-1一起，在针对五个保守的管家基因(dnaN、gyrB、recA、recN和rpoA)分析的最大可能性树状图之每一个中，形成第二个亚簇(图17-21)。根据图22中基于核心基因组分析的AAI-矩阵，该第二亚簇通过其代表性菌株Lu16674和Lu17007与多粘类芽孢杆菌M-1和SC2菌株一起得到确认。
两个亚簇之间的差异未显著到确立新的物种，但两个簇的代表菌株之间的AAI同一性水平约为97.5％，从而说明分成两个分开的亚种是合理的。
因此提出，根据模式多粘类芽孢杆菌菌株DSM36T将第一亚簇命名为多粘类芽孢杆菌多粘亚种。除了菌株DSM36，多粘类芽孢杆菌菌株SQR-21、CF05、CICC 10580、NRRL B-30509和A18应当也属于多粘类芽孢杆菌多粘亚种。
此外提出，将第二亚簇命名为新的亚种——多粘类芽孢杆菌植物亚种。除了菌株Lu16674和Lu17007，多粘类芽孢杆菌菌株M-1、1-43、SC2和Sb3-1也应当属于多粘类芽孢杆菌植物亚种。
在核心基因组的基因中，菌株Lu17015与模式菌株多粘类芽孢杆菌DSM36＝ATCC842只具有94.9％同一性(AAI)(图22)。因此，菌株Lu17015不能指定为物种多粘类芽孢杆菌，也不能指定为任何其他已知的类芽孢杆菌物种。对于菌株E681(94.7％)和CR2(94.9％)，发现了相似的值。这三个菌株彼此之间具有至少98.1％同一性(AAI)。根据Konstantinides和Tiedje的物种定义(Proc Natl.Acad.Sci.USA.102，2567-2572，2005)，菌株Lu17015以及菌株E681和CR2可以被指定为新的物种。因此，在此提出新物种－即，类芽孢杆菌附生新物种。相应地，类芽孢杆菌菌株Lu17015属于附生类芽孢杆菌(Paenibacillusepiphyticus)。提出了所述菌株应当是模式菌株。同样，基于五个管家基因的序列比较的树状图(图17-21)显示出，这个簇与远离所有其他多粘类芽孢杆菌菌株。除了Lu17015，提出多粘类芽孢杆菌菌株E681、CR2TD94、DSM365和WLY78也应当属于类芽孢杆菌附生新物种。
因此，本发明涉及微生物菌株
4)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的多粘类芽孢杆菌植物亚种菌株Lu16774，
5)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的多粘类芽孢杆菌植物亚种菌株Lu17007，
6)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的附生类芽孢杆菌菌株Lu17015。
除了菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015，本发明还涉及任何类芽孢杆菌菌株，不管其是物理上源自Lu16774、Lu17007和Lu17015任一个菌株的原始保藏物的或是独立分离的，只要它们保留保藏的类芽孢杆菌菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015的至少一个鉴别性特征即可。本发明这样的类芽孢杆菌菌株包括菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015之任一个的任何后代，包括所述菌株的突变株。
术语“突变株”是指，通过直接突变选择获得的微生物，但也包括已经进行了进一步诱变或操纵(例如，通过引入质粒)的微生物。因此，实施方案包括代表性微生物的突变株、变体和或衍生物，包括天然产生的和人工诱导的突变株。例如，可以通过使微生物接受已知的诱变剂(如，X-射线、UV照射或N-甲基-亚硝基胍)，使用常规方法，来诱导突变株。所述处理后，可以进行显示出所需特征的突变菌株的筛选。
可以通过本领域已知的任何方法来获得突变菌株，如直接突变选择、化学诱变或基因操纵(例如，通过引入质粒)。例如，可以通过施用已知的诱变剂(如，X-射线、UV照射或N-甲基-亚硝基胍)来获得这样的突变株。所述处理后，可以进行显示出所需特征的突变菌株的筛选。
本发明的类芽孢杆菌菌株特别是包含如下DNA序列的菌株，所述DNA序列表现出与菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015之任一个的16S rDNA序列(即，序列表中SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列之任一个)有至少99.6％，优选至少99.8％，甚至更优选至少99.9％和特别地100.0％的核苷酸序列同一性。
根据再一实施方案，本发明的类芽孢杆菌菌株特别是包含如下DNA序列的菌株，所述DNA序列表现出与菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015之任一个的16S rDNA序列(即，序列表中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中所示核苷酸序列之任一个)有100％的核苷酸序列同一性。
根据再一实施方案，本发明类芽孢杆菌菌株是这样的菌株，其完整的16S rDNA序列，在比对序列窗口内最佳比对后，与序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的至少一个具有至少99.6％同一性或与SEQ ID NO:3具有至少99.8％同一性；优选与序列SEQ ID NO:1、SEQID NO:2和SEQ ID NO:3中的至少一个具有至少99.8％同一性；更优选与序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的至少一个具有至少99.9％同一性；甚至更优选与序列SEQID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的至少一个具有高于99.9％同一性；特别地与序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中的至少一个具有100％同一性。
根据再一实施方案，本发明的类芽孢杆菌菌株选自：
a)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的菌株Lu16774；
b)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的菌株Lu17007；
c)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的菌株Lu17015；
d)包含DNA序列的菌株，所述DNA序列表现出
d1)与DNA序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9具有至少99.6％核苷酸序列同一性；或
d2)与DNA序列SEQ ID NO:14具有至少99.8％核苷酸序列同一性；或
d3)与DNA序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10具有至少99.9％核苷酸序列同一性；或
d4)与DNA序列SEQ ID NO:15具有至少99.2％核苷酸序列同一性；或
d5)与DNA序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11具有至少99.2％核苷酸序列同一性；或
d6)与DNA序列SEQ ID NO:16具有至少99.8％核苷酸序列同一性；或
d7)与DNA序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12具有至少99.8％核苷酸序列同一性；或
d8)与DNA序列SEQ ID NO:17具有至少99.3％核苷酸序列同一性；
d9)与DNA序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:13具有100％核苷酸序列同一性；或
d10)与DNA序列SEQ ID NO:18具有至少99.8％核苷酸序列同一性。
本发明的类芽孢杆菌菌株特别是，包含与DNA序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9呈现至少99.6％核苷酸序列同一性的dnaN DNA序列或包含与DNA序列SEQ ID NO:14呈现至少99.8％核苷酸序列同一性的DNA序列的菌株。
根据再一实施方案，本发明的类芽孢杆菌菌株是，其完整的dnaN DNA序列在比对序列窗口内最佳比对后与DNA序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:9中的至少一个呈现至少99.6％同一性或与SEQ ID NO:14呈现至少99.8％同一性；优选与SEQ ID NO:14具有至少99.9％同一性；特别地与SEQ ID NO:14具有100％同一性的菌株。
本发明的类芽孢杆菌菌株特别是，包含与菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015之任一个的dnaN DNA序列(即，DNA序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14中的任何一个)呈现至少99.8％，特别是100％核苷酸序列同一性的DNA序列的菌株。
本发明的类芽孢杆菌菌株特别是，包含与DNA序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10呈现至少99.9％核苷酸序列同一性的gyrB DNA序列或包含与DNA序列SEQ ID NO:15呈现至少99.2％核苷酸序列同一性的DNA序列的菌株。
根据再一实施方案，本发明的类芽孢杆菌菌株是，其完整的gyrB DNA序列在比对序列窗口内最佳比对后与DNA序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:10中的至少一个呈现至少99.9％同一性或与SEQ ID NO:15呈现至少99.9％同一性；优选与SEQ ID NO:15呈现至少99.9％同一性；特别地与SEQ ID NO:15具有100％同一性的菌株。
本发明的类芽孢杆菌菌株特别是，包含与菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015的任一个的gyrB DNA序列(即，DNA序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:15中的任何一个)呈现100％核苷酸序列同一性的DNA序列的菌株。
本发明的类芽孢杆菌菌株特别是，包含与DNA序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11呈现至少99.2％核苷酸序列同一性的recF DNA序列或包含与DNA序列SEQ ID NO:16呈现至少99.8％核苷酸序列同一性的DNA序列的菌株。
根据再一实施方案，本发明的类芽孢杆菌菌株是，其完整的recF DNA序列在比对序列窗口内最佳比对后与DNA序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:11中的至少一个具有至少99.2％同一性或与SEQ ID NO:16具有至少99.8％同一性；优选与SEQ ID NO:16具有至少99.9％同一性；特别地与SEQ ID NO:16具有100％同一性的菌株。
本发明的类芽孢杆菌菌株特别是，包含与菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015的任一个的recF DNA序列(即，DNA序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16中的任何一个)呈现至少99.8％，特别是100％核苷酸序列同一性的DNA序列的菌株。
本发明的类芽孢杆菌菌株特别是，包含与DNA序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12呈现至少99.8％核苷酸序列同一性的recN DNA序列或包含与DNA序列SEQ ID NO:17呈现至少99.3％核苷酸序列同一性的DNA序列的菌株。
根据再一实施方案，本发明的类芽孢杆菌菌株是，其完整的recN DNA序列在比对序列窗口内最佳比对后与DNA序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:12中的至少一个具有至少99.8％同一性或与SEQ ID NO:17具有至少99.3％同一性；优选与SEQ ID NO:17具有至少99.6％同一性；特别地与SEQ ID NO:17具有100％同一性的菌株。
本发明的类芽孢杆菌菌株特别是，包含与菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015的任一个的recN DNA序列(即，DNA序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17中的任何一个)呈现至少99.8％，特别是100％核苷酸序列同一性的DNA序列的菌株。
本发明的类芽孢杆菌菌株特别是，包含与DNA序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:13呈现100％核苷酸序列同一性的rpoA DNA序列或包含与DNA序列SEQ ID NO:18呈现至少99.8％核苷酸序列同一性的DNA序列的菌株。
根据再一实施方案，本发明的类芽孢杆菌菌株是，其完整的rpoA DNA序列在比对序列窗口内最佳比对后与DNA序列SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:13中的至少一个具有100％同一性或与SEQ ID NO:18具有至少99.8％同一性；优选与SEQ ID NO:17具有至少99.9％同一性；特别地与SEQ ID NO:18具有100％同一性的菌株。
本发明的类芽孢杆菌菌株特别是，包含与菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015的任一个的rpoA DNA序列(即，DNA序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:18中的任何一个)呈现100％核苷酸序列同一性的DNA序列的菌株。
再一实施方案涉及分离的微生物，其是类芽孢杆菌家族的成员，具有以下菌株之一的至少一个鉴别性特征：
1)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu16774；
2)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu17007；或
3)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu17015。
再一实施方案涉及类芽孢杆菌菌株，其选自：
1)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的菌株Lu16774；
2)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的菌株Lu17007；和
3)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的菌株Lu17015，
4)具有所述菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015之一的至少一个鉴别性特征的菌株。
本发明的另一个实施方案涉及选自以下菌株的分离微生物：
1)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu16774；
2)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu17007；和
3)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu17015；
其显示出对抗至少一种植物病原体的拮抗活性，能够产生至少一种杀镰孢菌素型化合物；
或其保留所述能力的突变菌株，即，保留所述对抗至少一种植物病原体的拮抗活性和保留所述产生至少一种杀镰孢菌素型化合物的能力。
再一实施方案涉及选自以下的微生物：
1)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu16774；
2)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu17007；和
3)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu17015；
或具有所述菌株之一的全部鉴别性特征的突变菌株。
保藏的类芽孢杆菌菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015的一个鉴别性特征是，它们能够产生至少一种式I的化合物，优选选自化合物1A和1B，特别是产生化合物1A和1B(其是相应菌株的代谢物)；及其在农业上可接受的盐。
因此，根据本发明的一个方面，本发明的类芽孢杆菌菌株能够产生至少一种式I的化合物，更优选产生化合物1A或1B，特别地产生化合物1A和1B；及其农业上可接受的盐。
因此，根据本发明的一个方面，本发明的类芽孢杆菌菌株能够在包含至少一种碳源和一种氮源(如本文中定义)的生长培养基中产生至少一种式I的化合物，更优选产生化合物1A或1B，特别是产生化合物1A和1B；及其农业上可接受的盐。
因此，根据本发明的一个方面，本发明的类芽孢杆菌菌株在包含至少一种碳源和一种氮源(如本文中定义)的生长培养基中产生至少一种式I的化合物，更优选产生化合物1A或1B，特别是产生化合物1A和1B；及其农业上可接受的盐。
本发明的另一个实施方案涉及选自以下的分离微生物：
1)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu16774；
2)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu17007；和
3)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu17015；
其显示出对抗至少一种植物病原体的拮抗活性，和能够产生至少一种式I的杀镰孢菌素型化合物，优选选自化合物1A和1B，特别是产生化合物1A和1B；
或其保留所述能力的突变菌株，即，保留所述对抗至少一种植物病原体的拮抗活性，和保留所述产生至少一种式I的杀镰孢菌素型化合物，优选选自化合物1A和1B，特别是产生化合物1A和1B的能力。
本发明的另一个实施方案涉及选自以下的分离微生物：
1)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu16774；
2)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu17007；和
3)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu17015；
其显示出对抗至少一种植物病原体的拮抗活性，并且在包含至少一种碳源和一种氮源(如本文中定义)的生长培养基中能够产生至少一种式I的杀镰孢菌素型化合物，优选选自化合物1A和1B，特别是产生化合物1A和1B；
或其保留所述能力的突变菌株，即，保留所述对抗至少一种植物病原体的拮抗活性，和保留所述产生至少一种式I的杀镰孢菌素型化合物，优选选自化合物1A和1B，特别是产生化合物1A和1B的能力。
本发明的另一个实施方案涉及选自以下的分离微生物：
1)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu16774；
2)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu17007；和
3)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的类芽孢杆菌菌株Lu17015；
其显示出对抗至少一种植物病原体的拮抗活性，并产生至少一种式I的杀镰孢菌素型化合物，优选选自化合物1A和1B，特别是产生化合物1A和1B；
或其保留所述能力的突变菌株，即，保留所述对抗至少一种植物病原体的拮抗活性，和保留所述产生至少一种式I的杀镰孢菌素型化合物，优选选自化合物1A和1B，特别是产生化合物1A和1B的能力。
保藏的类芽孢杆菌菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015或其突变株的再一个鉴别性特征是，除了能够产生至少一种式I的化合物(优选选自化合物1A和1B，特别是产生化合物1A和1B)以外，它们还能够产生至少一种选自杀镰孢菌素A、杀镰孢菌素B、杀镰孢菌素C、杀镰孢菌素D、LI-F06a、LI-F06b和LI-F08b的化合物。
因此，根据本发明的再一个方面，如本文中公开的，本发明的类芽孢杆菌菌株能够产生至少一种式I的杀镰孢菌素，优选选自化合物1A和1B，特别是产生化合物1A和1B，并能够产生至少一种选自杀镰孢菌素A、杀镰孢菌素B、杀镰孢菌素C、杀镰孢菌素D、LI-F06a、LI-F06b和LI-F08b的化合物。
