KR20090123158A - 살모넬라균에 대한 길항균 패니바실러스 폴리메이샤ｓｅ―85 및 이들 배양액 추출물을 이용한 항균 난좌제조방법 - Google Patents

살모넬라균에 대한 길항균 패니바실러스 폴리메이샤ｓｅ―85 및 이들 배양액 추출물을 이용한 항균 난좌제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 계란을 운반하고 장기 저장하기 위한 항균 난좌(卵座) 및 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식중독균인 살모넬라(Salmonella)에 길항력을 가지는 신규 미생물인 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85를 특징으로 이들 배양액 추출물을 이용한 항균 난좌의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른, 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주는 식중독균인 살모넬라의 생육을 억제할 수 있고, 상기 길항 균주의 배양액 추출물을 난좌에 처리할 경우, 살모넬라의 생육을 현저하게 억제시키는 효과가 있다.
살모넬라, 길항균, 난좌, 패니바실러스 폴리메이샤

Description

살모넬라균에 대한 길항균 패니바실러스 폴리메이샤 ＳＥ―85 및 이들 배양액 추출물을 이용한 항균 난좌 제조방법{Novel Paenibacillus polymyxa SE-85 and Method for Preparing a Antibacterial Substance Coated Egg Trays Using the Culture extracts of Antagonistic Bacteria against Salmonella Species Using the Same}
본 발명은 계란을 운반하고 장기 저장하기 위한 항균 난좌(卵座) 및 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식중독균인 살모넬라(Salmonella)에 길항력을 가지는 신규 미생물인 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85를 특징으로 이들 배양액 추출물을 이용한 항균 난좌의 제조방법에 관한 것이다.
농가에서 생산된 계란이 최종 소비자에게 이르기까지는 수집, 가공처리, 검사, 저장, 포장, 수송 등 여러 과정을 거치게 되는데 일반적인 계란의 유통구조는 생산농가, 수집반출상, 중간도매상, 소매상, 소비자 등의 단계를 밟게 된다.
실제로 계란의 유통경로는 매우 복잡하며 양계장에서 생산된 계란의 출하기간이 대규모 농가를 제외한 대부분의 농가에서 4일 ~ 7일 이상 실온에 방치되고, 양계장에서 수집한 계란은 수집 반출상을 통해 도매상이나 소매상으로 거쳐 소비자 에게 판매되는 과정에서 3일 ~ 10일 정도 소요되어, 외부기온이 높은 하절기에는 신선도 유지에 큰 문제점으로 지적된다.
계란의 유통과정 중에 계란이 파손되지 않도록 종이 혹은 플라스틱 재질의 난좌에 계란을 담아서 운반 및 저장하고 있다.
난좌를 종이재질로 제조할 때에는 통상적으로 펄프몰드를 사용하는데, 펄프몰드란 물과 펄프와 기타 첨가제를 혼합하여 만든 펄프슬러지를 다양한 형태의 금형으로 성형한 후, 이를 건조하여 만든 성형품으로 제조과정이 간단하고 다양한 입체성형이 가능하며, 완충력과 내하중력이 뛰어나고, 환경친화적인 소재를 사용하고 있으므로, 계란의 운반, 저장을 위한 난좌의 소재로 널리 쓰이고 있다.
그러나 재질이 종이라 수분을 흡수하면 살모넬라(Salmonella)균의 번식이 용이하여 계란이 쉽게 부패되는 단점도 있다.
살모넬라(Salmonella) 균에 의한 가금류 식품의 오염은 전세계적으로 가장 많이 발생하는 식중독의 원인이며, 식중독 사고의 60% 가량을 살모넬라(Salmonella)가 차지하고 있다. 계란의 살모넬라(Salmonella)균 오염은 산란시 난각(계란껍질)에 부착된 뒤, 계란 내부로 이동하는 수평적 이동이 주된 오염 경로로 밝혀져 있다.
최근 계란의 세척 기술이 도입되어 이용되고 있으나, 세척과정 중 계란의 최외부 방어기능인 큐티클(cuticle)층을 파괴하여 비세척란보다 저장성이 떨어진다는 단점이 있다.
본 발명에서는 신규 미생물 패니바실러스 폴리메이샤(Paenibacillus polymyxa) SE-85는 식중독균인 살모넬라(Salmonella)에 높은 길항력을 가지는 것을 이용하여 배양액 추출물을 준비하고 이를 난좌에 코팅 처리되어 있을 경우 살모넬라가 서식하지 못하는 것을 확인하였으며, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 신규 미생물인 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85를 특징으로 이들 배양액 추출물을 이용한 항균 난좌의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식중독균인 살모넬라 (Salmonella)에 길항력을 가지는 신규 미생물인 패니바실러스 폴리메이샤 (Paenibacillus polymyxa) SE-85 (KCTC 11323BP)와, 이의 배양액 추출물을 이용한 항균 난좌의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 계란을 운반하고 장기 저장하기 위한 항균 난좌(卵座) 및 제조방법에 관한 것으로, 식중독균인 살모넬라(Salmonella)에 길항력을 가지는 신규 미생물인 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주는 병원성 식중독균인 살모넬라에 높은 길항력을 나타내는 효과가 있다.
본 발명에 따른, 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주의 배양액 추출물을 이용한 항균 난좌는 병원성 식중독균인 살모넬라에 높은 길항력을 나타내는 효과가 있다.
본 발명은 식중독균인 살모넬라(Salmonella)에 높은 길항력을 가지는 패니바실러스 폴리메이샤 (Paenibacillus polymyxa) SE-85 균주이며, 상기 미생물의 배양액 추출물로 항균 난좌를 제조하는 방법을 제공하며, 본 발명에 의한 상기 배양액 추출물은 유기용매 에틸아세테이트(ethylacetate)로 추출하고 농축 보관후 용해한 것이다.
상기 식중독균인 살모넬라(Salmonella)에 높은 길항력을 가지는 패니바실러스 폴리메이샤 (Paenibacillus polymyxa) SE-85 균주는 2008년 5월 8일자로 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국과학기술원 생명공학연구소 내 유전자은행 (Korea Collection for Type Cultures, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)에 기탁번호 KCTC 11323BP로 기탁되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 패니바실러스 폴리메이샤 (Paenibacillus polymyxa) SE-85 균주의 동정
패니바실러스 폴리메이샤 (Paenibacillus polymyxa) SE-85 균주는 본 발명의 연구자들이 항균 미생물 선별과정 실험에서 토양으로부터 분리하였다.
SE-85 균주는 16S rDNA 염기서열 분석방법(16S rDNA sequence method)으로 SE-85 균주의 염색체 DNA를 추출한 후, 정방향 27f primer (5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 및 역방향 1492r primer (5'-TAC CTT GTT ACG ACT T-3') 를 이용하여 PCR 산물을 얻고, Promega사 pGEM-T Easy vector를 사용하여 상기의 PCR 산물을 Biomeer사(한국)의 PCR Purification Kit을 사용하여 정제한 다음 pGEM-T Easy vector에 클로닝하였다. T-vector에 삽입된 DNA의 염기서열의 확인은 pGEM-T Easy vector의 pUC/M13 forward sequencing primer와 reverse sequencing primer를 이용하여 염기서열을 분석하였다. DNA 염기서열의 상동성 검색은 Ribosomal Database(http://rdp.cme.msu.edu/html/analyses.html), NCBI에서 운영하는 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)를 이용하여 확인하였다
SE-85 균주의 16S rDNA(1427bp) 염기서열(서열 3)에 대한 ribosomal database에서의 상동성 검색 결과, 표 1에서와 같이 패니바실러스 폴리메이샤 (Paenibacillus polymyxa)와 96.7%의 유사도를 나타내었기에 패니바실러스 폴리메이샤(Paenibacillus polymyxa)로 동정하고, 패니바실러스 폴리메이샤(Paenibacillus polymyxa) SE-85라 명명하였다.