根据本发明的再一个方面，如本文中公开的，本发明的类芽孢杆菌菌株能够产生至少一种式I的杀镰孢菌素，优选选自化合物1A和1B，特别是产生化合物1A和1B，并能够产生至少三种选自杀镰孢菌素A、杀镰孢菌素B、杀镰孢菌素C、杀镰孢菌素D、LI-F06a、LI-F06b和LI-F08b的化合物。
根据本发明的再一个方面，如本文中公开的，本发明的类芽孢杆菌菌株能够产生至少一种式I的杀镰孢菌素，优选选自化合物1A和1B，特别是产生化合物1A和1B，并能够产生至少五种选自杀镰孢菌素A、杀镰孢菌素B、杀镰孢菌素C、杀镰孢菌素D、LI-F06a、LI-F06b和LI-F08b的化合物。
根据本发明的再一个方面，如本文中公开的，本发明的类芽孢杆菌菌株能够产生至少一种式I的杀镰孢菌素，优选选自化合物1A和1B，特别是产生化合物1A和1B，并能够产生杀镰孢菌素A、杀镰孢菌素B、杀镰孢菌素C、杀镰孢菌素D和LI-F08b。
保藏的类芽孢杆菌菌株的再一个鉴别性特征是它们的抗真菌活性。特别地，发现这些菌株能有效对抗植物病原体的感染，所述病原体包括链格孢属物种、灰葡萄孢、致病疫霉和核盘菌，其中链格孢属物种优选选自茄链格孢(A.solani)和链格孢(A.alternata)，特别是茄链格孢。
因此，根据本发明的再一个方面，本发明的类芽孢杆菌菌株具有抗真菌活性，特别是对抗选自链格孢属物种、灰葡萄孢、致病疫霉和核盘菌的植物病原体，其中链格孢属物种优选选自茄链格孢和链格孢，特别是茄链格孢。更特别地，本发明的类芽孢杆菌菌株具有对抗所述病原体中的至少两种或全部四种的抗真菌活性。
根据本发明的再一个活性，本发明的类芽孢杆菌菌株具有对抗植物病原体茄链格孢、灰葡萄孢、致病疫霉和核盘菌的抗真菌活性。
可以使用所需的植物病原真菌，如链格孢属物种、灰葡萄孢、致病疫霉和核盘菌，在体外对抗测试中，证实类芽孢杆菌菌株对抗植物病原体的拮抗活性，其中链格孢属物种优选选自茄链格孢和链格孢，特别是茄链格孢。
作为这些植物病原真菌的生长培养基，使用每升包含以下物质的ISP2培养基：10g麦芽提取物(Sigma Aldrich，70167)；4g细菌培养用酵母提取物(Becton Dickinson，212750)；4g葡萄糖一水合物(Sigma Aldrich，16301)；20g琼脂(Becton Dickinson，214510)，pH约7，重蒸水。作为PHYTIN的生长培养基，使用每升包含以下物质的V8培养基：200ml蔬菜汁，3g碳酸钙(Merck Millipore，1020660250)；30g琼脂(Becton Dickinson，214510)，pH6.8，重蒸水。
将类芽孢杆菌菌株点种在琼脂平板的一侧。将含有一个活跃生长的植物病原体的琼脂块(大约0.3cm2)放在平板中央。在约25℃孵育7-14天后，检查植物病原体的生长，尤其是针对抑制区。可以评价以下拮抗作用：通过评价无真菌区(抑制区)的直径，进行抗生作用的评分。通过将带有细菌菌株的平板上的真菌病原体的生长直径与对照平板进行比较，进行竞争作用的评分。在细菌生长超过真菌病原体以及真菌寄生物生长超过病原体的情况中，可以记录真菌寄生作用。这可以通过显微镜观察。
保藏的类芽孢杆菌菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015的另一个鉴别性特征是，它们能够产生和分泌至少一种分解酶(lytic enzyme)，所述酶优选选自几丁质酶、纤维素酶和淀粉酶(参见实施例6)，甚至更优选至少几丁质酶和纤维素酶；特别是在如本文中定义的包含至少一种碳源和一种氮源的生长培养基中。
因此，根据本发明的再一个方面，本发明的类芽孢杆菌菌株能够产生和分泌至少一种分解酶，所述酶优选选自几丁质酶、纤维素酶和淀粉酶，甚至更优选至少几丁质酶和纤维素酶；特别是在如本文中定义的包含至少一种碳源和一种氮源的生长培养基中。
更具体地，本发明涉及保藏菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015以及任何具有保藏菌株的一个或多个鉴别性特征的类芽孢杆菌菌株，其中鉴别性特征选自：
(a)如本文中公开的，对抗选自链格孢属物种、灰葡萄孢、致病疫霉和核盘菌的植物病原体的抗真菌活性，其中链格孢属物种优选选自茄链格孢和链格孢，特别是茄链格孢；
(b)如本文中公开的，产生至少一种式I的杀镰孢菌素型化合物，特别是化合物1A和/或1B的能力；
(c)如本文中公开的，产生至少一种选自杀镰孢菌素A、B、C、D、LI-F06a、LI-F06b和LI-F08b的化合物的能力；和
(d)如本文中公开的，产生和分泌至少一种分解酶的能力，所述酶选自几丁质酶、纤维素酶和淀粉酶。
更优选，所述类芽孢杆菌菌株在如本文中定义的包含至少一种碳源和一种氮源的生长培养基中具有(b)、(c)和(d)所述及的能力。
特别地，本发明的类芽孢杆菌菌株具有保藏菌株的两个或更多个鉴别性特征，尤其优选所述菌株具有至少特征(a)和(b)。例如，根据一个优选实施方案，本发明的菌株(a)具有对抗选自链格孢属物种、灰葡萄孢、致病疫霉和核盘菌的植物病原体的抗真菌活性，其中链格孢属物种优选选自茄链格孢和链格孢，特别是茄链格孢；和(b)能够产生至少一种式I的化合物，并且特别是化合物1B。根据再一优选的实施方案，本发明的菌株(a)具有对抗选自链格孢属物种、灰葡萄孢、致病疫霉和核盘菌的三种或全部植物病原体的抗真菌活性，其中链格孢属物种优选选自茄链格孢和链格孢，特别是茄链格孢；和(b)能够产生至少一种式I的化合物，更优选产生化合物1A或1B，特别是产生化合物1A和1B。
根据一个本发明的实施方案，以分离或基本上纯化的形式提供本发明的菌株。
术语“分离的”或“基本上纯化的”用来表示，本发明的菌株已经从天然环境取出并已经进行分离或分开，并且至少60％不含，优选至少75％不含，和更优选至少90％不含，甚至更优选至少95％不含和最优选至少99％不含与其天然相关的其他组分。通过培养微生物单菌落获得的分离物是本发明的分离菌株的实例。
可以以任何生理状态提供本发明的菌株，如活性的或休眠的。例如可以以冷冻、干燥或冻干或部分脱水(WO 2008/002371中给出了产生部分脱水的生物体的程序)或孢子的形式提供休眠菌株。
根据本发明的实施方案，以孢子的形式提供本发明的菌株。
根据本发明再一个实施方案，以包含本发明菌株的全培养液的形式提供本发明的菌株。
培养物优选是分离的或基本上纯化的培养物。
术语“分离的培养物”或“基本上纯化的培养物”是指，本发明菌株的培养物，其不包括显著含量的、通常在菌株生长和/或菌株通常可获自的天然栖息地中发现的其他物质。因此，这样的“分离的培养物”或“基本上纯化的培养物”至少60％不含，优选至少75％不含，和更优选至少90％不含，甚至更优选至少95％不含和最优选至少99％不含通常在菌株生长的和/或通常菌株可获自的天然栖息地中发现的其他物质。这样的“分离的培养物”或“基本上纯化的培养物”通常不包括含量足以干扰本发明菌株复制的任何其他微生物。然而，本发明的分离培养物可以组合以制备混合的本发明菌株培养物和其它的生物农药，优选微生物农药。
本发明涉及用于发酵生产如本文中所述的抗病原性生物农药的方法。
根据本发明使用的菌株可以连续培养，或在分批工艺中或在补料分批或重复的补料分批工艺中不连续培养。已知的培养方法的综述参见Chmiel的教科书(Bioprozesstechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav FischerVerlag,Stuttgart，1991))或Storhas的教科书(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
用于微生物培养的培养基必须以合适的方式满足特定菌株的需求。用于各种微生物的培养基描述在美国细菌学协会的手册“普通细菌学方法手册”(Washington D.C.，USA，1981)中。
根据本发明可以使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。优选的碳源是糖类，如单糖、双糖或多糖。非常好的碳源例如是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖类也可以经由复杂化合物加入培养基中，如糖蜜、或其他来自糖精制的副产物。添加多种碳源也可以是有利的。其他可用的碳源是油类和脂肪，如大豆油、葵花油、花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸，醇类如甘油、甲醇或乙醇，以及有机酸如乙酸或乳酸。氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的材料。氮源的实例包括氨气或铵盐(如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵)、硝酸盐、尿素、氨基酸、或复杂氮源，如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉膏等。氮源可以分开使用或作为混合物使用。可以存在于培养基中的无机盐化合物包括钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。无机含硫化合物，例如，硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物，以及有机硫化合物，如硫醇(mercaptan)和硫醇(thiol)，可以用作硫源。磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐可以用作磷源。可以将螯合剂加入培养基中，以将金属离子保持在溶液中。尤为合适的螯合剂包括二羟基酚类，如儿茶酚，或原儿茶酸，或有机酸，如柠檬酸。根据本发明使用的发酵培养基还可以含有其他生长因子，如维生素或生长促进剂，其包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐类常常来自培养基的复杂成分，如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。此外，可以将合适的前体加入培养基中。培养基中化合物的确切组成强烈地取决于特定的实验并且必须针对每种特定的情况单独确定。关于培养基优化的信息可以在教科书“应用微生物学、生理学、实用方法”(Publ.P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)p.53-73，ISBN 0 19 963577 3)中找到。生长培养基也可以获自商业供应商，如Standard 1(Merk)或BHI(脑心浸液，DIFCO)等。
根据本发明可以使用的优选生长培养基包含一种或多种碳源，选自L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡糖胺、D-半乳糖、L-天冬氨酸、D-海藻糖、D-甘露糖、甘油、D-葡糖酸、D-木糖、D-甘露糖醇、D-核糖、D-果糖、α-D-葡萄糖、麦芽糖、D-蜜二糖、胸苷、α-甲基-D-半乳糖苷、α-D-乳糖、乳果糖、蔗糖、尿苷、α-羟基戊二酸-γ-内酯、β-甲基-D-葡糖苷、核糖醇、麦芽三糖、2-脱氧腺苷、腺苷、柠檬酸、粘酸、D-纤维二糖、肌苷、L-丝氨酸、L-丙氨酰-甘氨酸、D-半乳糖醛酸、α-环糊精、β-环糊精、糊精、菊粉、果胶、苦杏仁苷、龙胆二糖、乳糖醇、D-松三糖、α-甲基-D-葡糖苷、β-甲基-D-半乳糖苷、β-甲基-D-木糖苷、帕拉金糖、D-棉子糖、水苏糖、松二糖、γ-氨基丁酸、D-葡糖胺、D-乳酸、L-赖氨酸、3-羟基2-丁酮；和一种或多种氮源，选自氨、亚硝酸盐、硝酸盐、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、氨基酸二聚物：Ala-Asp、AlaGln、Ala-Glu、Ala-His、Gly-Gln、Gly-Glu、Gly-Met和Met-Ala；特别是硝酸盐。这些培养基可以补充无机盐和维生素和/或微量元素。所述菌株能够在这些生长培养基中产生化合物1A和1B。
通过加热(在2.0巴和121℃下20分钟)或通过无菌过滤，将培养基的所有组分灭菌。组分可以一起灭菌，或如果需要，分开灭菌。培养基的所有组分可以在培养开始时就存在，或任选地可以连续或通过分批补料来添加。
培养温度通常为15℃至36℃，优选25℃至33℃，并且在实验过程中可以保持恒定或可以改变。培养基的pH值应当在5至8.5的范围中，优选大约7.0。可以通过添加碱性化合物，如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物，如磷酸或硫酸，控制培养过程中用于培养的pH值。消泡剂，例如，脂肪酸多元醇酯，可以用于控制泡沫。为了维持质粒的稳定性，具有选择性作用的合适物质，例如，抗生素，可以加入培养基。将氧或含氧气体混合物，例如，环境空气，加入培养物中，以维持需氧条件。培养物的温度通常为20℃至45℃。持续培养直至形成最大所需产物。这通常在10小时至160小时内实现。
特别地，本发明的菌株可以在各种标准微生物学培养基，如Luria-Bertani肉汤(LB)、胰胨豆胨肉汤(TSB)、酵母提取物/麦芽提取物/葡萄糖肉汤(YMG，ISP2)中，在液体培养基或在皮氏培养皿上琼脂固化的培养基中，在15℃至36℃，培养18至360h。通气可能是需要的。可以将细菌细胞(营养细胞和孢子)洗涤并浓缩(例如，通过在7,000×g，在约15至30℃温度，离心约15分钟)。
本发明还涉及，通过在培养基中培养本发明的菌株并从培养液中分离出培养基可获得的培养物基质(因此，从全培养液中除去生长在培养基中的细胞后的剩余物)，例如，全培养液的上清液，即，通过离心、过滤、沉淀或本领域公知的其他方式，除去生长在培养液中的细胞和其他碎片时剩余的液体培养液。例如，通过在约5,000至20,000×g下(更优选在约15,000×g)，在约2至30℃的温度(更优选在4至20℃的温度)，离心约10至60分钟(更优选约15至30分钟)，可以获得上清液。
这样的培养物基质含有培养菌株产生的农药代谢物。
本发明还涉及本发明菌株的无细胞提取物。为了产生无细胞提取物，可以按照以上所述的培养本发明的菌株。还可以通过高频超声波，通过高压(例如，在弗氏压碎器中)，通过渗压裂解(osmolysis)，通过去污剂、分解酶或有机溶剂的作用，通过均质机、或通过所列方法中的几种的组合，来破坏细胞。提取优选使用有机溶剂或溶剂混合物来进行，更优选使用醇(例如，甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇等)，甚至更优选使用2-丙醇(例如，以与培养物体积1:1的比例)。通过添加盐，如NaCl，可以增强相分离。可以收集有机相，并可以通过常规蒸馏和/或干燥，除去溶剂或溶剂混合物，接着重悬浮于甲醇中，并过滤。
这样的提取物含有培养菌株产生的农药代谢物。
可以根据常规方法从这样的培养基或提取物回收本发明菌株特异性的农药代谢物，特别是在已经按照以上所述的培养了本发明的菌株后。
本发明的方法可以进一步包括回收各单个农药代谢物的步骤。
术语“回收”包括从培养物基质或无细胞提取物提取、收获、分离或纯化化合物。可以根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法来进行化合物的回收，所述方法包括，但不限于，使用常规树脂(例如，阴离子或阳离子交换树脂、非离子型吸附树脂等)处理、使用常规吸附剂(例如，活性炭、硅酸、硅胶、纤维素、矾土等)处理、改变pH、溶剂提取(例如，使用常规溶剂，如醇、乙酸乙酯、己烷等)、蒸馏、透析、过滤、浓缩、结晶、重结晶、pH调节、冻干等。例如，可以通过首先除去微生物，从培养物基质回收代谢物。然后将剩余的培养液通过阳离子交换树脂，以除去不需要的阳离子，然后通过阴离子交换树脂，以除去不需要的无机阴离子和有机酸。
在新的类芽孢杆菌菌株的全培养液中已经发现了几种代谢物。详细研究并鉴定了九种代谢物(参见实施7，图1)。发现其中两种是新的(化合物1A和化合物1B)。已经发现本发明的三种类芽孢杆菌菌株全部产生化合物1A和1B(参见表17)，但在相关的皮尔瑞俄类芽孢杆菌菌株NRRL BD-62的全培养液中没有发现这些化合物。
因此，本发明还涉及式I的化合物及其农业上可接受的盐
其中
R选自15-胍基-3-羟基十五烷酸(GHPD)和12-胍基十二烷酸(12-GDA)；
X1是苏氨酸；
X2是异亮氨酸；
X3是酪氨酸；
X4是苏氨酸；
X5选自谷氨酰胺和天冬酰胺；
X6是丙氨酸；且
其中箭头定义R的羰基部分和氨基酸X1的氨基基团之间或一个氨基酸的羰基基团和相邻氨基酸的氨基基团之间的单个(酰胺)键，其中箭头的尖端表示连接到所述氨基酸X1或所述相邻氨基酸的氨基基团；且
其中单线(无箭头头部)定义X6的羰基基团和X1的羟基基团之间的单个(酯)键。
根据再一个实施方案，式I中的X1优选是L-苏氨酸。
根据再一个实施方案，式I中的X2优选是D-异亮氨酸或D-别-异亮氨酸。
根据再一个实施方案，式I中的X3优选是L-酪氨酸。
根据再一个实施方案，式I中的X4优选是D-别-苏氨酸。
根据再一个实施方案，式I中的X5优选是D-谷氨酰胺或D-天冬酰胺。
根据再一个实施方案，式I中的R优选是GHPD。
对于式I的化合物，式I也可以如下描绘：
其中
X选自-NH–(C＝O)-CH2-CH(OH)-(CH2)12-NH-C(＝NH)NH2和-NH–(C＝O)-(CH2)11-NH-C(＝NH)NH2；
R1是1-羟乙基；
R2是1-甲基丙基(叔-丁基)；
R3是4-羟基苄基；
R4是1-羟乙基；
R5选自氨基甲酰基乙基和氨基甲酰基甲基；
R6是甲基。
类似地，基于这种替代的式I描述的优选实施方案如下：
此式I中的R1优选是(1S,2R)-1-羟乙基。
此式I中的R2优选是(1R,2R)-1-甲基丙基或(1R,2S)-1-甲基丙基。
此式I中的R3优选是(S)-4-羟基-苄基。
此式I中的R4优选是(1S,2R)-1-羟乙基。
此式I中的R5优选是(R)-氨基甲酰基乙基和(R)-氨基甲酰基甲基。
此式I中的X优选是
-NH–(C＝O)-CH2-CH(OH)-(CH2)12-NH-C(＝NH)NH2。
根据再一个实施方案，本发明还涉及化合物1A和1B，其具有式I，其中R是GHPD，并且在化合物1A的情况中，X4是天冬酰胺，在化合物1B的情况中，X4是谷氨酰胺。
来自本发明菌株的农药代谢物优选选自式I的化合物，其中R是GHPD，特别是选自化合物1A和1B，其可以通过从本发明菌株的培养物(即，全培养液)提取和分离获得。
此外，可以以类似本领域已知的方法(Biopolymers 80(4)，541，2005；J.PeptideSci.12S，219，2006；Tetrahedron Lett.47(48)，8587-90，2006；Biopolymers 88(4)，568，2007；ChemMedChem 7，871-882，2012)来合成式I的杀镰孢菌素型化合物，包括其中R是GHPD的那些化合物。
本发明还涉及所述式I的杀镰孢菌素型化合物的农业上可接受的盐，特别是酸加成盐。可以通过本领域公知的常规方法获得所述盐，例如，通过将本发明的化合物与合适的酸反应来形成酸加成盐。有用的酸加成盐的阴离子主要是氯离子、溴离子、氟离子、碘离子、硫酸氢根、甲基硫酸根、硫酸根、二氢磷酸根、氢-磷酸根、硝酸根、碳酸氢根、碳酸根、六氟硅酸根、六氟磷酸根、苯甲酸根、以及C1-C4-烷酸的阴离子，优选甲酸、乙酸、丙酸和丁酸。
因此，本发明还涉及微生物的全培养液，其包含至少一种式I的化合物或其农业上可接受的盐，优选选自化合物1A和1B或其农业上可接受的盐，特别是所述全培养液包含化合物1A和1B或其农业上可接受的盐。
根据再一个实施方案，本发明还涉及类芽孢杆菌属的微生物的全培养液，其包含至少一种式I的化合物或其农业上可接受的盐，优选选自化合物1A和1B或其农业上可接受的盐，特别是所述全培养液包含化合物1A和1B或其农业上可接受的盐。
根据再一个实施方案，本发明还涉及如上鉴定和定义的本发明的至少一种类芽孢杆菌菌株的全培养液，其包含至少一种式I的化合物或其农业上可接受的盐，优选选自化合物1A和1B或其农业上可接受的盐，特别是所述全培养液包含化合物1A和1B或其农业上可接受的盐。
所述杀镰孢菌素型化合物被分泌至能够产生其的相应微生物的培养物基质中。
因此，本发明还涉及微生物的培养物基质和/或无细胞提取物，其包含至少一种式I的化合物或其农业上可接受的盐，优选选自化合物1A和1B或其农业上可接受的盐，特别是所述培养物基质和/或无细胞提取物包含化合物1A和1B或其农业上可接受的盐。
根据再一个实施方案，本发明还涉及类芽孢杆菌属的微生物的培养物基质和/或无细胞提取物，其包含至少一种式I的化合物或其农业上可接受的盐，优选选自化合物1A和1B或其农业上可接受的盐，特别是所述培养物基质和/或无细胞提取物包含化合物1A和1B或其农业上可接受的盐。
根据再一个实施方案，本发明还涉及如上鉴定和定义的本发明的至少一种类芽孢杆菌菌株的培养物基质和/或无细胞提取物，其包含至少一种式I的化合物或其农业上可接受的盐，优选选自化合物1A和1B或其农业上可接受的盐，特别是所述培养物基质和/或无细胞提取物包含化合物1A和1B或其农业上可接受的盐。
本发明还涉及农用化学组合物，其包含如下定义的辅助成分和本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质和式I化合物中的至少一种或多种。
如本文中使用的，涉及本发明产品(微生物菌株、试剂或制剂)的“组合物”是指成分的组合，其中“配制”是，针对待加入形成制剂的成分的组合，使用配方(formula)(如制法(recipe))的过程。这样的组合物在本文中也称为制剂。