SE-85 균주의 16S rDNA 염기서열 결정에 의한 동정 자료
SE-85 균주의 16S rDNA의 염기서열 (1427 bp); 서열 3
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGGGTTACTTAGAAGCTTGCTTCTAAGTAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGTCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAATGTCTTATAGAGTAACTGCTATAAGAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGACCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGTGAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGGGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGTAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCC
동정된 균주명 유사도
Paenibacillus polymyxa; EF690401 96.7%
Paenibacillus polymyxa; EF690399 95.3%
Paenibacillus polymyxa; EF690398 95.2%
실시예 2: 패니바실러스 폴리메이샤 (Paenibacillus polymyxa) SE-85 균주 및 일반 병원성 세균의 배양조건
패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주는 Nutrient broth (NB) 배지에 항균물질 생산 유도물질로 0.1% inducer (PGPR사 DS05P)를 첨가하고 35℃∼37℃에서 3일 ~ 4일 동안 진탕 배양시킨 후 미생물 세포의 수가 1㎖당 콜로니 형성단위(colony forming unit; cfu)로서 108개 ~ 109개 포함되어 있는 배양액을 4℃에 보관하거나 동결건조기로 건조하여 분말상태로 보관하면서 사용하였다. 항균물질은 상기 배양액을 0.45㎛ 여과지(filter)로 여과하여 미생물이 없는 무균여액을 유기용매로 추출하여 항균난좌 제조에 이용하였다.
일반 병원성 세균은 Salmonella typhimurium KCCM 11806, S. enteritidis, S. gallinarum, S. pullorum, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa KCCM 11321, Staphylococcus aureus KCTC, Shigella sonnei 등은 TSB (Tryptic soy broth, Merck Co., Germany) 배지, Escherichia coli O157:H7 ATCC 43889, Klebsiella pneumoniae 등은 LB 배지 (pH 6.0~7.0)에서 35℃∼37℃에서 3일 ~ 4일 동안 진탕 배양시킨 후 미생물 수가 108 ~ 109 cfu/㎖ 포함되어 있는 배양액을 4℃에 보관하거나 동결건조기로 건조하여 분말상태로 보관하면서 사용하였다.
실시예 3: 병원성 미생물에 대한 패니바실러스 폴리메이샤 (Paenibacillus polymyxa) SE-85 균주의 항균력 효과
병원성 미생물들에 대한 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주의 항균력 효과를 조사하기 위해 TSB, LB에 agar를 첨가한 고체배지에 Bacillus cereus, Escherichia coli O157:H7 ATCC 43889, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa KCCM 11321, Salmonella typhimurium KCCM 11806, S. enteritidis, S. gallinarum, S. pullorum, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus KCTC 등의 병원성 세균을 도말한 후 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주를 평판배지 표면에 점적한 다음 35℃에서 4일 동안 배양한 다음 억제환 생성 유무나 거리로 항균력을 판단하였다. 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주는 Salmonella typhimurium KCCM 11806, S. enteritidis, S. gallinarum, S. pullorum 및 등 Klebsiella pneumoniae 균주들에 대해서는 높은 길항력을 나타내었나 Bacillus cereus, Escherichia coli O157:H7 ATCC 43889, Pseudomonas aeruginosa KCCM 11321, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus KCTC 등의 균주에 대해서는 비교적 낮은 항균력을 가지고 있었다.
길항미생물 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주에 의한 병원성 세균의 항균력 효과
병원성 세균 억제환 거리 (㎜)
Bacillus cereus Escherichia coli O157:H7 ATCC 43889 Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa KCCM 11321 Salmonella typhimurium KCCM 11806 S. enteritidis S. gallinarum S. pullorum Shigella sonnei Staphylococcus aureus KCTC 2.1 3.7 8.4 1.0 9.3 9.1 9.0 9.0 4.5 4.2
실시예 4: 패니바실러스 폴리메이샤 (Paenibacillus polymyxa) SE-85 배양 추출물의 항균력 조사
패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주의 배양액 추출물은 200ℓ 미생물배양기에 NB 배지 100ℓ를 넣고 살균한 후 종균을 1% 접종하고 37℃에서 4일 동안 진탕 배양시킨 후 여기에 유기용매 에틸아세테이트(ethylacetate)를 50ℓ 넣고 30분간 교반 추출한 후 상층액을 회수하여 회전농축기로 농축하여 약 200g 분말의 배양 추출물을 얻었으며 냉장 보관하면서 사용하였다. 분말 추출물 100g을 살균 증류수 20ℓ에 용해하여 disc paper(9㎜)에 50㎕ ~ 100㎕ 처리하여 병원성 Salmonella enteritidis 균주에 대해 생육억제환의 크기를 조사하였다.