本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I化合物和组合物适宜作为抗真菌剂或杀真菌剂。它们的出众之处在于：突出的对抗广谱植物病原真菌的有效性，所述真菌包括土传真菌，尤其是源自根肿菌纲(Plasmodiophoromycetes)、Peronosporomycetes(与卵菌纲(Oomycetes)同义))、壶菌纲(Chytridiomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)、子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)和半知菌纲(Deuteromycetes)(与半知菌类(Fungi imperfecti)同义)的真菌。一些是系统有效的并且它们可以作为叶杀真菌剂、拌种杀真菌剂和土壤杀真菌剂用于作物保护中。此外，它们适用于控制有害真菌，特别是出现在植物的木材或根部的那些真菌。
本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I化合物和组合物，对于各种栽培植物上以及在这些植物的植物繁殖材料(如种子)和作物材料上的多种植物病原真菌控制，特别重要，所述植物如谷类，例如，小麦、黑麦、大麦、黑小麦、燕麦或水稻；甜菜，例如，糖用甜菜或饲料甜菜；水果，如仁果、核果或无核小果(soft fruit)，例如，苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、树莓、黑莓或醋栗；豆科植物，如小扁豆、豌豆、苜蓿或大豆；油料植物，如油菜、芥菜、橄榄、向日葵、椰子、可可豆、蓖麻油植物、油棕、花生或大豆；葫芦科植物，如南瓜、黄瓜或甜瓜；纤维植物，如棉花、亚麻、大麻或黄麻；柑桔类水果，如橙、柠檬、葡萄柚或柑橘；蔬菜，如菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、番茄、马铃薯、葫芦或红辣椒；月桂科植物，如鳄梨、肉桂或樟脑；能量和原料植物，如玉米、大豆、油菜、甘蔗或油棕；玉米；烟草；坚果；咖啡；茶；香蕉；藤本植物(食用葡萄(table grapes)和葡萄汁葡萄)；蛇麻草；坪草；甜叶(也称为甜叶菊)；天然橡胶植物或观赏植物和森林植物，如花、灌木、阔叶树或常绿树，例如，针叶树。
优选，本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物；和组合物可以用于控制田间作物(如，马铃薯、糖用甜菜、烟草、小麦、黑麦、大麦、燕麦、水稻、玉米、棉花、大豆、油菜、豆类、向日葵、咖啡或甘蔗)；水果；藤本植物；观赏植物；或蔬菜(如黄瓜、番茄、豆类或南瓜)上的多种真菌。
术语“植物繁殖材料”理解为表示，植物的所有生殖部分如种子和可以用于繁殖植物的营养性植物材料，如插枝和块茎(例如，马铃薯)。这包括植物的种子、根、果实、块茎、球茎、根茎、枝、芽和其他部分，包括秧苗和幼苗，其可以在萌发后或从土壤萌出后移栽。也可以在移栽前通过浸没或倾倒进行整体或部分处理来保护这些幼苗。
优选，用本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物处理植物繁殖材料，用于控制谷类，如小麦、黑麦、大麦和燕麦；水稻、玉米、棉花和大豆上的多种真菌。
术语“栽培的植物”理解为包括已经通过育种、诱变或遗传工程修饰的植物，包括但不限于销售的或研发中的农业生物技术产品(参考http://cera-gmc.org/，参见其中的GM作物数据库)。遗传修饰的植物是其遗传物质已经通过使用重组DNA技术修饰的植物，该修饰在自然环境下通过杂交育种、突变或自然重组不能容易获得。通常，将一个或多个基因整合至遗传修饰植物的遗传物质中，以改善植物的某些特性。这样的遗传修饰还包括但不限于蛋白质、寡肽或多肽的靶向翻译后修饰，例如，糖基化或聚合物添加(如异戊二烯化、乙酰化或法尼基化部分或PEG部分)。
已经通过育种、诱变或遗传工程修饰的植物，例如，作为常规育种或遗传工程方法的结果，已被赋予对特定类别的除草剂施用的耐受性，所述除草剂如植物生长素除草剂，如麦草畏或2,4-D；漂白剂除草剂，如羟苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂或八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂；乙酰乳酸合酶(ALS)抑制剂，如磺酰脲或咪唑啉酮；烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)抑制剂，如草甘膦；谷氨酰胺合成酶(GS)抑制剂，如草铵膦；原卟啉原-IX氧化酶抑制剂；脂质生物合成抑制剂，如乙酰CoA羧化酶(ACCase)抑制剂；或苯腈类(即，溴苯腈或碘苯腈)除草剂。此外，通过多重遗传修饰，可以使得植物抵抗多种类别的除草剂，如抵抗草甘膦和草铵膦两者或抵抗草甘膦和来自另一种类别的除草剂，如ALS抑制剂、HPPD抑制剂、生长素除草剂或ACCase抑制剂。这些除草剂抗性技术例如描述于PestManagem.Sci.61,2005,246；61,2005,258；61,2005,277；61,2005,269；61,2005,286；64,2008,326；64,2008,332；Weed Sci.57,2009,108；Austral.J.Agricult.Res.58,2007,708；Science 316,2007,1185；以及其中引用的参考文献。已经通过常规育种(诱变)方法赋予了几种栽培植物对除草剂的耐受性，例如，对咪唑啉酮(例如，咪草啶酸(imazamox))耐受的夏油菜(Canola，BASF SE，德国)，或对磺酰脲(例如，苯磺隆)耐受的向日葵(DuPont，USA)。遗传工程方法已经用于赋予栽培植物(如大豆、棉花、玉米、甜菜和油菜)对除草剂(如草甘膦和草铵膦)的耐受性，其中一些可以以商品名(草甘膦-耐受，Monsanto，U.S.A.)、(咪唑啉酮耐受，BASF SE，德国)和(草铵膦-耐受，Bayer CropScience，德国)在商业上购得。
此外，还涵盖这样的植物，所述植物通过使用重组DNA技术而能够合成一种或多种杀虫蛋白，尤其是：已知来自细菌芽孢杆菌属，尤其是来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的杀虫蛋白，如δ-内毒素，例如，CryIA(b)、CryIA(c)、CryIF、CryIF(a2)、CryIIA(b)、CryIIIA、CryIIIB(b1)或Cry9c；植物杀虫蛋白(VIP)，例如，VIP1、VIP2、VIP3或VIP3A；定殖线虫的细菌(例如，光杆状菌属(Photorhabdus)或致病杆菌属(Xenorhabdus))的杀虫蛋白；动物产生的毒素，如蝎子毒素、蜘蛛毒素、黄蜂毒素，或其他昆虫特异性神经毒素；真菌产生的毒素，如链霉菌纲(Streptomycetes)毒素；植物凝集素(lectin)，如豌豆或大麦凝集素；凝集素(agglutinin)；蛋白酶抑制剂，如胰蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、patatin、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)或木瓜蛋白酶抑制剂；核糖体-失活蛋白(RIP)，如蓖麻毒素、玉米-RIP、相思豆毒素、软瓜蛋白、皂草毒蛋白或异株泻根毒蛋白；类固醇代谢酶，如3-羟基类固醇氧化酶、蜕皮类固醇-IDP-糖基-转移酶、胆固醇氧化酶、蜕皮素抑制剂或HMG-CoA-还原酶；离子通道阻断剂，如钠或钙通道的阻断剂；保幼激素酯酶；利尿激素受体(helicokinin受体)；芪合酶、联苄合酶、几丁质酶或葡聚糖酶。在本发明中，这些杀虫蛋白或毒素也明确地理解为前毒素、杂合蛋白、截短的或其他修饰的蛋白。杂合蛋白的特征在于蛋白结构域的新组合(参见，例如，WO 02/015701)。此类毒素或能够合成此类毒素的遗传修饰植物的更多实例公开于例如EP-A 374753、WO 93/007278、WO 95/34656、EP-A427 529、EP-A 451 878、WO 03/18810和WO 03/52073中。用于产生此类遗传修饰植物的方法通常是本领域技术人员已知的并且描述于例如上述出版物中。遗传修饰植物中含有的这些杀虫蛋白赋予产生这些蛋白的植物对来自所有节肢动物分类学群组的有害害虫的耐受性，尤其是甲虫(鞘翅目(Coeloptera))、双翅昆虫(双翅目(Diptera))和蛾(鳞翅目(Lepidoptera))以及线虫类(Nematoda)。能够合成一种或多种杀虫蛋白的遗传修饰植物例如描述于上述出版物中，并且其中一些是商业上可购得的，如(产生Cry1Ab毒素的玉米栽培品种)、Plus(产生Cry1Ab和Cry3Bb1毒素的玉米栽培品种)、(产生Cry9c毒素的玉米栽培品种)、RW(产生Cry34Ab1、Cry35Ab1和酶膦丝菌素-N-乙酰转移酶[PAT])；33B(产生Cry1Ac毒素的棉花栽培品种)、I(产生Cry1Ac毒素的棉花栽培品种)、II(产生Cry1Ac和Cry2Ab2毒素的棉花栽培品种)；(产生VIP-毒素的棉花栽培品种)；(产生Cry3A毒素的马铃薯栽培品种)； Bt11(例如，CB)和来自Syngent Seeds SAS法国的Bt176(产生Cry1Ab毒素和PAT酶的玉米栽培品种)、来自Syngenta Seeds SAS法国的MIR604(产生修饰形式的Cry3A毒素的玉米栽培品种，参考WO 03/018810)、来自Monsanto Europe S.A.比利时的MON 863(产生Cry3Bb1毒素的玉米栽培品种)、来自Monsanto Europe S.A.比利时的IPC531(产生修饰形式的Cry1Ac毒素的棉花栽培品种)和来自Pioneer Overseas Corporation比利时的1507(产生Cry1F毒素和PAT酶的玉米栽培品种)。
此外，还涵盖这样的植物，所述植物通过使用重组DNA技术而能够合成一种或多种蛋白来提高这些植物对细菌、病毒或真菌病原体的抗性或耐受性。此类蛋白的实例是所谓的“病原相关蛋白”(PR蛋白，参见，例如，EP-A 392 225)、植物疾病抗性基因(例如，马铃薯栽培品种，其表达对抗源自墨西哥野生马铃薯Solanum bulbocastanum的致病疫霉的抗性基因)或T4-溶菌酶(例如，能够合成这些蛋白的马铃薯栽培品种，具有提高的对抗细菌如解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylvora)的抗性)。用于生产此类遗传修饰植物的方法通常是本领域技术人员已知的并且描述于例如上述出版物中。
此外，还涵盖这样的植物，所述植物通过使用重组DNA技术而能够合成一种或多种蛋白质以提高生产力(例如，生物量生产、粮食产量、淀粉含量、油含量或蛋白质含量)，对干旱、盐度或其他生长限制环境因素的耐受性、或对这些植物的害虫和真菌、细菌或病毒病原体的耐受性。
此外，还涵盖这样的植物，所述植物通过使用重组DNA技术而含有改变含量的内含物质或新的内含物质，尤其是以提高人或动物营养，例如，产生促进健康的长链ω-3脂肪酸或不饱和ω-9脂肪酸的油料作物(例如，油菜，DOW Agro Sciences，加拿大)。
此外，还涵盖这样的植物，所述植物通过使用重组DNA技术而含有改变含量的内含物质或新的内含物质，尤其是以提高原料生产，例如，产生提高量的支链淀粉的马铃薯(例如，马铃薯，BASF SE，德国)。
本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物特别适用于控制以下植物疾病：
观赏植物、蔬菜(例如，白锈菌(A.candida))和向日葵(例如，婆罗门参白锈(A.tragopogonis))上的白锈菌属物种(Albugo spp.)(白锈病)；蔬菜，油菜(芸苔链格孢(A.brassicola或A.brassicae))、糖用甜菜(细链格孢(A.tenuis))、水果、稻、大豆、马铃薯(例如，茄链格孢(A.solani)或链格孢(A.alternata))、番茄(例如，茄链格孢或链格孢)和小麦上的链格孢属物种(Alternaria spp.)(链格孢叶斑病)；糖用甜菜和蔬菜上的丝囊霉属物种(Aphanomyces spp.)；谷类和蔬菜上的壳二孢属物种(Ascochyta spp.)，例如，小麦上的小麦壳二孢(A.tritici)(炭疽病)和大麦上的大麦壳二孢(A.hordei)；平脐蠕孢属物种(Bipolaris spp.)和内脐蠕孢属物种(Drechslera spp.)(有性型：旋孢腔菌属物种(Cochliobolus spp.))，例如，玉米上的小斑病(玉蜀黍内脐蠕孢(D.maydis))或大斑病(玉米平脐蠕孢(B.zeicola))，例如，谷类上的斑枯病(麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana))以及例如稻和坪草上的稻平脐蠕孢(B.oryzae)；禾谷类上(例如，小麦或大麦上)的禾本科布氏白粉菌(Blumeria graminis)(前称禾生白粉菌(Erysiphe graminis)(白粉病)；水果和无核小果(例如，草莓)、蔬菜(例如，莴苣、胡萝卜、芹菜和卷心菜)、油菜、花卉、藤本植物、林业植物和小麦上的灰葡萄孢(Botrytis cinerea)(有性型：富氏葡萄核盘菌(Botryotiniafuckeliana)：灰霉病)；莴苣上的莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)(霜霉病)；阔叶树和常绿树上的长喙壳属物种(Ceratocystis spp.)(同义词：Ophiostoma.spp)(腐病或枯萎)，例如，榆树上的榆长喙壳(C.ulmi)(荷兰榆树病(Dutch elm disease))；玉米(例如，灰斑病：玉蜀黍尾孢(C.zeae-maydis))、稻、糖用甜菜(例如，甜菜生尾孢(C.beticola))、甘蔗、蔬菜、咖啡、大豆(例如，大豆尾孢(C.sojina)或菊池尾孢(C.kikuchii))和稻上的尾孢属物种(Cercospora spp.)(尾孢菌叶斑(Cercospora leaf spot))；番茄(例如，黄枝孢(C.fulvum)：叶霉病)和谷类上的枝孢属物种(Cladosporium spp.)，例如，小麦上的多主枝孢(C.herbarum)(黑穗病(black ear))；禾谷类上的麦角菌(Claviceps purpurea)(麦角病(ergot))；玉米(炭色旋孢腔菌(C.carbonum))、禾谷类(例如，禾旋孢腔菌(C.sativus)，无性型：麦根腐平脐蠕孢(B.sorokiniana))和稻(例如，宫部旋孢腔菌(C.miyabeanus)，无性型：稻长蠕孢(H.oryzae))上的旋孢腔菌属物种(Cochliobolus spp.)(无性型：平脐蠕孢属(Bipolaris)或长蠕孢属(Helminthosporium))(叶斑病)；棉花(例如，棉刺盘孢(C.gossypii))、玉米(例如,禾生刺盘孢(C.graminicola)：炭疽病茎腐)、无核小果、马铃薯(例如，C.coccodes：黑斑病)、菜豆(例如，豆刺盘孢(C.lindemuthianum))和大豆(例如，平头刺盘孢(C.truncatum)或盘长孢状刺盘孢(C.gloeosporioides))上的刺盘孢属物种(Colletotrichum spp.)(有性型：小丛壳属(Glomerella))(炭疽病)；伏革菌属物种(Corticium spp.)，例如，稻上的笹木伏革菌(C.sasakii)(纹枯病(sheath blight))；大豆和观赏植物上的山扁豆生棒孢菌(Corynespora cassiicola)(叶斑病)；Cycloconium属物种，例如，橄榄树上的C.oleaginum；果树上、藤本植物上(例如，鹅掌楸柱孢(C.liriodendri)，有性型：鹅掌楸新丛赤壳(Neonectria liriodendri)：黑脚病(BlackFoot Disease))和观赏植物上的柱孢属(Cylindrocarpon)物种(例如，果树溃疡病或幼藤衰败，有性型：丛赤壳属(Nectria)或新丛赤壳属(Neonectria)物种)；大豆上的Dematophora necatrix(有性型：褐座坚壳(Rosellinia necatrix)(根和茎腐病)；间座壳属物种(Diaporthe spp.)，例如，大豆上的菜豆间座壳(D.phaseolorum)(猝倒)；玉米、禾谷类如大麦(例如，大麦网斑内脐蠕孢(D.teres)，网斑病(net blotch))和小麦(例如，偃麦草内脐蠕孢(D.tritici-repentis)：黄褐斑病(tan spot))、稻和坪草上的内脐蠕孢属物种(Drechslera spp.，同义词：长蠕孢属，有性型：核腔菌属(Pyrenophora))；藤本植物上的Esca(梢枯病(dieback)、干枯病(apoplexy))，由层卧孔菌(Fomitiporia punctata)(同义词：斑孔木层孔菌(Phellinus punctata))、地中海层卧孔菌(F.mediterranea)、Phaeomoniella chlamydospora(之前Phaeoacremonium chlamydosporum)、Phaeoacremonium aleophilum和/或Botryosphaeria obtusa引起；仁果(梨痂囊腔菌(E.pyri))、无核小果(E.veneta：炭疽病)和藤本植物(痂囊腔菌(E.ampelina)：炭疽病)上的痂囊腔菌属物种(Elsinoe spp.)；稻上的稻叶黑粉菌(Entyloma oryzae)(叶黑粉病(leaf smut))；小麦上的附球菌属物种(Epicoccum spp.)(黑霉病(black mold))；糖用甜菜(甜菜白粉菌(E.betae))、蔬菜(例如，豌豆白粉菌(E.pisi))，如葫芦(例如，二孢白粉菌(E.cichoracearum))、卷心菜、油菜(例如，十字花科白粉菌(E.cruciferarum))上的白粉菌属物种(Erysiphe spp.)(白粉病)；果树、藤本植物和观赏木上的Eutypa lata(弯孢壳(Eutypa)溃疡病或梢枯病，无性型：Cytosporina lata，同义词：Libertella blepharis)；玉米(例如，大斑凸脐蠕孢(E.turcicum))上的凸脐蠕孢属物种(Exserohilum spp.)(同义词：长蠕孢属)；多种植物上的镰孢属物种(Fusarium spp.)(有性型：赤霉属(Gibberella))(萎蔫、根或茎腐病)，如禾谷类(例如，小麦或大麦)上的禾本科镰孢(F.graminearum)或大刀镰孢(F.culmorum)(根腐病、疮痂病(scab)或赤霉病(head blight))、番茄上的尖镰孢(F.oxysporum)、大豆上的腐皮镰孢(F.solani)(大豆专化型(f.sp.glycines),同义词：F.virguliforme)和F.tucumaniae及F.brasiliense(均引起猝死症)和玉米上的轮枝镰孢(F.verticillioides)；禾谷类(例如，小麦或大麦)和玉米上的禾顶囊壳(Gaeumannomycesgraminis)(全蚀病(take-all))；禾谷类(例如，玉蜀黍赤霉(G.zeae)和稻(例如，藤仓赤霉(G.fujikuroi)：恶苗病(Bakanae disease))上的赤霉属物种(Gibberella spp.)；藤本植物、仁果和其他植物上的围小丛壳(Glomerella cingulata)和棉花上的棉小丛壳(G.gossypii)；稻上的颗粒染色复合体(Grainstaining complex)；藤本植物上的葡萄球座菌(Guignardia bidwellii)(黑腐病(black rot))；蔷薇科植物和杜松上的胶锈菌属物种(Gymnosporangium spp.)，例如，梨上的G.sabinae(锈病)；玉米、禾谷类和稻上的长蠕孢属物种(Helminthosporium spp.)(同义词：内脐蠕孢属，有性型：旋孢腔菌属)；驼孢锈菌属物种(Hemileia spp.)，例如，咖啡上的咖啡驼孢锈菌(H.vastatrix)(咖啡叶锈病)；藤本植物上的褐斑拟棒束孢(Isariopsis clavispora)(同义词：Cladosporium vitis)；大豆和棉花上的菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)(同义词：Macrophomina phaseoli)(根茎腐病)；禾谷类(例如，小麦或大麦)上的Microdochium nivale(同义词：雪腐镰孢Fusariumnivale)(粉雪霉病(pink snow mold))；大豆上的扩散叉丝壳(Microsphaera diffusa)(白粉病)；核果和其他蔷薇科植物上的链核盘菌属物种(Monilinia spp.)，例如，核果链核盘菌(M.laxa)、M.fructicola和果生链核盘菌(M.fructigena)(花腐枝枯病、褐腐病)；禾谷类、香蕉、无核小果和落花生上的球腔菌属物种(Mycosphaerella spp.)，如小麦上的禾生球腔菌(M.graminicola)(无性型：小麦壳针孢(Septoria tritici)，壳针孢斑枯病)或香蕉上的斐济球腔菌(M.fijiensis)(黑叶斑病(black Sigatoka disease))；卷心菜(例如，芸苔霜霉(P.brassicae))、油菜(例如，寄生霜霉(P.parasitica))、洋葱(例如，葱霜霉(P.destructor))、甘蔗(烟草霜霉(P.tabacina))和大豆(例如，东北霜霉(P.manshurica))上的霜霉属物种(Peronospora spp.)(霜霉病)；大豆上的豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)和山马蝗层锈菌(P.meibomiae)(大豆锈病)；瓶霉属物种(Phialophoraspp.)，例如藤本植物(例如，P.tracheiphila和P.tetraspora)和大豆(例如，P.gregata：茎腐病)上；油菜和卷心菜上的黑胫茎点霉(Phoma lingam)(根茎腐病)和糖用甜菜上的甜菜茎点霉(P.betae)(根腐病、叶斑病和猝倒)；向日葵、藤本植物(例如，葡萄生拟茎点霉(P.viticola)：蔓和叶斑病)和大豆(例如，茎腐病：P.phaseoli，有性型：菜豆间座壳(Diaporthe phaseolorum))上的拟茎点霉物种(Phomopsis spp.)；玉米上的玉蜀黍节壶菌(Physoderma maydis)(褐斑病)；在多种植物上的疫霉属物种(Phytophthora spp.)(萎蔫、根、叶、果实和茎腐病)，如红辣椒和葫芦(例如，辣椒疫霉(P.capsici))、大豆(例如，大雄疫霉(P.megasperma),同义词：大豆疫霉(P.sojae))、马铃薯和番茄(例如，致病疫霉(P.infestans)：晚疫病)和阔叶树(例如，P.ramorum：栎树猝死)；卷心菜、油菜、萝卜和其他植物上的芸苔根肿菌(Plasmodiophora brassicae)(根肿病(club root))；单轴霉属物种(Plasmopara spp.)，例如，藤本植物上的葡萄生单轴霉(P.viticola)(葡萄霜霉病)和向日葵上的霍尔斯单轴霉(P.halstedii)；蔷薇科植物、蛇麻、仁果和无核小果上的叉丝单囊壳属物种(Podosphaera spp.)(白粉病)，例如，苹果上的白叉丝单囊壳(P.leucotricha)；多粘霉属物种(Polymyxa spp.)，例如，禾谷类如大麦和小麦(禾谷多粘霉(P.graminis))和糖用甜菜(甜菜多粘霉(P.betae))上的多粘霉，和由此传播的病毒病；禾谷类例如小麦或大麦上的Pseudocercosporella herpotrichoides(眼斑病，有性型：Tapesia yallundae)；多种植物上的假霜霉属(Pseudoperonospora)(霜霉病)，例如，葫芦上的古巴假霜霉(P.cubensis)或蛇麻上的葎草假霜霉(P.humili)；藤本植物上的八孢假无柄盘菌(Pseudopezicula tracheiphila)(红火病(red fire disease)或rotbrenner’，无性型：瓶霉属)；多种植物上的柄锈菌属物种(Puccinia spp.)(锈病)，例如禾谷类，如小麦、大麦或黑麦上的小麦柄锈菌(P.triticina)(褐锈病或叶锈病)、条形柄锈菌(P.striiformis)(条锈病或黄锈病)、大麦柄锈菌(P.hordei)(矮锈病)、禾柄锈菌(P.graminis)(秆锈病或黑锈病)或隐匿柄锈菌(P.recondita)(棕锈病或叶锈病)，和芦笋上的天门冬属柄锈菌(P.asparagi))；小麦上的偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentis)(无性型：偃麦草内脐蠕孢(Drechslera tritici-repentis)(褐斑病)或大麦上的圆核腔菌(P.teres)(网斑病)；梨孢属物种(Pyricularia spp.)，例如，稻上的稻梨孢(P.oryzae)(有性型：Magnaporthe grisea，稻瘟病)和坪草和禾谷类上的灰梨孢(P.grisea)；坪草、稻、玉米、小麦、棉花、油菜、向日葵、大豆、糖用甜菜、蔬菜和多种其他植物上的腐霉属物种(Pythiumspp.)(猝倒)(例如，终极腐霉(P.ultimum)或瓜果腐霉(P.aphanidermatum))；柱隔孢属物种(Ramularia spp.)，例如，大麦上的R.collo-cygni(柱隔孢叶斑病、生理叶斑病)和糖用甜菜上的甜菜生柱隔孢(R.beticola)；棉花、稻、马铃薯、坪草、玉米、油菜、马铃薯、糖用甜菜、蔬菜和多种其他植物上的丝核菌属物种(Rhizoctonia spp.)，例如，大豆上的立枯丝核菌(R.solani)(根茎腐病)、稻上的立枯丝核菌(纹枯病)、或小麦或大麦上的禾谷丝核菌(R.cerealis)(丝核菌春叶枯病)；草莓、胡萝卜、卷心菜、藤本植物和番茄上的匐枝根霉(Rhizopus stolonifer)(黑霉病、软腐病)；大麦、黑麦和黑小麦上的黑麦喙孢(Rhynchosporium secalis)(灼枯病(scald))；稻上的稻帚枝杆孢菌(Sarocladiumoryzae)和S.attenuatum(鞘腐病)；蔬菜和大田作物，如油菜、向日葵(例如，核盘菌(S.sclerotiorum))和大豆(例如，S.rolfsii或核盘菌)上的核盘菌属物种(Sclerotiniaspp.)(茎腐病或白霉)；多种植物上的壳针孢属物种(Septoria spp.)，例如，大豆上的大豆壳针孢(S.glycines)(褐斑病)、小麦上的小麦壳针孢(S.tritici)(壳针孢叶枯病)、和禾谷类上的颖枯壳针孢(S.nodorum)(同义词：颖枯壳多孢(Stagonospora nodorum)(壳多孢叶枯病)；藤本植物上的葡萄钩丝壳(Uncinula necator)(同义词：葡萄白粉菌(Erysiphenecator)(白粉病，无性型：葡萄粉孢(Oidium tuckeri)；玉米(例如，S.turcica，同义词：大斑病长蠕孢(Helminthosporium turcicum))和坪草上的Setospaeria spp.(叶枯病)；玉米、高粱和甘蔗上的轴黑粉菌属物种(Sphacelotheca spp.)(黑穗病)(例如，丝轴黑粉菌(S.reiliana)：丝黑穗病)；葫芦上的单丝壳(Sphaerotheca fuliginea)(白粉病)；马铃薯上的马铃薯粉痂菌(Spongospora subterranea)(粉痂病)和由此传播的病毒病；禾谷类上的壳多孢属物种(Stagonospora spp.)，例如，小麦上的颖枯壳多孢(S.nodorum)(壳多孢黑斑病，有性型：颖枯小球腔菌(Leptosphaeria nodorum))[同义词：颖枯暗球腔菌(Phaeosphaeria nodorum)]；马铃薯上的内生集壶菌(Synchytrium endobioticum)(马铃薯癌肿病)；外囊菌属物种(Taphrina spp.)，例如，桃上的畸形外囊菌(T.deformans)(缩叶病)和李树上的李外囊菌(T.pruni)(李囊果病(plum pocket))；甘蔗、仁果、蔬菜、大豆和棉花上的根串珠霉属物种(Thielaviopsis spp.)(黑根腐病)，例如，根串珠霉(T.basicola)(同义词：Chalara elegans)；禾谷类上的腥黑粉菌属物种(Tilletia spp.)(腥黑穗病(common bunt或stinking smut))，例如，小麦上的小麦腥黑粉菌(T.tritici)(同义词：小麦网腥黑粉菌(T.carie)，小麦腥黑穗病)和小麦矮腥黑粉菌(T.controversa)(矮腥黑穗病)；大麦或小麦上的肉孢核瑚菌(Typhula incarnate)(灰雪腐霉病(grey snow mold))；条黑粉菌属物种(Urocystis spp.)，例如，黑麦上的隐条黑粉菌(U.occulta)(秆黑穗病(stem smut))；蔬菜如菜豆(例如，疣顶单胞锈菌(U.appendiculatu),同义词：菜豆单胞锈菌(U.phaseoli))和糖用甜菜(例如，甜菜单胞锈菌(U.betae))上的单胞锈菌属物种(Uromyces spp.)(锈病)；禾谷类(例如，麦散黑粉菌(U.nuda)和燕麦散黑粉菌(U.avaenae)、玉米(例如，玉蜀黍黑粉菌(U.maydis)：玉米黑粉病)和甘蔗上的黑粉菌属物种(Ustilago spp.)(散黑穗病(loose smut))；苹果(例如，苹果黑星菌(V.inaequalis))和梨上的黑星菌属物种(Venturia spp.)(疮痂病(scab))；和多种植物，如水果和观赏植物、藤本植物、无核小果、蔬菜和大田作物上的轮枝孢属物种(Verticillium spp.)(萎蔫)，例如，草莓、油菜、马铃薯和番茄上的大丽花轮枝孢(V.dahliae)。
本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物还适用于储存品或收获物的保护中和用于材料的保护中控制有害病原体，尤其是真菌。
术语“材料的保护”理解为表示，向技术性无生命材料提供对抗有害微生物(如真菌和细菌)的侵染和破坏的保护作用，所述材料如粘合剂、胶、木材、纸张和纸板、纺织品、皮革、颜料分散体、塑料、冷却润滑剂、纤维或织物。关于木材和其他材料的保护，特别关注以下有害真菌：子囊菌纲(Ascomycetes)，如Ophiostoma spp.、长喙壳属(Ceratocystisspp.)、出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)、Sclerophoma spp.、毛壳菌属(Chaetomium spp.)、腐质霉属(Humicola spp.)、彼得壳属(Petriella spp.)、毛束霉属(Trichurus spp.)；担子菌纲(Basidiomycetes)，如粉孢革菌属(Coniophora spp.)、革盖菌属(Coriolus spp.)、粘褶菌属(Gloeophyllum spp.)、香菇属(Lentinus spp.)、侧耳属(Pleurotus spp.)、卧孔属(Poria spp.)、Serpula spp.和干酪菌属(Tyromyces spp.)；半知菌纲(Deuteromycetes)，如曲霉属(Aspergillus spp.)、枝孢属(Cladosporium spp.)、青霉属(Penicillium spp.)、木霉属(Trichorma spp.)、链格孢属(Alternaria spp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)；和接合菌纲(Zygomycetes)，毛霉属(Mucor spp.)，此外，在储存品和收获物的保护中，以下的酵母真菌值得关注：假丝酵母属(Candida)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
根据本发明的处理方法也可以用于保护储存品或收获物以对抗真菌和微生物攻击的领域中。根据本发明，术语“储存品”理解为表示，植物或动物来源的天然物质及其经加工的形式，其已经取自天然生命周期并且对其需要进行长期保护。作物来源的储存品，如植物或其部分，例如，茎秆、叶、块茎、种子、果实或谷粒，可以以新鲜采收状态或以加工形式来保护，所述加工形式如预先干燥的、润湿的、切碎的、研磨的、压制的或烘烤的，该过程也称为采收后处理。木材也落入储存品的定义中，不管是粗制木材形式，如建筑木材、电缆塔和障碍物，或精制成品的形式，如家具或从木材制得的物品。动物来源的储存品是兽皮、皮革、毛皮、毛发等。根据本发明的组合物可以防止不利影响，如腐烂、脱色或发霉。优选，“储存品”理解为植物来源的天然物质和其加工形式，更优选果实和其加工形式，如仁果、核果、无核小果和柑桔类水果及其加工形式。
本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物可以用于提高植物的健康。本发明还涉及，通过用有效量的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物处理植物、其繁殖材料和/或正在生长或待生长植物的场所来提高植物健康的方法。
术语“植物健康”理解为表示，通过几个指标单独或彼此结合以确定的植物和/或其产品的状况，所述指标如产量(例如，提高的生物量和/或提高的有价值成分的含量)、植物活力(例如，提高的植物生长和/或更绿的叶子(“增绿作用”))、品质(例如，提高的特定成分的含量或组成)以及对非生物和/或生物胁迫的耐受性。以上鉴定的植物健康状况指标可以是互相依赖的或可以互为因果。
更健康的植物是合乎需要的，因为它们可以导致例如植物或作物的更高产量和/或更高品质，尤其是采收的植物部分的更高品质。更健康的植物也能更好地抵抗生物和/或非生物胁迫。对抗生物胁迫的高抗性又可以允许本领域技术人员降低使用的农药量并因此减缓对抗相应农药的抗性的产生。
必须强调，在植物没有处于生物胁迫下时，并且特别是植物没有处于农害压力下时，以上所述的本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I化合物和组合物的作用，即，增强的植物健康，也是存在的。
例如，对于种子处理和土壤应用，明显的是，与已经接受对抗相应农害的治疗性或预防性处理而可以不受生物胁迫因素损伤而生长的植物繁殖材料相比，遭受真菌或杀虫攻击的植物会显示出降低的萌发和出苗，导致较差的植物或作物建植和活力，以及由此导致降低的产量。然而，根据本发明的方法导致增强的植物健康，即使在不存在任何生物胁迫的情况下。这意味着，本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物的积极作用不能只解释为本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物的农药活性，而是还基于其它的活性特征。因此，本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物的施用也可以在不存在农害压力的情况下进行。
在一个同等优选的实施方案中，本发明涉及用于提高从植物繁殖材料生长的植物的健康的方法，其中用有效量的至少一种本发明菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物或组合物处理植物繁殖材料。
以下所列的每个植物健康指标(选自产量、植物活力、品质以及植物对非生物和/或生物胁迫的耐受性)，将理解为各自单独地或优选彼此组合地构成本发明的优选实施方案。
根据本发明，植物“提高的产量”表示，相应植物的产物产量，与在相同条件下但没有施用本发明菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I化合物和组合物而产生的植物相同产物的产量相比，增加了可测量的量。
对于种子处理，例如，作为接种物和/或叶面施用形式，提高的产量可以通过例如以下改善的植物特性来表征：提高的植物重量；和/或提高的植物高度；和/或提高的生物量，如更高的整体鲜重(FW)；和/或提高的每株植物的花朵数量；和/或更高的谷粒和/或果实产量；和/或更多的分蘖或侧芽(分枝)；和/或更大的叶子；和/或提高的芽生长；和/或提高的蛋白质含量；和/或提高的含油量；和/或提高的淀粉含量；和/或提高的色素含量；和/或提高的叶绿素含量(叶绿素含量与植物的光合作用速率具有正相关，并因此，叶绿素含量越高，植物产量越高)和/或提高的植物品质。
“谷粒”和“果实”理解为由植物产生的具有任何经济价值的任何植物产物，其在采收后进一步被利用，例如，本来意义上的果实、蔬菜、坚果、谷粒、种子、木材(例如，在造林植物的情况中)、花卉(例如，在园林植物、观赏植物的情况)等。
根据本发明，产量提高至少4％。通常，产量提高甚至可以更高，例如5至10％，更优选10至20％，或甚至20至30％。
根据本发明，如果在不存在农害压力的情况下，产量提高至少2％。通常，产量提高甚至可以更高，例如，直至4％至5％，或甚至更高。
用于植物状况的另一个指标是植物活力。植物活力呈现在几个方面中，如一般视觉外观。
对于叶面施用，提高的植物活力可以例如通过以下提高的植物特性来表征：提高的植物生活力；和/或提高的植物生长；和/或提高的植物发育；和/或提高的视觉外观；和/或提高的植株成活(较少植物歪倒(verse)/植物倒伏和/或较大的叶片；和/或较大的大小；和/或提高的植物高度；和/或提高的分蘖数量；和/或提高的侧芽数量；和/或提高的每株植物的花朵数量；和/或提高的芽生长；和/或增强的光合活性(例如，基于提高的气孔导度和/或提高的CO2同化速率))；和/或较早的开花；和/或较早的结果；和/或较早的谷粒成熟；和/或较少的无效分蘖；和/或较少的死基生叶；和/或较少的输入需求(如肥料或水)；和/或更绿的叶子；和/或在缩短的营养期下的完全成熟；和/或更容易的采收；和/或更快和更均匀的成熟；和/或较长的货架期；和/或较长的穗(panicle)；和/或衰老的延迟；和/或更强壮和/或更有效分蘖；和/或更好的成分可提取性；和/或提高的种子品质(对于用于种子生产的下一季中的播种)；和/或降低的乙烯产生和/或抑制其被植物吸收。
用于植物状况的另一个指标是植物和/或其产物的“品质”。根据本发明，增强的品质表示某些植物特征，如某些成分的含量或组成，与相同条件下但没有施用本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I化合物和组合物而产生的植物的相同因子相比，增加或提高了可测量的或显著的量。增强的品质可以例如通过以下改善的植物或其产物的品质来表征：提高的营养素含量；和/或提高的蛋白质含量；和/或提高的含油量；和/或提高的淀粉含量；和/或提高的脂肪酸含量；和/或提高的代谢物含量；和/或提高的类胡萝卜素含量；和/或提高的糖含量；和/或提高的必需氨基酸含量；和/或改善的营养素组成；和/或改善的蛋白质组成；和/或改善的脂肪酸组成；和/或改善的代谢物组成；和/或改善的类胡萝卜素组成；和/或改善的糖组成；和/或改善的氨基酸组成；和/或改善的或优化的果实颜色；和/或改善的叶色；和/或较高的存储力；和/或采收产物更好的加工性。
植物状况的另一个指标是植物对生物和/或非生物胁迫因素的耐受性或抵抗力。生物和非生物胁迫，尤其是长时间的，可以对植物具有有害影响。
生物胁迫是由活的生物体引起的，而非生物胁迫是例如由环境极端情况引起的。根据本发明，“对生物和/或非生物胁迫因素增强的耐受性或抵抗力”表示：(1.)与暴露于相同条件但没有用本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物处理的植物相比，由生物和/或非生物胁迫引起的某些负面因素可以以可测量的或显著的量被减少；和(2.)通过本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物对胁迫因素的直接作用，例如，通过其直接破坏微生物或农害的杀真菌或杀虫作用，负面影响不能被减少，但通过刺激植物自身对抗所述胁迫因素的防御反应则可以。
由生物胁迫(如病原体和农害)引起的负面因素是公知的并且是由活的生物体引起的，如竞争性植物(例如，杂草)、微生物(如植物病原真菌和/或细菌)和/或病毒。
由非生物胁迫引起的负面因素也是公知的并且常常可以作为降低的植物活力(参见上文)观察到，例如：较低产量和/或较低活力，对于这两种影响，实例可以是例如焦枯的叶子、较少的花、过早的成熟、延后的作物成熟、降低的营养价值。
非生物胁迫可以例如通过以下引起：温度的极端情况，如热或冷(热胁迫/冷胁迫)；和/或温度的强烈变化；和/或对于特定季节不寻常的温度；和/或干旱(干旱胁迫)；和/或极端湿度；和/或高盐度(盐胁迫)；和/或辐射(例如，由于减少的臭氧层引起的提高的UV辐射)；和/或提高的臭氧水平(臭氧胁迫)；和/或有机污染(例如，农药的植物毒性量)；和/或无机污染(例如，重金属污染)。
作为生物和/或非生物胁迫因素的结果，受胁迫植物的数量和品质下降。就品质(如上文定义的)而言，生殖发育通常受到严重影响，在作物上造成对果实或种子重要的后果。蛋白质的合成、累积和储存主要受到温度的影响；几乎所有类型的胁迫会减缓生长；多糖合成，结构和存储都降低或改变：这些影响导致生物量(产量)降低和植物营养价值的改变。
如上文指出的，以上针对植物的健康状况定义的指标可以相互依赖并可以互为因果。例如，提高的对生物和/或非生物胁迫的抵抗力可以导致更好的植物活力，例如，更好和更大的作物，并且因此导致提高的产量。相反，发育更好的根系可以导致提高的对生物和/或非生物胁迫的抵抗力。然而，这些相互依赖性和相互作用不是全部都是已知的，也没有全面了解，因此分开描述这些不同的指标。
在一个实施方案中，本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物可以实现植物或其产物提高的产量。在另一个实施方案中，本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物可以实现植物或其产物提高的活力。在另一个实施方案中，本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物可以实现植物或其产物提高的品质。再在另一个实施方案中，本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物可以实现植物或其产物提高的对抗生物胁迫的耐受性和/或抵抗力。再在另一个实施方案中，本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物可以实现植物或其产物提高的对抗非生物胁迫的耐受性和/或抵抗力。
本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物可以按原样使用或以组合物的形式使用，通过用杀真菌有效量的活性物质处理真菌，或处理待保护免受真菌攻击的植物、植物繁殖材料(如种子)、土壤、表面、材料或房间。可以在植物、植物繁殖材料(如种子)、土壤、表面、材料或房间被真菌感染之前和之后，进行施用。
术语“有效量”表示，足以在栽培植物上或在材料保护中控制有害真菌并且对所处理的植物不导致实质性损害的量。这样的量可以在宽范围中变动并且取决于各种因素，如待控制的真菌物种，处理的栽培植物或材料，气候条件、和使用的本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物或其盐。
可以用本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物在种植或移栽时或之前预防性地处理植物繁殖材料。
本发明的菌株可以配制成用于植物的接种物。术语“接种物”表示包括本发明的分离菌株和任选的载体(其可以包括生物学上可接受的介质)的组合物。
这样的接种物和其他合适的组合物可以通过常规方式(参见，例如，H.D.Burges:Formulation of Microbial Biopesticides，Springer，1998)制成组合物，所述组合物除了活性成分以外，还包含至少一种助剂(惰性成分)。
为了生产干制剂，可以将细菌细胞，优选孢子，悬浮于合适的干载体(例如，粘土)中。为了生产液体制剂，可以将细胞，优选孢子，悬浮于合适的液体载体(例如，水基的)至所需的孢子密度。可以通过在琼脂培养基(例如，马铃薯葡萄糖琼脂)上在约20至约30℃的温度下孵育几天后鉴定集落形成单位(CFU)的数量来测定每ml的孢子密度数。
根据一个实施方案，根据本发明的组合物的各单独组分，如试剂盒的部件或二元或三元混合物的部分，可以通过使用者自身在喷雾罐或任何其他种类的用于施用的容器(例如，种子处理器鼓、种子造粒机、背负式喷雾器)中混合，并且如果合适，可以添加其它助剂。当活的生物体，如本发明的类芽孢杆菌菌株，形成此类试剂盒的一部分时，必须小心，试剂盒的其他部分(例如，化学农药)和其它助剂的选择和含量应当不影响微生物农药在使用者混合的组合物中的生活力。尤其是对于杀细菌剂和溶剂，必须考虑与相应微生物农药的相容性。
本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质和/或式I化合物可以转化成惯用类型的农用化学组合物，例如，溶液、乳液、悬浮液、散粉剂、粉末、糊状物、颗粒、压制物、胶囊，及其混合物。组合物类型的实例是悬浮液(例如，SC、OD、FS)、可乳化浓缩物(例如，EC)、乳液(例如，EW、EO、ES、ME)、胶囊(例如，CS、ZC)、糊状物、锭剂、可润湿的粉末或撒粉剂(例如，WP、SP、WS、DP、DS)、压制物(例如，BR、TB、DT)、颗粒(例如，WG、SG、FG、GG、MG)、杀虫物品(例如，LN)，以及用于处理植物繁殖材料(如种子)的凝胶制剂(例如，GF)。这些和更多组合物类型定义于“Catalogue of pesticide formulation types and internationalcoding system”，Technical Monograph No.2，第6版，2008年5月，CropLifeInternational。
可以以已知方式制备组合物，如Mollet and Grubemann，Formulationtechnology，Wiley VCH，Weinheim，2001；或Knowles，New developments in cropprotection product formulation，Agrow Reports DS243，T&F Informa，London，2005中所述的。
合适的助剂是溶剂、液体载体、固体载体或填充剂、表面活性剂、分散剂、乳化剂、润湿剂、佐剂、增溶剂、渗透增强剂、保护性胶体、粘附剂、增稠剂、湿润剂、驱避剂、引诱剂、摄食刺激剂、配伍剂、杀细菌剂、抗冻剂、消泡剂、着色剂、增粘剂和粘合剂。
合适的溶剂和液体载体是水和有机溶剂，如中至高沸点的矿物油级分，例如，煤油、柴油；植物或动物来源的油；脂肪族、环状或芳香族烃，例如，甲苯、石蜡、四氢化萘、烷基化萘；醇类，例如，乙醇、丙醇、丁醇、苄醇、环己醇；甘醇；DMSO；酮类，例如，环己酮；酯类，例如，乳酸酯、碳酸酯、脂肪酸酯、γ-丁内酯；脂肪酸；膦酸酯；胺；酰胺类，例如，N-甲基吡咯烷酮、脂肪酸二甲基酰胺；及其混合物。
合适的固体载体或填充剂是矿物土，例如，硅酸盐、硅胶、滑石、高岭土、石灰石、石灰、粘土、白云石、硅藻土、膨润土、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁；多糖类，例如，纤维素、淀粉；肥料，例如，硫酸铵、磷酸铵、硝酸钠、尿素；植物来源的产物，例如，谷粉、树皮粉、木粉、坚果壳粉，及其混合物。
合适的表面活性剂是表面活性化合物，如阴离子型、阳离子型、非离子型和两性表面活性剂、嵌段聚合物、聚电解质，及其混合物。这样的表面活性剂可以用作乳化剂、分散剂、增溶剂、润湿剂、渗透增强剂、保护性胶体或助剂。表面活性剂的实例列于McCutcheon’s，Vol.1:Emulsifiers&Detergents，McCutcheon’s Directories，Glen Rock，USA，2008(国际版或北美版)。
合适的阴离子表面活性剂是磺酸、硫酸、磷酸、羧酸的碱、碱土或铵盐，及其混合物。磺酸盐的实例是烷基芳基磺酸盐、联苯磺酸盐、α-烯烃磺酸盐、木质素磺酸盐、脂肪酸和油的磺酸盐、乙氧基化烷基酚的磺酸盐、烷氧基化芳基酚的磺酸盐、缩合萘的磺酸盐、十二烷基-和十三烷基苯的磺酸盐、萘和烷基萘的磺酸盐、磺基琥珀酸盐或磺基琥珀酰胺酸盐。硫酸盐的实例是脂肪酸和油的硫酸盐、乙氧基化烷基酚的硫酸盐、醇的硫酸盐、乙氧基化醇的硫酸盐，或脂肪酸酯的硫酸盐。磷酸盐的实例是磷酸盐酯。羧酸盐的实例是烷基羧酸盐和羧化醇或烷基酚乙氧基化物。
合适的非离子型表面活性剂是烷氧基化物、N-取代的脂肪酸酰胺、氧化胺、酯、基于糖的表面活性剂、聚合表面活性剂，及其混合物。烷氧基化物的实例是如醇类、烷基酚、胺、酰胺、芳基酚、脂肪酸或脂肪酸酯的化合物，其已经进行了1至50当量的烷氧基化。环氧乙烷和/或环氧丙烷可以用于烷氧基化，优选环氧乙烷。N-取代的脂肪酸酰胺的实例是脂肪酸葡糖胺或脂肪酸链烷醇酰胺。酯的实例是脂肪酸酯、甘油酯或单甘油酯。基于糖的表面活性剂的实例是山梨聚糖、乙氧基化山梨聚糖、蔗糖和葡萄糖酯或烷基聚葡糖苷。聚合表面活性剂的实例是乙烯吡咯烷酮、乙烯醇或乙酸乙烯酯的同聚物或共聚物。
合适的阳离子型表面活性剂是季盐型表面活性剂，例如，具有一个或两个疏水性基团的季铵化合物，或长链伯胺的盐。合适的两性表面活性剂是烷基甜菜碱和咪唑啉。合适的嵌段聚合物是包含聚环氧乙烷和聚环氧丙烷嵌段的A-B或A-B-A型的嵌段聚合物，或包含烷醇、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的A-B-C型的嵌段聚合物。合适的聚电解质是聚酸或聚碱。聚酸的实例是聚丙烯酸或聚酸梳形聚合物的碱盐。聚碱的实例是聚乙烯基胺或聚乙烯胺。
合适的助剂是其自身具有可忽略的乃至不具有农药活性并且其提高无细胞提取物、培养物基质或代谢物对靶标的生物学性能的化合物。实例是表面活性剂、矿物油或植物油，和其他辅助剂。更多的实例由Knowles，Adjuvants and additives(辅助剂和添加剂)，Agrow Reports DS256，T&F Informa UK，2006，第5章。
合适的增稠剂是多糖(例如，黄原胶、羧甲基纤维素)、无机粘土(有机修饰或未修饰的)、聚羧酸盐和硅酸盐。
合适的杀细菌剂是溴硝醇和异噻唑啉酮衍生物，如烷基异噻唑啉酮和苯基异噻唑啉酮。合适的抗冻剂是乙二醇、丙二醇、尿素和甘油。合适的消泡剂是硅酮、长链醇和脂肪酸的盐。合适的着色剂(例如，红色、蓝色或绿色)是低水溶性的色素和水溶性染料。实例是无机着色剂(例如，氧化铁、氧化钛、六氰铁酸铁)和有机着色剂(例如，茜素-、偶氮-和酞菁着色剂)。合适的增粘剂或粘合剂是聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯乙酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、生物或合成蜡和纤维素酯。
活的微生物，如本发明的类芽孢杆菌菌株，以细胞或孢子形式形成组合物的一部分时，这样的组合物可以通过常规方式(参见，例如，H.D.Burges:Formulation ofMicrobial Biopesticides，Springer，1998)制成除了活性成分外还包含至少一种助剂(惰性成分)的组合物。合适的惯用类型的此类组合物是悬浮液、散粉剂、粉末、糊状物、颗粒、压制物、胶囊，及其混合物。组合物类型的实例是悬浮液(例如，SC、OD、FS)、胶囊(例如，CS、ZC)、糊状物、锭剂、可润湿的粉末或散粉剂(例如，WP、SP、WS、DP、DS)、压制物(例如，BR、TB、DT)、颗粒(例如，WG、SG、FG、GG、MG)、杀虫物品(例如，LN)，以及用于处理植物繁殖材料(如种子)的凝胶制剂(例如，GF)。在此，必须考虑，每种制剂类型或助剂的选择不应当影响组合物储存过程中以及最终施用于土壤、植物或植物繁殖材料时微生物的生活力。合适的制剂例如在WO 2008/002371、US 6,955,912、US5,433,107中有提及。
合适助剂的实例是本文中前文提及的那些，其中必须考虑此类助剂的选择和含量不应当影响组合物中的微生物农药的生活力。尤其对于杀细菌剂和溶剂，必须考虑与相应微生物农药中的相应微生物的相容性。此外，含有微生物农药的组合物可以进一步含有稳定剂或营养素和UV防护剂。合适的稳定剂或营养素例如为α-生育酚、海藻糖、谷氨酸盐、山梨酸钾、各种糖，如葡萄糖、蔗糖、乳糖和麦芽糖糊精(H.D.Burges:Formulation ofMicrobial Biopesticides，Springer，1998)。合适的UV防护剂例如是无机化合物，如二氧化钛、氧化锌和氧化铁色素，或有机化合物，如二苯甲酮、苯并三唑、苯基三嗪。除了针对包含本文中的化合物I的组合物提及的助剂，组合物还可以任选包含0.1-80％稳定剂或营养素和0.1-10％UV防护剂。
农用化学组合物通常包含0.01至95％，优选0.1至90％，和特别地0.5至75％重量的活性物质。活性物质可以以90％至100％的纯度，优选95％至100％的纯度(根据NMR光谱)来使用。
组合物类型及其制备的实例为：
i)水溶性浓缩物(SL，LS)
将10-60wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物和5-15wt％润湿剂(例如，醇烷氧基化物)溶解于水和/或水溶性溶剂(例如，醇)中，补足100wt％。用水稀释后，活性物质溶解。
ii)可分散浓缩物(DC)
将5-25wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物和1-10wt％分散剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮)溶解于有机溶剂(例如，环己酮)中，补足100wt％。用水稀释获得分散体。
iii)可乳化浓缩物(EC)
将15-70wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物和5-10wt％乳化剂(例如，十二烷基苯磺酸钙和乙氧基化蓖麻油)溶解于水不溶性有机溶剂(例如，芳烃)中，补足100wt％。用水稀释获得乳液。
iv)乳液(EW、EO、ES)
将5-40wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物和1-10wt％乳化剂(例如，十二烷基苯磺酸钙和乙氧基化蓖麻油)溶解于20-40wt％水不溶性有机溶剂(例如，芳烃)中。通过乳化机，将这个混合物引入水中，补足100wt％，并制成均质乳液。用水稀释获得乳液。
v)悬浮液(SC、OD、FS)
在搅拌球磨机中，将20-60wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物粉碎，并添加2-10wt％分散剂和润湿剂(例如，木质素磺酸钠和醇乙氧基化物)、0.1-2wt％增稠剂(例如，黄原胶)和水，补足100wt％，获得细的活性物质悬浮液。用水稀释获得稳定的活性物质的悬浮液。对于FS型组合物，加入高达40wt％的粘合剂(例如，聚乙烯基醇)。
vi)水分散颗粒和水溶性颗粒(WG、SG)
将50-80wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物细磨，并添加分散剂和润湿剂(例如，木质素磺酸钠和醇乙氧基化物)，补足100wt％，并通过技术设备(例如，挤出、喷雾塔、流化床)制成水分散或水溶性颗粒。用水稀释获得稳定的活性物质的分散液或溶液。
vii)水分散性粉末和水溶性粉末(WP、SP、WS)
将50-80wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物在转子-定子研磨机中研磨，并添加1-5wt％分散剂(例如，木质素磺酸钠)、1-3wt％润湿剂(例如，醇乙氧基化物)和固体载体(例如，硅胶)，补足100wt％。用水稀释获得稳定的活性物质的分散体或溶液。
viii)凝胶(GW，GF)
在搅拌球磨机中，将5-25wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物粉碎，并添加3-10wt％分散剂(例如，木质素磺酸钠)、1-5wt％增稠剂(例如，羧甲基纤维素)和水，补足100wt％，获得活性物质的细悬浮液。用水稀释获得稳定的活性物质的悬浮液。
ix)微乳液(ME)
将5-20wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物加入5-30wt％有机溶剂混合物(例如，脂肪酸二甲基酰胺和环己酮)、10-25wt％表面活性剂混合物(例如，醇乙氧基化物和芳基酚乙氧基化物)和水，补足100％。将该混合物搅拌1h，以自发地产生热力学稳定的微乳液。
x)微胶囊(CS)
将包含5-50wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物、0-40wt％水不溶性有机溶剂(例如，芳烃)、2-15wt％丙烯酸单体(例如，甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸和二-或三丙烯酸酯)的油相，分散于保护性胶体(例如，聚乙烯基醇)的水溶液中。通过自由基引发剂启动的自由基聚合导致聚(甲基)丙烯酸酯微胶囊的形成。
或者，将包含5-50wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物，0-40wt％水不溶性有机溶剂(例如，芳烃)和异氰酸酯单体(例如，联苯-亚甲基-4,4’-二异氰酸酯)的油相，分散于保护性胶体(例如，聚乙烯基醇)的水溶液中。添加聚胺(例如，六亚甲基二胺)导致聚脲微胶囊的形成。单体占1-10wt％。wt％相对于整个CS组合物。
xi)粉剂(DP、DS)
将1-10wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物细磨并与固体载体(例如，细碎的高岭土)密切混合，补足100wt％。
xii)颗粒(GR、FG)
将0.5-30wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物细磨并与固体载体(例如，硅酸盐)组合，补足100wt％。通过挤出、喷雾干燥或流化床来造粒。
xiii)超低容量液体(UL)
将1-50wt％本发明的全培养液、无细胞提取物、培养物基质或代谢物溶解于有机溶剂(例如，芳烃)中，补足100wt％。
组合物类型i)至xiii)可以任选包含其它助剂，如0.1-1wt％杀细菌剂、5-15wt％抗冻剂、0.1-1wt％消泡剂和0.1-1wt％着色剂。
用于种子处理的溶液(LS)、悬乳液(SE)、可流动浓缩物(FS)、用于干处理的粉末(DS)、用于浆液处理的水分散粉末(WS)、水溶性粉末(SS)、乳液(ES)、可乳化浓缩物(EC)和凝胶(GF)通常用于植物繁殖材料(特别是种子)的处理。
用于预混组合物的种子处理制剂类型或土壤施用的优选实例是WS、LS、ES、FS、WG或CS-类型。
通常，用于种子处理应用的预混制剂包含0.5至99.9％，尤其是1至95％所需成分，和99.5至0.1％，尤其是99至5％固体或液体助剂(包括，例如，溶剂，如水)，其中基于预混制剂，助剂可以是0至50％，尤其是0.5至40％含量的表面活性剂。而商业产品将优选配制成浓缩物(例如，预混组合物(制剂))，最终使用者将正常地使用稀释制剂(例如，罐混组合物)。
用于将本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物施用于或处理植物繁殖材料(尤其是种子)的种子处理方法是本领域已知的，并且包括繁殖材料的涂敷、涂层、涂膜、丸粒化和浸没施用方法。这样的方法也适用于根据本发明的组合物。在优选实施方案中，本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物通过萌发不受到负面影响的方法，施用于或处理植物繁殖材料。因此，用于施用于(或处理)植物繁殖材料(如种子)的合适方法的实例是种子拌种、种子包衣或种子大粒化等。
优选植物繁殖材料是种子、插条(即，茎秆)、种球(seed bulb)。
尽管认为本发明的方法可以施用于任何生理状态的种子，但优选种子处于足够坚固的状态，使得在处理过程中不发生损伤。通常，种子将是已经从田间采收的种子；从植物取下的种子；以及从任何穗轴、茎秆、外壳和周围果肉或其他非种子植物材料分离的种子。种子优选还将是一定程度生物稳定的，从而处理不会对种子引起生物损伤。认为可以在种子采收与种子播种之间的任何时间或在播种过程中的任何时间，对种子施以处理(种子指向的应用)。还可以在处理之前或之后引发(prime)种子。
在繁殖材料处理过程中，希望本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物中的成分均匀分布并均匀粘附于种子上。处理可以从植物繁殖材料(如种子)上的含有组合(例如，活性成分的混合物)的制剂的薄膜(涂敷(dressing))——其中初始大小和/或形状可识别，至中间状态(如涂层(coating))，至较厚的膜(如用许多层不同材料(如，载体，例如，粘土；不同制剂，如其他活性成分的制剂；聚合物；和着色剂)丸粒化(pelleting))——其中种子的初始形状和/或大小不再可识别。
本发明的一个方面包括将本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物以靶向方式施用于植物繁殖材料，包括将组合物中成分放置在整个植物繁殖材料上或仅放置在其一部分上，包括只放置在单侧或单侧的一部分上。从EP954213B1和WO06/112700提供的描述中，本领域普通技术人员将理解这些施用方法。
本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物还可以以“丸剂”或“丸粒”或合适基质的形式来使用，将处理过的丸剂或基质放置或播种在植物繁殖材料旁边。这样的技术是本领域已知的，特别是在EP1124414、WO07/67042和WO07/67044中。将本文中所述的本发明菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物施用于植物繁殖材料上，还包括通过将一个或多个含有农药的颗粒放置在经农药处理过的种子旁边，以保护用本发明的组合处理过的植物繁殖材料，其中农药的含量将使得经农药处理过的种子加上含有农药的颗粒一起包含有效剂量的农药，并且农药处理过的种子中含有的农药剂量低于或等于农药的最大无植物毒性剂量。这样的技术是本领域已知的，特别是在WO2005/120226中。
将本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物施用于种子上，还包括种子上的控释涂层，其中本发明组合物中的成分掺入可以随着时间释放所述成分的材料中。控释种子处理技术的实例是本领域公知的并且包括聚合物膜、蜡或其他种子涂层，其中所述成分可以掺入控释材料中或应用在两材料层之间，或两者。
可以以任何所需顺序或同时，将本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物和组合物施用于种子来处理种子。
种子处理可以针对未播种的种子进行，并且术语“未播种的种子”意在包括处于种子采收与为了植物发芽和生长的目的在田间播种种子之间的任何时间段的种子。对未播种的种子的处理不旨在包括其中将活性物质施用于土壤的那些实践，但包括种植过程中靶向种子的任何施用实践。
优选，处理在种子播种前进行，使得播种的种子已经用本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物或组合物预处理过。特别地，优选种子涂层或种子丸粒化。作为处理的结果，成分粘附于种子上并且因此可用于农害控制。
处理过的种子可以按照与任何其他活性成分处理过的种子一样的方式储存、操作、播种和耕作。
特别地，本发明涉及用于保护植物繁殖材料免受农害和/或提高从所述植物繁殖材料生长的植物的健康的方法，其中用有效量的本发明菌株、无细胞提取物、培养物基质、代谢物或组合物，处理播种植物繁殖材料的土壤。
特别地，本发明涉及用于保护植物繁殖材料免受农害的方法，其中用有效量的本发明的菌株、无细胞提取物、培养物基质、代谢物或组合物，处理其中播种植物繁殖材料的土壤。
特别地，本发明涉及用于保护植物繁殖材料免受有害真菌的方法，其中用有效量的本发明的菌株、无细胞提取物、培养物基质、代谢物或组合物，处理其中播种植物繁殖材料的土壤。
特别地，本发明涉及用于保护植物繁殖材料免受动物农害(昆虫、螨虫或线虫)的方法，其中用有效量的本发明的菌株、无细胞提取物、培养物基质、代谢物或组合物，处理其中播种植物繁殖材料的土壤。
使用者通常从预定剂量装置、背负式喷雾器、喷雾罐、喷洒飞机或灌溉系统来施用本发明的组合物。通常，用水、缓冲液和/或其它助剂将农用化学组合物制成所需的施用浓度，并且因此获得根据本发明的即可使用的喷雾液体或农用化学组合物。通常，每公顷农业有用面积施用20至2000升，优选50至400升该即可使用的喷雾液体。
处理植物繁殖材料(尤其是种子)时，本文中公开的组合物在二至十倍稀释后，在即可使用的制备物中提供0.01至60％重量，优选0.1至40％的活性成分浓度。施用可以在播种前或播种过程中进行。用于将本发明的菌株、无细胞提取物、培养物基质、代谢物或组合物施用于植物繁殖材料(尤其是种子)上的方法，包括植物繁殖材料的涂敷、涂层、粒化、撒粉、浸泡和犁沟内(in-furrow)施用方法。优选，通过使得不会诱导发芽的方法，例如通过种子涂敷、粒化、涂层或撒粉，将本发明的菌株、全培养液、无细胞提取物、培养物基质、式I的化合物或组合物施用于植物繁殖材料上。
将本发明的菌株用于作物保护中时，其中菌株作为叶面处理施用或施用至土壤，施用率通常为约1×106至5×1015(或更高)CFU/ha，优选约1×107至约1×1013CFU/ha，甚至更优选1×109至5×1012CFU/ha。
将本发明的菌株用于种子处理中时，关于植物繁殖材料的施用率通常为约1×109至1×1012(或更高)CFU/种子，优选约1×103至约1×1010CFU/种子，和甚至更优选约1×103至约1×106CFU/种子。或者，关于植物繁殖材料的施用率优选为约1×107至约1×1016(或更高)CFU/100kg种子，优选1×109至约1×1015CFU/100kg种子，甚至更优选1×1011至约1×1015CFU/100kg种子。
使用无细胞提取物、培养物基质和/或式I的化合物时，固体材料(干物质)被认为是活性成分，例如，在液体制剂的情况中，在干燥或蒸发提取介质或悬浮介质后获得的。用于植物保护中时，根据所需的作用类型，施用的活性成分量为0.001至2kg/ha，优选0.005至2kg/ha，更优选0.05至0.9kg/ha，并且特别是0.1至0.75kg/ha。在植物繁殖材料(如种子)的处理中，例如，通过给种子撒粉、涂层或浇灌，通常需要每100公斤植物繁殖材料(优选种子)0.1至1000g，优选1至1000g，更优选1至100g活性成分量。用于材料或储存产品的保护中时，施用的活性成分的量取决于施用区域的种类和所需的效果。通常用于材料保护中的量为每立方米处理材料0.001g至2kg，优选0.005g至1kg活性成分。
根据一个实施方案，本发明组合物的各组分，如试剂盒的部分或二元或三元混合物的部分，可以通过使用者自己在喷雾罐或任何其他种类的用于施用的容器(例如，种子处理器鼓、种子粒化机、背负式喷雾器)中混合，并且如果合适，可以加入其它助剂。
如果活的生物体，如本发明的菌株，形成此类试剂盒的一部分，必须小心，组分(例如，化学农药)和其它助剂的选择和量不应当影响微生物在使用者混合的组合物中的生活力。尤其是对于杀细菌剂和溶剂，必须考虑与相应微生物的相容性。
各种类型的油、润湿剂、助剂、肥料或微量营养素和其它农药(例如，除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、生长调节剂、安全剂、生物农药)可以加入本发明的菌株、无细胞提取物、培养物基质、代谢物、式I的化合物或组合物，作为预混物，或如果合适，直到临施用前加入(罐混合)。这些试剂可以与根据本发明的组合物以1:100至100:1的重量比混合，优选1:10至10:1。优选，本发明的组合物包含其它生物农药。甚至更优选，本发明的组合物除了助剂和至少一种式I的化合物外，还包含微生物农药。
农药通常是通过其作用来阻止农害、使农害失能、杀灭农害或妨碍农害的化学或生物学剂(如病毒、细菌、抗微生物剂或消毒剂)。靶农害可以包括破坏财产、造成滋扰、传播疾病或构成疾病载体的昆虫、植物病原体、杂草、软体动物、鸟类、哺乳动物、鱼、线虫(蛔虫)和微生物。术语农药还包括改变预期的植物生长、开花或繁殖速率的植物生长调节剂；引起叶或其他树叶从植物掉落的落叶剂，通常以有助于采收；促进活组织(如不需要的植物顶端)干燥的干燥剂；激活植物用于对抗某些农害的防御生理学的植物激活剂；降低农药在作物上的不合需要的除草作用的安全剂；和影响植物生理学以提高植物生长、作物的可采收物的生物量、产量或任何其他品质参数的植物生长促进剂。
实施例
将通过以下实施例更详细地描述本发明。以下实施例是为了举例说明的目的，并且不是用来限制本发明的范围。
实施例1：本发明的新细菌菌株的分离
从多个欧洲位置(包括德国)收集了土壤样品。通过对这些土壤应用公知的微生物分离程序，发明人获得了多个细菌，将其进一步使用常规分离技术以提供本文中所述的纯分离物。
按照标准微生物富集技术(C.A.Reddy，T.J.Beveridge，J.A.Breznak，G.A.Marzluf，T.M.Schmidt和L.R.Snyder(编辑)，Methods for General and MolecularMicrobiology，Am.Soc.Microbiol.，Washington，District of Columbia)，分离每种类型的细菌。
以下菌株已经分离并且于2013年2月20日依据布达佩斯条约保藏于德意志微生物和培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)：
1)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的Lu16774，
2)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的Lu17007，
3)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的Lu17015。
实施例2-新细菌菌株的表征
实施例2.1：16S-rDNA测序
在DSMZ，Braunschweig，德国，通过PCR扩增的16S rDNA的直接测序，测定了这些类芽孢杆菌菌株的16S rRNA基因序列。
根据制造商的说明，使用来自Epicentre Biotechnologies的MasterPureTM革兰氏阳性DNA纯化试剂盒，进行了基因组DNA提取。按照之前所述(Int.J.Syst.Bacteriol.46，1088-1092，1996)，进行了16S rDNA的PCR-介导的扩增和PCR产物的纯化。按照制造商实验方案的指导，使用Terminator v1.1环测序试剂盒(Applied Biosystems)，对纯化的PCR产物测序。使用来自Applied Biosystems的3500xL遗传分析仪，将序列反应物电泳。序列的不定性可能是由于单个基因组内存在几个具有不同序列的编码16S rRNA的顺反子(J.Bacteriol.178(19)，5636-5643，1996)。
将从菌株得到的序列数据输入比对编辑器AE2(http://iubio.bio.indiana.edu/soft/molbio/unix/ae2.readme)中，根据所得到的rRNA分子的二级结构进行人工比对，并与属于厚壁菌门(Firmicutes)的生物体的代表性16S rRNA基因序列进行比较(Nucl.AcidsRes.27,171-173,1999)。为了比较，从EMBL和RDP数据库获得16S rRNA序列。
本发明菌株的16S rRNA序列列于序列表中，如表2中所示。
表2：类芽孢杆菌菌株的16S rRNA的序列表参考号
通过在所比较序列的比对中进行序列的成对比较，计算了以％计的16S rRNA基因同一性。
基于成对序列比对进行的仅两个序列的比较，在本文中表示为二元值(binaryvalue)。其他值所基于的是比较中全部序列的多重序列比对。来自多重序列比较的较高同一性值是由所比较序列的序列数据具有不同长度引起的，导致了较短的比对。
来自三个新菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015的完整rDNA序列的成对比较的％同一性为99.5％至99.9％(表3，二元值)。
表3：三个新的类芽孢杆菌菌株的完整16S rRNA序列的％同一性(括号中为二元值)。
三个新菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015的完整16S rRNA序列与相关分类群的比较(参见图9)，揭示了与皮尔瑞俄类芽孢杆菌(模式菌株DSM 8320)具有99.8％的高同一性百分数。对于皮尔瑞俄类芽孢杆菌与新菌株的成对序列比对，二元值分别如下：Lu6774：99.5％，Lu17007：99.5％；和Lu17015，99.7％同一性。
对新的类芽孢杆菌菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015所属物种的最终评价，基于16S rRNA序列数据是不可能的。
针对皮尔瑞俄类芽孢杆菌NRRL BD-62的完整rDNA的测序获得与皮尔瑞俄类芽孢杆菌(模式菌株DSM 8320)的100.0％同一性，证实针对这个菌株BD-62的物种命名皮尔瑞俄类芽孢杆菌(参见图9)。
通过与皮尔瑞俄类芽孢杆菌菌株BD-62的16S rRNA序列的比较，获得了99.8％的同一性值，证实了所有三个新的类芽孢杆菌菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015与皮尔瑞俄类芽孢杆菌的密切关系(参见图9)。
为了构建系统发生树，使用了ARB包的操作(Nucl.Acids Res.35，7188-7196，2007)：基于进化距离值，使用Jukes和Cantor的校正(Mol.Biol.Evol.4，406-425，1987)，通过邻接法(Jukes,T.H.&Cantor C.R.(1969)。Evolution of protein molecules.InMammalian protein metabolism,pp.21-132.H.N.Munro.编辑，New York:Academicpress)，构建了系统发生树。通过将耐热科恩氏菌的16S rRNA基因序列包括至分析中来确定树根。系统树下面的比例尺表示每100个核苷酸1个核苷酸置换。图10中给出了结果。
这些序列的系统发生树(图10)显示出三个新菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015彼此最相关，对于它们之每一个，已知的最相关亲属是皮尔瑞俄类芽孢杆菌菌株NRRL BD-62。
实施例2.2：RiboPrint-分析
使用Qualicon RiboPrintersystem进行了标准化的、自动化的核糖体分型。RiboPrinter系统将核糖体分型的分子处理步骤组合在单机自动化仪器中。该程序包括细胞裂解、用限制性酶EcoRI消化染色体DNA、通过电泳分离片段、DNA片段转移至尼龙膜、与自大肠杆菌的rrnB操纵子产生的探针杂交、化学发光检测探针与含有rrn操纵子序列的片段的杂交、图像检测和RiboPrint模式的计算机化分析(Food Technology 50(1)，77-81，1996；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，5229-5233，1995；Int.Journ.Syst.Bact.44(3)，454-460，1994)。
使用限制性酶EcoRI，通过DSMZ德国，使用新的类芽孢杆菌菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015，与皮尔瑞俄类芽孢杆菌菌株BD-62相比，进行了核糖体分型。使用RiboPrinter系统的软件、集成DuPont识别文库以及BioNumerics软件(Applied Maths，比利时)，比较了所得到的模式。
所有三个新菌株与BD-62的相似性在0.24至0.5之间(图11)。三个新菌株归在两个组中，第一个包含Lu17015，而第二个组中包含菌株Lu16774和Lu17007。没有一个新菌株与DuPont识别文库内的任何菌株具有高于0.84的相似性，并且因此没有得到自动识别。
基于DuPont识别文库的条目DUP-13142(基于皮尔瑞俄类芽孢杆菌DSM 8320的条目)，菌株BD-62已经被鉴定为皮尔瑞俄类芽孢杆菌。
实施例2.3：形态学和生理学表征
在DSMZ，以类似于Gordon，R.E.，Haynes，W.C.&Pang.C.H.-N.(1973)：The GenusBacillus，Agriculture Handbook no.427.Washington DC:US Department ofAgriculture中所述的方法，表征了菌株。结果在表4中给出。
表4：本发明的类芽孢杆菌菌株的表征数据以及与已知的皮尔瑞俄类芽孢杆菌菌株NRRL BD-62的比较。
*n.g.＝无生长
在DSMZ进行了细胞脂肪酸分析，所有菌株显示出类芽孢杆菌属物种的典型特征。
使用可得的遗传、生理和生物化学数据，证实菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015属于类芽孢杆菌属。因为菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015以及BD-62从葡萄糖产生气体，所以它们均不属于杰米拉类芽孢杆菌(Paenibacillus jamilae)。
主要可以使用从一些底物产酸的特征(Int.J.Syst.Bacteriol.43(2)，388-390，1993；In.J.Syst.Bacteriol.46(6)，988-1003，1996)，进行皮尔瑞俄类芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌之间的表型区分。没有一个新菌株与表4中针对这两个物种之任一个完全列出的特征完全匹配，但可得的遗传、生理和生物化学数据总体上最可能指向物种皮尔瑞俄类芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌或至少与皮尔瑞俄类芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌非常密切相关的另一个物种。
由于迄今为止描述的类芽孢杆菌物种的众多性，故不可能基于表4的生理学和形态学标准确定所测试的三个分离物的正确分类学物种(Rainer Borriss，HumboldtUniversity Berlin，未公开的结果)。
然而，完全确定这个属内的物种是不可能的。基于16S-rDNA分析，发现最密切相关的物种和菌株是皮尔瑞俄类芽孢杆菌BD-62(参见，例如，图11)。
实施例2.4：基于编码DnaN、GyrB、RecF、RecN和RpoA的基因的系统发生分析
已经从完整基因组序列或从公共数据库中提取了编码DnaN、GyrB、RecF、RecN和RpoA的基因的核苷酸序列(如表28中列出的序列表)。
用全对全的方法(all against all approach)产生了同一性表(图12至16)，在所述方法中，将每个序列与每另一个序列比对。用程序针(EMBOSS package 6.6.0；Trends inGenetics 16(6)；276-277)进行了序列比对。使用了标准参数(空位形成10.0；空位延伸0.5)。基于比对计算了同一性评分，没有考虑任何空位。
对于系统发生树(图17至21)，使用Clustal Omega(版本1.2.0；MolecularSystems Biology 7:539，doi:10.1038/msb.2011.75)进行了多序列比对。通过最大似然法，使用软件Dnaml(在Phylip 3.696包中执行；Felsenstein 1981，http:// evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)，计算了系统发生树。使用F84距离模型，同时使用二(2)的转换/颠换率(transitiOn/transversion ratio)，建立了系统树图。用工具Dendroscope(http://dendroscope.org/)绘制树。
表28：类芽孢杆菌菌株的dnaN、gyrB、recF、recN和rpoA DNA序列的序列表参考号
实施例2.5：核心基因组比较和AAI矩阵
使用Gieβen大学的软件包EDGAR(BMC Bioinformatics 10，154，2009；(https:// edgar.computational.bio.uni-giessen.de/cgi-bin/edgar.cgi))进行了基因组比较。使用软件包EDGAR，基于完整基因组序列和AAI矩阵值，进行了核心基因组的确定和系统发生树。结果显示于图22。
实施例3：用于体内测试的菌株的生长(可发酵性)
对于温室和田间试验，首先将类芽孢杆菌菌株生长于ISP2平板上(来自BD[USA]的即可使用琼脂，目录编号277010)。此后，在含有液体ISP2培养基的带挡板的摇瓶中接种来自琼脂平板的菌落并在150rpm和25℃下孵育5-7天。根据该测试，将全培养液、或离心且H2O洗后的细胞沉淀物、或上清液施用于植物。可以扩大规模至10L发酵罐。
将类芽孢杆菌菌株在ISP2液体培养基(10g/L麦芽提取物、4g/L细菌培养用酵母提取物、4g/L葡萄糖单水合物)在22℃和150rpm下生长6天。在不同时间点测量指示细菌生长的OD600nm。
表5：液体ISP2培养基中类芽孢杆菌菌株的细菌生长
实施例4-针对抗真菌活性的体外对抗测试
在体外对抗测试中证实了类芽孢杆菌菌株对抗植物病原体的拮抗活性。使用的植物病原真菌是核盘菌(Sclerotina sclerotiorum)(SCLSCL)、灰葡萄孢(Botrytiscinerea)(BOTRCI)、链格孢属物种(Alternaria)(ALTESP)和致病疫霉(PHYTIN)。
作为用于BOTRCI、ALTESP、SCLSCL的生长培养基，使用了ISP2培养基，其每升包含：10g麦芽提取物(Sigma Aldrich，70167)；4g细菌培养用酵母提取物(Becton Dickinson，212750)；4g葡萄糖单水合物(Sigma Aldrich，16301)；20g琼脂(Becton Dickinson，214510)，pH约7，重蒸水。作为用于PHYTIN的生长培养基，使用了V8培养基，其每升包含：200ml蔬菜汁，3g碳酸钙(Merck Millipore，1020660250)；30g琼脂(Becton Dicknson，214510)，pH6.8，重蒸水。
将类芽孢杆菌菌株点接种于琼脂平板的一侧。将含有一种活跃生长的植物病原体的琼脂块(大约0.3cm2)放在平板中央。在25℃孵育7-14天后，检查植物病原体的生长，尤其是抑制区。
此后，在评价前，将琼脂平板在℃下孵育约7-14天。通过评价无真菌区(抑制区)的直径，对抗生作用进行评分。通过将带细菌菌株的平板上真菌病原体的生长直径与对照平板相比，对竞争作用进行评分。在细菌生长超过真菌病原体并且还寄生于病原体的情况中，可以记录真菌寄生作用。这可以通过显微镜来观察。
新的类芽孢杆菌菌株显示出对抗所有测试的植物病原体的抗真菌活性。
表6：体外对抗测试结果
实施例5-温室测试抗植物病原真菌活性
用途实施例5.1：使用保护性施用，对抗致病疫霉引起的番茄晚疫病的活性
将商业上可得的番茄幼苗(“Goldene”)用于所述的温室试验。每个处理使用2个重复(每盆各1株植物)。将植物在温室中，在商业上可得的基质(Universal，Floragard)中，在大约22℃生长。使用专用设备控制湿度(～90％湿度)。使用喷雾箱给植物喷雾相应类芽孢杆菌菌株6天培养物的粗/全培养液(取决于设置)，至滚落。用于菌株的培养条件描述于实施例3中。施用一天后，给处理过的植物接种致病疫霉(PHYTIN)的孢子囊悬浮液。接种后，将测试植物立即转移至潮湿的房间中。在接种后5-7天，通过视觉评价叶子上真菌攻击的程度。未处理的对照中，真菌攻击在80-100％之间，并且出于比较原因，将其设为100％。
表7：
类芽孢杆菌菌株 PHYTIN(％真菌攻击)
Lu17007 4
Lu16774 20
BD-62 53
用途实施例5.2：使用保护性施用，对抗灰葡萄孢在辣椒上引起的灰霉病的活性
将商业可得的辣椒幼苗(“Neusiedler Ideal”)用于所述的温室试验。每个处理使用2个重复(每盆各1株植物)。将植物在温室中，在商业上可得的基质(Universal，Floragard)中，在大约22℃生长。使用专用设备控制湿度(～90％湿度)。使用喷雾箱给植物喷雾相应类芽孢杆菌菌株6天培养物的粗/全培养液(取决于设置)，至滚落。用于菌株的培养条件描述于实施例3中。施用一天后，给处理过的植物接种灰葡萄孢(BOTRCI)的孢子悬浮液。接种后，将测试植物立即转移至潮湿的房间中。在接种后5-7天，通过视觉评价叶子上真菌攻击的程度。未处理对照中，真菌攻击在80-100％之间，并且出于比较原因，将其设为100％。
表8：
用途实施例5.3：使用保护性施用，对抗茄链格孢菌引起的番茄早疫病的活性
将商业可得的番茄幼苗(“Goldene”)用于所述的温室测试。每个处理使用2个重复(每盆各1株植物)。将植物在温室中，在商业上可得的基质(Universal，Floragard)中，在大约22℃生长。使用专用设备控制湿度(～90％湿度)。使用喷雾箱给植物喷雾相应类芽孢杆菌菌株6天培养物的粗/全培养液(取决于设置)，至滚落。用于菌株的培养条件描述于实施例3中。施用一天后，给处理过的植物接种茄链格孢菌(ALTESO)的孢子悬浮液。接种后，将测试植物立即转移至潮湿的房间中。在接种后5-7天，通过视觉评价叶子上真菌攻击的程度。未处理对照中真菌攻击在80-100％之间，并且出于比较原因，将其设为100％。
表9：
类芽孢杆菌菌株 ALTESO(％真菌攻击)
Lu17007 3
Lu17015 16
BD-62 96
用途实施例5.4：使用保护性施用，对抗豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)在大豆上引起的大豆锈病的活性
将商业上可得的大豆幼苗(“Mentor”)用于所述的温室测试。每个处理使用2个重复(每盆各1株植物)。将植物在温室中，在商业上可得的基质(Universal，Floragard)中，在大约22℃生长。使用专用设备控制湿度(～90％湿度)。使用喷雾箱给植物喷雾相应类芽孢杆菌菌株2-6天培养物的粗培养液(取决于设置)，至滚落。施用一天后，给处理过的植物接种豆薯层锈菌(PHAKPA)的孢子悬浮液。接种后，将测试植物立即转移至潮湿的房间中。在接种后5-7天，通过视觉评价叶子上真菌攻击的程度。
用途实施例5.5：使用保护性施用，对抗禾本科镰孢(Fusarium graminearum)在小麦上引起的赤霉病(Fusarium Head Blight)的活性
将商业上可得的小麦幼苗用于所述的温室测试。每个处理使用2个重复(每盆各1株植物)。将植物在温室中，在商业上可得的基质(Universal，Floragard)中，在大约22℃下生长。使用专用设备控制湿度(～90％湿度)。使用喷雾箱给植物喷雾相应类芽孢杆菌菌株2-6天培养物的粗培养液(取决于设置)，至滚落。培养条件如实施例3中所述。施用一天后，给处理过的植物接种禾本科镰孢(GIBBZE)的孢子悬浮液。接种后，将测试植物立即转移至潮湿的房间中。在接种后5-7天，通过视觉评价叶子上真菌攻击的程度。
用途实施例5.6：使用保护性施用,对抗小麦壳针孢(Septoria tritici)引起的小麦叶枯病(speckled leaf blotch)的活性
将商业上可得的小麦幼苗用于所述的温室测试。每个处理使用2个重复(每盆各1株植物)。将植物在温室中，在商业上可得的基质(Universal，Floragard)中，在大约22℃下生长。使用专用设备控制湿度(～90％湿度)。使用喷雾箱给植物喷雾相应类芽孢杆菌菌株2-6天培养物的粗培养液(取决于设置)，至滚落。培养条件如实施例3中所述。施用一天后，给处理过的植物接种小麦壳针孢(SEPTTR)的孢子悬浮液。接种后，将测试植物立即转移至潮湿的房间中。在接种后21-28天，通过视觉评价叶子上真菌攻击的程度。
用途实施例5.7：使用保护性施用,类芽孢杆菌细胞和上清液对抗各种病原体的活性
根据实施例3，获得来自类芽孢杆菌菌株Lu17007的6天培养物的全培养液，并用于用途实施例5.1至5.3的实验设置中。或者，将全培养液通过具有0.2μm孔径的滤器进行过滤，以获得培养物基质和粗细胞级分。可以用初始体积的磷酸盐缓冲盐水，将粗细胞级分进一步洗涤三次，以获得洗涤过的细胞。
按照以上针对各病原体致病疫霉、灰葡萄孢和茄链格孢的用途实施例5.1、5.2和5.3所述的，进行了玻璃暖房测试。在接种后5-7天，通过视觉评价叶子上真菌攻击的程度。未处理对照中，真菌攻击在80-100％之间，并且出于比较原因，将其设为100％。
表10：
实施例6-酶试验
用途实施例6.1：几丁质酶
几丁质酶试验固体培养基：
2g/l NaNO3、1g/l K2HPO4、0.5g/l MgSO4、0.5g/l KCl、0.2g/l蛋白胨、15g/l琼脂、10g/l来自蟹壳的几丁质(Sigma-Aldrich C7170)。
将试验固体培养基高压灭菌并且装入9cm皮氏培养皿中。将类芽孢杆菌菌株接种在平板中心并在27℃下孵育两天。此后，用1:3稀释的Lugol溶液(Carl Roth N052.2)将平板染色5至10分钟。将Lugol溶液倒出并且将平板拍照并评价。不同菌株的生长不超过5-10mm。未染色区(用几丁质酶活性校正)从0mm(无活性，表11中的“-”)至几cm(表11中的“+”)。
用途实施例6.2：纤维素酶
纤维素酶试验固体培养基：
2g/l NaNO3、1g/l K2HPO4、0.5g/l MgSO4、0.5g/l KCl、0.2g/l蛋白胨、15g/l琼脂、羧甲基纤维素，钠盐(Sigma-Aldrich 419273)。
将培养基高压灭菌，装入9cm皮氏培养皿中。将类芽孢杆菌菌株接种在平板中心并在27℃下孵育两天。此后，用1:3稀释的Lugol溶液(Carl Roth N052.2)将平板染色5至10分钟。将Lugol溶液倒出并且将平板拍照并评价。
用途实施例6.3：淀粉酶
淀粉酶试验固体培养基：
2g/l NaNO3、1g/l K2HPO4、0.5g/l MgSO4、0.5g/l KCl、0.2g/l蛋白胨、15g/l琼脂、10g/l可溶性淀粉(Merck 1.01252)。
将培养基高压灭菌，倒入9cm皮氏培养皿中。将类芽孢杆菌菌株接种在平板中心并在27℃下孵育两天。此后，用1:3稀释的Lugol溶液(Carl Roth N052.2)将平板染色5至10分钟。将Lugol溶液倒出并且将平板拍照并评价。
表11：类芽孢杆菌菌株的几丁质酶、纤维素酶和淀粉酶活性
菌株 几丁质酶 纤维素酶 淀粉酶
Lu16774 + + -
Lu17007 ++ + +
Lu17015 + + +
BD-62 - - -
-，无活性；(+)，低活性；+，常规活性；++，高活性
实施例7-获自类芽孢杆菌菌株的杀镰孢菌素型代谢物
实施例7.1：大规模培养细胞分离物和提取杀镰孢菌素型代谢物
a)培养
将类芽孢杆菌菌株在含有GYM培养基(10g/l葡萄糖、4g/l酵母提取物、10g/l麦芽提取物；pH5.5，在高压灭菌前调节)和20g/l琼脂的琼脂平板上培养。培养在室温下进行10至20天。对于维持，使用具有相同培养基的琼脂斜面，并储存在4℃。
给小规模液体培养物(500ml烧瓶中250ml GYM培养基)接种4-5块生长良好的琼脂培养物并且在室温下(20-23℃)在120rpm下在轨道摇床中培养。
大规模发酵在20l发酵罐中进行，使用15l GYM培养基(由于形成泡沫，没有使用发酵罐的总容量)，接种了250ml生长良好的液体培养物并且在室温下(20-23℃)使用搅拌(120rpm)和通气(3l/分钟)进行发酵5至8天。
b)提取
将一份等体积的异丙醇加入全培养液中(没有自液体培养物分离生物质)。搅拌并孵育2至16小时后，将普通食盐(氯化钠-100至200g/l)加入混合物中，直至可见有机相和水相的相分离。
将异丙醇相真空浓缩。将所得到的提取物，仍然含有大量盐，溶解于甲醇中，离心以更好地沉淀盐残余物，将有机相再次浓缩。重复这个步骤，直至不存在任何盐沉淀物。
c)纯化
i)硅胶色谱
将30克提取物溶解于甲醇中并结合于50g硅胶(Merck，K60，70-230目)，在40℃干燥，并且在1kg硅胶上(柱大约10cm直径，30cm高)分层。
如下进行四步洗脱：
步骤1-4∣乙酸乙酯
步骤2-4∣乙酸乙酯:甲醇(3:1，v/v)
步骤3-7∣乙酸乙酯:甲醇(1:1，v/v)
步骤4-4∣甲醇。
将含有活性化合物的第三个级分(中间体1)真空干燥并溶解于0.1％甲酸(FA)中的40％甲醇(MeOH)中(浓度：100mg/ml)。丢弃其他级分。
ii)Chromabond HR-X分级
将20ml中间体1加载至之前(用0.1％FA中的40％MeOH)平衡的Chromabond HR-X筒(Macherey-Nagel，1000mg，ref 730941)上。用100ml 0.1％FA中的40％MeOH洗涤筒并用60ml 0.1％FA中的70％MeOH洗脱。然后将该中间体1-1真空干燥。
iii)Sunfire C18柱上制备性HPLC
将中间体1-1溶解于DMSO中(浓度：200mg/ml)并将300μl的中间体1-1在SunfireC18柱(19×250mm，5μm，Waters)上按如下进行色谱：
以10ml/分钟，16分钟，等度70％0.2FA；30％乙腈(ACN)，
以14ml/分钟，1分钟，梯度至65％0.2FA；35％ACN，
以14ml/分钟，5分钟，等度65％0.2FA；35％ACN。
可以检测到五个级分。将所有五个所得到的级分真空干燥并溶解于DMSO中(浓度：125mg/ml)。使用相同柱进行进一步纯化，并针对每个级分，调节等度条件(流速：10.5ml/分钟)(12.5mg/运行)：
级分1：69％0.2FA；31％ACN；检测到两个峰(1-1和1-2)
级分2：69％0.2FA；31％ACN；检测到两个峰(2-1和2-2)
级分3：69％0.2FA；31％ACN；检测到三个峰(3-1、3-2和3-3)
级分4/5：67％0.2FA；33％ACN；检测到一个峰(4/5)
级分6：65％0.2FA；35％ACN；检测到两个峰(6-1和6-2)
以下样品的纯度和品质足以用于NMR分析和结构解析：峰1-2,2-1,3-2,4/5,和6-1。
实施例7.2：新化合物1A和1B的结构解析
对于级分2的峰2-1，作为棕色油获得了化合物1A和1B(比例约3:7)的混合物([α]D 25＝+20.9(c＝0.6，DMSO-d6))。
从HR-ESI-MS光谱推断出主要组分化合物1B的分子式C47H78N10O12，其在m/z975.5863[M+H]+；ESI-MS:975.6(100％,[M+H]+)，488.4(51％,[M+2H]2+)产生峰。
此外，混合物还含有作为主要组分的较轻的同系物1A，两种化合物之间的质量差为14amu。在ESI-MS光谱中在m/z 961.6处观察到的第二个峰，支持了这种观察结果。
除了δ6.83和8.58之间可交换质子的信号，NMR光谱(表12)包括δ166.0-174.5范围的羰基共振以及δ47.8和δ60.4之间的次甲基信号(指示肽)。
化合物1B的1D-和2D-NMR数据的广泛分析揭示了六个氨基酸的存在，包括酪氨酸(Tyr)、谷氨酰胺(Gln)、丙氨酸(Ala)、两个苏氨酸(Thr1和Thr2)和异亮氨酸(Ile)。使用跨酰胺官能的两个或三个键联系，发现了它们的序列。因此，COSY、NOESY(图2)和HMBC(图3)光谱描绘了从δ8.58的Thr2氮质子到δ3.84的Thr2的次甲基质子信号和δ166.7的Tyr的羰基的联系，同时在δ8.52的Tyr的氮质子以及δ2.60的Tyr的亚甲基质子信号和δ170.4的Ile的羰基之间，注意到了相同关系。此外，δ4.16的Ile的次甲基氢与δ170.4的Ile的羰基信号具有强烈联系，并且与δ168.6的Thr1具有弱接触；δ5.30的Thr1的β-次甲基质子信号与δ170.4的Ala的羰基信号关联。除了上述关联，从Ala的δ7.27的N-质子到相同氨基酸的δ4.20的次甲基质子展示了其他关联，而这后一质子与其氨基的羰基和Gln的羰基具有相同的相互作用。此外，从Gln的δ8.20的可交换质子到Gln的δ3.87的次甲基氢和δ170.6的Thr2的羰基，揭示了交叉峰；这些上述的数据表明了化合物1B的环缩酚酸肽结构(cyclodepsipeptidicstructure)。
这种环缩酚酸肽1B含有连接至Thr1的末端胍β-羟基脂肪酸，因为在δ4.39的α-次甲基质子信号和δ171.9的羰基共振之间观察到了关键的联系；进一步观察到HMBC接触，从δ171.9的羰基至δ2.35的α-亚甲基质子和δ3.77的β-次甲基质子,以及在δ3.03的亚甲基质子和δ157.2的胍碳之间。基于在m/z 256.2的母体[M+H]+离子的APCI-MS-MS光谱中观察到的碎片离子，推断侧链在β-羟基和胍基团之间含有十二个亚甲基基团。同样，这个光谱提供了信息(图4b)，其证实了氨基酸的连接序列并导致阐明如图1中所示的化合物1B的结构。
在1D-和2D-光谱中在2.80、2.52/36.3的CH2基团信号推测对应于化合物1A中的天冬酰胺(Asn)的β-CH2基团。这种结论得到已报道的数据(Heterocycles 53，1533-1549，2000)和获自m/z 961.6的母峰的MS/MS的片段的支持。同样，后面的分析提供了信息(图4a、4b)，其证实了两种化合物中的氨基酸连接序列并导致阐明如图1中所示的化合物1A和1B的结构。
实施例7.3：作为杀镰孢菌素C和D的化合物2A和2B的结构鉴定
从级分1的峰1-2，获得了作为棕色油的化合物2A和2B的混合物(比例约为1:1)。基于低分辨率质谱，较重组分化合物2B的分子式测定为C46H76N10O12。NMR数据的分析(表13)允许鉴定化合物2B为杀镰孢菌素D。混合物的较轻组分化合物2A，同样鉴定为杀镰孢菌素C，其中杀镰孢菌素C的Gln残基被Asn替代。
分别针对化合物2B和2A的m/z 961.6和947.6的母体离子的质谱碎裂方式(图5a、5b)证实了取代脂肪酸侧链的长度与化合物1B中的相同。杀镰孢菌素C和D之前已经被Kajimura等报道过(J.Antibiot.50，220-228，1997)。
实施例7.4：作为LI-F08b的化合物3的结构鉴定
从级分6的峰6-1，作为棕色油分离了化合物3，并且其低分辨率呈现了m/z 925.6[M+H]+的峰，这结合NMR数据(表14)，形成分子式C44H80N10O11。化合物3在NMR谱中显示出与化合物1B和2B(杀镰孢菌素D)相似的特征，除了芳香族信号的存在(表14)。因此，观察到了肽的特征性共振，即δ6.89和8.49之间连接氮的质子的十个信号，范围在δ168.1和174.3之间的羰基的八个共振，以及δ48.0和59.5之间包括的N-次甲基的六个信号。HMQC、COSY和TOCSY谱的详细分析揭示了存在六个氨基酸，包括Gln，两个Thr单元，两个Ile单元和Ala。此外，这些光谱显示出归因于与化合物1A、1B以及杀镰孢菌素C(2A)和D(2B)相同的具有末端胍的β-羟基脂肪酸的化学位移。基于Thr1的δ4.44的N-次甲基的质子信号和脂肪酸的δ172.1的羰基信号之间的HMBC谱发现的长范围关联，确定了这个侧链的位置。从NOESY相互作用和碎裂方式推断氨基酸的序列(图6)。
NMR数据(表14)和质谱的组合导致将代谢物化合物3鉴定为LI-F08b，在本文中也称为杀镰孢菌素LI-F08b，首次由Kuroda等报道(Heterocycles 53，1533-1549，2000)。
实施例7.5：分别作为LI-F06a和LI-F06b的化合物4A和4B以及作为杀镰孢菌素A和B的化合物5A和5B的结构鉴定
从级分4/5的峰4/5，获得了两种另外的代谢物化合物4A和4B的混合物(比例约为1:3)，其在ESI-MS光谱中给出了m/z 897.5(4A)和911.6(4B)的两个峰，表明两种另外的类似环缩酚酸肽(cyclodepsipeptide)。在其NMR谱(表15)中观察到了表示肽的共振以及末端为胍基团的β-羟基脂肪酸的那些。针对化合物4A和4B(图7a、7b)发现的两种母体离子的碎裂方式允许确定氨基酸的序列以及将混合物的组分分别鉴定为LI-F06a(4A)和LI-F06b(4B)。
以相同方式分析了从级分3的峰3-2获得的化合物5A和5B的混合物(比例约为1:3)。混合物的ESI质谱显示出m/z 883.6(5A)和897.5(5B)的两个峰，并且这些母体离子的碎裂方式(图8a，8b)结合NMR数据(表16)允许将组分鉴定为杀镰孢菌素A(5A)和杀镰孢菌素B(5B)。针对4A、4B、5A和5B发现的数据与之前报道的那些匹配(J.Antibiot.50，220-228，1997；Heterocycles 53，1533-1549，2000)。
表12.化合物1A和1B的1H(DMSO-d6,600MHz)和13C-NMR(DMSO-d6,150MHz)数据
*Pos.＝位置；FA＝脂肪酸；Gu＝胍；nf＝未发现。图例也适用于表13至16。
表13.化合物2A和2B的1H(DMSO-d6,600MHz)和13C-NMR(DMSO-d6,150MHz)数据
表14.作为LI-F08b的化合物3的1H(DMSO-d6,600MHz)和13C-NMR(DMSO-d6,150MHz)数据
表15.化合物4A和4B的1H(DMSO-d6,600MHz)和13C-NMR(DMSO-d6,150MHz)数据
表16.化合物5A和5B的1H(DMSO-d6,600MHz)和13C-NMR(DMSO-d6,150MHz)数据
没有进行水解实验来测定组成氨基酸的构型。
实施例8-类芽孢杆菌菌株产生的代谢物
实施例8.1：类芽孢杆菌菌株的代谢物产生
以上实施例7.1中所述的程序步骤后，测定类芽孢杆菌菌株的一般杀镰孢菌素和特别是已知的杀镰孢菌素A、B、C、D、LI-F06a、LI-F06b和LI-F08b以及新的杀镰孢菌素型化合物1A和1B的存在。
表17：类芽孢杆菌菌株的杀镰孢菌素型代谢物产生。
说明：-，化合物不可检测；+，化合物可检测；++，与等级+相比化合物以较高含量可检测。
所有新的类芽孢杆菌菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015的全培养液都含有至少一种实施例7中鉴定的杀镰孢菌素型代谢物(表17)。在皮尔瑞俄类芽孢杆菌菌株BD-62的全培养液中没有检测到这些杀镰孢菌素型代谢物。
新的类芽孢杆菌菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015的全培养液全部含有新的杀镰孢菌素型化合物1A和1B。此外，新的类芽孢杆菌菌株Lu16774、Lu17007和Lu17015的全培养液全部含有杀镰孢菌素A、B、C和D以及LI-F08b。此外，新的杀镰孢菌素菌株Lu17007和Lu17015的全培养液含有杀镰孢菌素LI-F06a和LI-F06b。
在密切相关的皮尔瑞俄类芽孢杆菌菌株BD-62的全培养液中没有检测到化合物1A和1B。在皮尔瑞俄类芽孢杆菌菌株BD-62的全培养液中也没有检测到杀镰孢菌素A、B、C和D、LI-F06a、LI-F06b和LI-F08b。
实施例9：类芽孢杆菌菌株的代谢物对抗各种真菌病原体的活性
将获得的化合物1A和1B、杀镰孢菌素A、B和D用于以下实验中。
在96孔平板中进行真菌生长测试，使用病原体灰葡萄孢(BOTRCI，在YBA中[10g细菌培养用蛋白胨(Becton Dickinson 211677)，10g酵母提取物(Becton Dickinson212750)，20g醋酸钠，用重蒸水补足1000mL])或茄链格孢(ALTESO，在YBG中[10g细菌培养用蛋白胨(Becton Dickinson211677)，10g酵母提取物(Becton Dickinson 212750)，20g甘油99％，用重蒸水补足1000mL])的孢子悬浮液。将杀镰孢菌素以及化合物1A和1B在DMSO中溶解并稀释。将从60μM降至0.3μM的不同浓度范围吸移至微滴定平板中。加入104个孢子/ml的水性悬浮液。将平板在约18℃孵育。通过在接种孢子后3天和7天在微平板读数仪中在600nm下测量光密度来测定真菌生长并与未处理对照(DMSO)进行比较。此后测定了IC50(50％真菌生长抑制需要的各代谢物的浓度[μM])。
值得注意的是，化合物1A和1B显示出最高的抗真菌功效，具有0.4-0.6μM的IC50值(表18)。
表18.类芽孢杆菌代谢物IC50值的抗真菌生长抑制
“-”表示在测试浓度范围的生长抑制不足以测定IC50。
此外，按照以上针对各自的病原体灰葡萄孢(BOTRCI)、茄链格孢(ALTESO)、致病疫霉(PHYTIN)、豆薯层锈菌(PHAKPA)和禾谷镰刀菌(GIBBZE)的用途实施例5.1至5.5所述的，用化合物1A和1B进行了温室测试。在接种后5-7天通过视觉评价叶上真菌攻击的程度。
值得注意的是，化合物1A和1B已经在低如7.2ppm的剂量水平下在控制作物上的重要真菌疾病中是有效的并且显示出高于杀镰孢菌素A、B和D的抗真菌功效(表19至21)。
表19.在植物中原位测定的代谢物的抗真菌功效。
表20.保护性应用的代谢物对抗番茄上由致病疫霉引起的晚疫病的功效。
测试的代谢物 浓度 ％功效(％真菌攻击)
未处理的 - 0(100)
杀镰孢菌素A 7.2ppm 15
杀镰孢菌素B 7.2ppm 4
杀镰孢菌素D 7.2ppm 0
化合物1B 7.2ppm 44
表21.保护性应用的代谢物对抗小麦上由禾谷镰刀菌引起的穗疫病的功效。
测试的代谢物 浓度 ％功效(％真菌攻击)
未处理的 - 0(100)
杀镰孢菌素A 360ppm 31
杀镰孢菌素B 360ppm 0
化合物1A 360ppm 49
表22.保护性应用的代谢物对抗小麦上由小麦壳针孢引起的穗疫病的功效。
实施例10：温室测试中本发明的多粘类芽孢杆菌植物新亚种菌株Lu16674和Lu17007与多粘类芽孢杆菌植物新亚种M-1对抗各种病原体的活性的比较
根据用途实施例3获得了类芽孢杆菌菌株Lu17007、Lu16674和M1的6天培养物的全培养液并且按照用途实施例5.1至5.5的实验设置来使用。按照以上针对各自病原体的用途实施例5.1至5.5中所述的来进行温室测试。接种后5-7天通过视觉评价叶上的真菌攻击程度。
值得注意的是，类芽孢杆菌菌株Lu16774和Lu17007即使在高稀释倍数下对控制作物上的重要真菌疾病是有效的，并且显示出高于密切相关的菌株M-1的抗真菌功效(表22至27)。
表22.
类芽孢杆菌菌株 全培养液的稀释倍数 BOTRCI％功效(％真菌攻击)
未处理的 0(100)
Lu16674 1:10 95
M-1 1:10 86
Lu16674 1:50 76
Lu17007 1:50 98
M-1 1:50 51
表23.
表24.
类芽孢杆菌菌株 全培养液的稀释倍数 ALTESO％功效(％真菌攻击)
未处理的 0(100)
Lu16674 1:10 77
M-1 1:10 41
表25.
类芽孢杆菌菌株 全培养液的稀释倍数 PHYTIN％功效(％真菌攻击)
未处理的 0(100)
Lu17007 1:10 83
M-1 1:10 42
Lu16674 1:50 13
Lu17007 1:50 30
M-1 1:50 0
表26.
类芽孢杆菌菌株 全培养液的稀释倍数 PHAKPA％功效(％真菌攻击)
未处理的 0(100)
Lu17007 未稀释的 94
M-1 未稀释的 87
表27.
本文中引用的文献通过引用并入作为参考。
附图简述
图1.化合物1A、1B、2A、2B、3、4A、4B、5A和5B。
图2.化合物1B的主要NOESY和COSY关联。
图3.化合物1B的HMBC关联。
图4.化合物1A的碎裂方式a)和化合物1B的碎裂方式b)。
图5.化合物2A(杀镰孢菌素C)的碎裂方式a)和化合物2B(杀镰孢菌素D)的碎裂方式b)。
图6.化合物3(LI-F08b)的碎裂方式。
图7.化合物4A(LI-F06a)的碎裂方式a)和化合物4B(LI-F06b)的碎裂方式b)。
图8.化合物5A(杀镰孢菌素A)的碎裂方式a)和化合物5B(杀镰孢菌素B)的碎裂方式b)。
图9显示了多个序列比对后本发明的类芽孢杆菌菌株与相关分类群的完整16SrDNA序列的同一性百分数。
图例：*菌株编号：1＝类芽孢杆菌菌株Lu16774；2＝类芽孢杆菌菌株Lu17015；3＝类芽孢杆菌菌株Lu17007；4＝皮尔瑞俄类芽孢杆菌NRRL BD-62；5＝安艾瑞克类芽孢杆菌(Paenibacillus anaericanus)MH21；6＝巴西类芽孢杆菌PB172；7＝坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)324；8＝奇本类芽孢杆菌(Paenibacillus chibensis)JCM 9905；9＝解葡糖类芽孢杆菌(Paenibacillus glucanolyticus)DSM 5162；10＝湖南类芽孢杆菌(Paenibacillus hunanensis)FeL05；11＝杰米拉类芽孢杆菌CECT5266；12＝胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus kribbensis)AM49；13＝乳类芽孢杆菌(Paenibacilluslactis)MB 1871；14＝灿烂类芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)JCM 9073；15＝浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)IAM12467；16＝玛斯里类芽孢杆菌(Paenibacillusmassiliensis)2301065；17＝饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)HSCC 492；18＝皮尔瑞俄类芽孢杆菌DSM 8320(BD-57)；19＝皮尼类芽孢杆菌(Paenibacillus pini)S22；20＝多粘类芽孢杆菌IAM 13419；21＝普里斯帕蒂类芽孢杆菌(Paenibacillus purispatii)ES_MS17；22＝沉积物类芽孢杆菌(Paenibacillus sediminis)GT-H3；23＝土地类芽孢杆菌(Paenibacillus terrae)AM141；24＝土壤类芽孢杆菌(Paenibacillus terrigena)A35；25＝提摩类芽孢杆菌(Paenibacillus timonensis)2301032；26＝图列茨类芽孢杆菌(Paenibacillus turicensis)MOL722；27＝潮湿类芽孢杆菌(Paenibacillus uliginis)N3/975；28＝耐热科恩氏菌(Cohnella thermotolerans)CCUG 47242。菌株6至28是用于各自物种的模式菌株。
新菌株与皮尔瑞俄类芽孢杆菌(NRRL BD-62和DSM 8320)的相似性已经以粗体标注。
图10显示了从本发明的类芽孢杆菌菌株与其他分类群的16S-rDNA序列的％同一性(图9)计算的系统发育树。通过将耐热科恩氏菌的16S rRNA基因序列包括在分析中来确定树根。发育图下面的比例尺表示每100个核苷酸1个核苷酸置换。
图11显示了使用RiboPrinter微生物表征系统和从其得到的系统发育树，从本发明的类芽孢杆菌菌株的样品与密切相关的皮尔瑞俄类芽孢杆菌的样品相比获得的RiboPrint模式。
图12显示了多序列比对后本发明的类芽孢杆菌菌株的dnaN基因的DNA序列与相关类芽孢杆菌菌株的同一性百分数。
图例：*菌株编号：1＝类芽孢杆菌菌株Lu16774；2＝类芽孢杆菌菌株Lu17007；3＝类芽孢杆菌菌株Lu17015；4＝皮尔瑞俄类芽孢杆菌DSM8320T＝KCTC 3763T(GenBank登录号AGFX00000000；J.Bacteriol.194，1237-1238，2012)；5＝多粘类芽孢杆菌1-43(GenBank登录号ASRZ01000000；保藏号GCMCC 4965；CN 102352332B)；6＝多粘类芽孢杆菌A18(GenBankacc.no JWJJ00000000.1；NCBI Project ID 225496)；7＝多粘类芽孢杆菌ATCC 842T＝DSM36T＝KCTC 3858T(GenBank登录号AFOX00000000；J.Bacteriol.193(18)，5026–5027,2011)；8＝多粘类芽孢杆菌CF05(GenBank登录号CP009909；Genome Announc3(2):e00198-15.Doi:10.1128/genomeA.00198-15)；9＝多粘类芽孢杆菌CICC10580(GenBank登录号JNCB00000000；Genome Announc.2(4):e00854-14.doi:10.1128/基因组A.00854-14)；10＝多粘类芽孢杆菌DSM 365(GenBank登录号JMIQ00000000；J.Biotechnol.195，72-73，2015)；11＝多粘类芽孢杆菌E681(GenBank登录号CP000154；GenomeNet Ref Seq NC_014483.2；J.Bacteriol.192(22),6103-6104,2010)；12＝多粘类芽孢杆菌M-1(GenBank登录号HE577054.1；GenomeNet Ref Seq NC_017542.1)；13＝多粘类芽孢杆菌NRRL B-30509(GenBank登录号JTHO00000000；Genome Announc.2015Mar-Apr；3(2):e00372-15)；14＝多粘类芽孢杆菌SC2(GenBank登录号CP002213；J.Bacteriol.193(1)，311-312，2011)；15＝多粘类芽孢杆菌SQR-21(GenBank登录号CP006872；GenomeNet Ref Seq NZ_CP006872.1；Genome Announc.2014Mar-Apr；2(2):e00281-14)；16＝多粘类芽孢杆菌Sb3-1(GenBank登录号CP010268；Genome Announc.2015Mar-Apr；3(2):e00052-15)；17＝多粘类芽孢杆菌TD94(GenBank登录号ASSA00000000)；17＝多粘类芽孢杆菌WLY78(GenBank登录号ALJV00000000)；土地类芽孢杆菌HPL-003(GenBank登录号CP003107；NCBI Ref Seq NC_016641.1)；多粘类芽孢杆菌CR1(GenBank登录号CP006941；Genome Announc.2014Jan-Feb；2(1):e01218-13)。
图13显示了多序列比对后本发明的类芽孢杆菌菌株的完整gyrB基因的DNA序列与相关类芽孢杆菌菌株的同一性百分数。菌株编号如图12中图例所述。
图14显示了多序列比对后本发明的类芽孢杆菌菌株的完整recF基因的DNA序列与相关类芽孢杆菌菌株的同一性百分数。菌株编号如图12中图例所述。
图15显示了多序列比对后本发明的类芽孢杆菌菌株的完整recN基因的DNA序列与相关类芽孢杆菌菌株的同一性百分数。菌株编号如图12中图例所述。
图16显示了多序列比对后本发明的类芽孢杆菌菌株的完整rpoA基因的DNA序列与相关类芽孢杆菌菌株的同一性百分数。菌株编号如图12中图例所述。
图17显示了基于多粘类芽孢杆菌复合物菌株的完整dnaN基因序列的最大似然聚类图。所示的0.1刻度对应于1％核苷酸交换。
图18显示了基于多粘类芽孢杆菌复合物菌株的完整gyrB基因序列的最大似然聚类图。所示的0.1刻度对应于1％核苷酸交换。
图19显示了基于多粘类芽孢杆菌复合物菌株的完整recF基因序列的最大似然聚类图。所示的0.1刻度对应于1％核苷酸交换。
图20显示了基于多粘类芽孢杆菌复合物菌株的完整recN基因序列的最大似然聚类图。所示的0.1刻度对应于1％核苷酸交换。
图21显示了基于多粘类芽孢杆菌复合物菌株的完整rpoA基因序列的最大似然聚类图。所示的0.1刻度对应于1％核苷酸交换。
图22显示了根据实施例2.5进行的多粘类芽孢杆菌复合物的代表性基因组的氨基酸指数(AAI)矩阵。菌株编号如图12中图例所述。

Claims (20)

1.类芽孢杆菌(Paenibacillus)菌株，其选自：
a)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的菌株Lu16774；
b)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的菌株Lu17007；
c)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的菌株Lu17015；和
d)包含呈现以下特征的DNA序列的菌株
d1)与DNA序列SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:9至少99.6％核苷酸序列同一性；或
d2)与DNA序列SEQ ID NO:14至少99.8％核苷酸序列同一性；或
d3)与DNA序列SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:10至少99.9％核苷酸序列同一性；或
d4)与DNA序列SEQ ID NO:15至少99.2％核苷酸序列同一性；或
d5)与DNA序列SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:11至少99.2％核苷酸序列同一性；或
d6)与DNA序列SEQ ID NO:16至少99.8％核苷酸序列同一性；或
d7)与DNA序列SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:12至少99.8％核苷酸序列同一性；或
d8)与DNA序列SEQ ID NO:17至少99.3％核苷酸序列同一性；或
d9)与DNA序列SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:13 100.0％核苷酸序列同一性；或
d10)与DNA序列SEQ ID NO:18至少99.8％核苷酸序列同一性。
2.根据权利要求1的类芽孢杆菌菌株，其选自：
a)以保藏号DSM 26969保藏于DSMZ的菌株Lu16774；
b)以保藏号DSM 26970保藏于DSMZ的菌株Lu17007；
c)以保藏号DSM 26971保藏于DSMZ的菌株Lu17015；和
d)包含呈现以下特征的DNA序列的菌株
d1)与DNA序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14中的任一DNA序列至少99.8％核苷酸序列同一性；或
d2)与DNA序列SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:15中的任一DNA序列100.0％核苷酸序列同一性；或
d3)呈现与DNA序列SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:16中的任一DNA序列至少99.8％核苷酸序列同一性；或
d4)与DNA序列SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:17中的任一DNA序列至少99.8％核苷酸序列同一性；或
d5)与DNA序列SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:18中的任一DNA序列100.0％核苷酸序列同一性。
3.根据权利要求1或2的类芽孢杆菌菌株，其中所述类芽孢杆菌菌株具有对抗至少两种选自链格孢属物种(Alternaria)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、致病疫霉(Phytophthorainfestans)和核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的植物病原体的抗真菌活性。
4.根据权利要求1至3任一项的类芽孢杆菌菌株，其中所述类芽孢杆菌菌株能够在包含至少一种碳源和一种氮源的生长培养基中产生至少一种以下化合物：
或其农业上可接受的盐。
5.根据权利要求4的类芽孢杆菌菌株，其中所述类芽孢杆菌菌株进一步能够产生至少三种选自杀镰孢菌素A、杀镰孢菌素B、杀镰孢菌素C、杀镰孢菌素D、LI-F06a、LI-F06b和LI-F08b的化合物；或其农业上可接受的盐。
6.根据权利要求1至3任一项的类芽孢杆菌菌株，其中所述类芽孢杆菌菌株包含至少一种以下化合物：
或其农业上可接受的盐。
7.根据权利要求6的类芽孢杆菌菌株，其中所述类芽孢杆菌菌株进一步包含至少三种选自杀镰孢菌素A、杀镰孢菌素B、杀镰孢菌素C、杀镰孢菌素D、LI-F06a、LI-F06b和LI-F08b的化合物；或其农业上可接受的盐。
8.如权利要求1至7任一项中定义的类芽孢杆菌菌株的基本上纯化的培养物。
9.如权利要求1至7中任一项中定义的类芽孢杆菌菌株的全培养液或无细胞提取物。
10.培养基，所述培养基是通过在培养基中培养如权利要求1至7任一项中定义的类芽孢杆菌菌株并将培养基与培养液分离可获得的。
11.式I的化合物或其农业上可接受的盐
其中
R选自15-胍基-3-羟基十五烷酸(GHPD)和12-胍基十二烷酸(12-GDA)；
X1是苏氨酸；
X2是异亮氨酸；
X3是酪氨酸；
X4是苏氨酸；
X5选自谷氨酰胺和天冬酰胺；
X6是丙氨酸；和
其中箭头定义了R的羰基部分和氨基酸X1的氨基之间或一个氨基酸的羰基和相邻氨基酸的氨基之间的单个(酰胺)键，其中箭头的尖端表示与所述氨基酸X1或所述相邻氨基酸的氨基的连接；和
其中单线(没有箭头头部)定义了X6的羰基和X1的羟基之间的单个(酯)键。
12.根据权利要求11的化合物，选自化合物1A和1B：
或其农业上可接受的盐。
13.制备如权利要求11或12中定义的化合物或其盐的方法，该方法包括培养类芽孢杆菌菌株以及从全培养液回收所述化合物或其盐。
14.组合物，其包含
a)如权利要求1至7任一项中定义的类芽孢杆菌菌株；或
b)如权利要求8中定义的基本上纯化的培养物；或
c)如权利要求9中定义的全培养液或无细胞提取物；或
d)如权利要求10中定义的培养基；或
e)如权利要求11或12中定义的式I化合物或其盐；
和辅助剂。
15.权利要求14的组合物，其进一步包含农药。
16.权利要求15的组合物，其中农药是进一步的生物农药。
17.植物繁殖材料，其具有包含如权利要求14至16任一项中定义的组合物的涂层。
18.如权利要求14至16任一项中定义的组合物的用途，用于控制或抑制植物病原体或防止植物病原体感染或用于保护材料对抗有害微生物的侵袭破坏。
19.控制、抑制病原体或防止病原体感染的方法，其中用有效量的如权利要求14至16任一项中定义的组合物处理病原体、其栖息地或待对抗病原体攻击而受到保护的材料或植物，或土壤或繁殖材料。
20.权利要求17的用途或权利要求18的方法，其中病原体和/或有害微生物选自有害真菌。
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