그 결과, 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주 배양액 추출액은 도 1에서와 같이 SE-85 균주 배양 추출물을 100㎕ 처리할 경우 식중독 사고의 주요 원인 균인 병원성 Salmonella enteritidis 균주에 대해 생육억제환의 크기는 9.5 ± 0.5㎜로 높은 항균력을 나타내었으며, 이러한 결과는 실시예 3에서 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주가 항균력을 가지는 것과 동일한 결과로 나타났다.
도 1은 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주 배양액 추출액의 항균력을 보인 사진으로서, A. 대조구(살균 증류수) 50㎕; B, SE-85 배양추출액 50㎕; C, SE-85 배양추출액 100㎕을 나타낸다.
실시예 5: 패니바실러스 폴리메이샤 (Paenibacillus polymyxa) SE-85 배양액 추출물을 이용한 항균 난좌 제조의 항균력 조사
패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주의 배양액 추출물을 이용한 항균난좌 제조는 SE-85 균주 배양 추출물 분말 100g을 살균 증류수 20ℓ에 용해하여 펄프 몰드 난좌 (30구, 29 x 29㎝)에 spray (250~1000㎕/tray) 처리한 후 실온에서 건조하여 항균 난좌를 제조하였다. 상기 제조한 항균 난좌를 가로 x 세로 1㎝되게 절단하여 단편을 만들고 병원성 Salmonella enteritidis 균주가 도말되어 있는 NA 배지상에 올려놓고 Salmonella enteritidis 균주에 대해 생육억제환의 크기를 조사하였다.
그 결과, 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주 배양액 추출액을 tray당 1000㎕ 처리할 경우 식중독 사고의 주요 원인 균인 병원성 Salmonella enteritidis 균주에 대해 생육억제환의 크기는 4.3 ± 0.3㎜로 높은 항균력을 나타내었다.
여기서 도 2는 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주 배양액 추출액을 이용한 항균 난좌의 항균력을 나타내는 사진이며, A. 무처리 난좌 단편 (1 x 1 ㎝); B, SE-85 배양추출액 tray당 250㎕ spray 처리된 단편 (1 x 1 ㎝); C, SE-85 배양추출액 tray당 500㎕ spray 처리된 단편 (1 x 1 ㎝); D, SE-85 배양추출액 tray당 1000㎕ spray 처리된 단편 (1 x 1 ㎝)이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주 배양액 추출액의 항균력을 나타내는 사진이고,
도 2는 패니바실러스 폴리메이샤 SE-85 균주 배양액 추출액을 이용한 항균 난좌의 항균력을 나타내는 사진이다.
<110> HAN SUNG ECO COMPANY LTD <120> Novel Paenibacillus polymyxa SE-85 and Method for Preparing a Antibacterial Substance Coated Egg Trays Using the Culture extracts of Antagonistic Bacteria against Salmonella Species Using the Same <130> KCTC 11323BP <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 2 taccttgtta cgactt 16 <210> 3 <211> 1514 <212> DNA <213> Paenibacillus polymyxa <400> 3 agagtttgat cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc 60 ggggttactt agaagcttgc ttctaagtaa cctagcggcg gacgggtgag taacacgtag 120 gcaacctgcc cacaagacag ggataactac cggaaacggt agctaatacc cgatacatcc 180 ttttcctgca tgggagaagg aggaaaggcg gagcaatctg tcacttgtgg atgggcctgc 240 ggcgcattag ctagttggtg gggtaatggc ctaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg 300 agagggtgat cggtcacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 360 tagggaatct tccgcaatgg gcgaaagcct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 420 ttttcggatc gtaaagctct gttgccaggg aagaatgtct tatagagtaa ctgctataag 480 agtgacggta cctgagaaga aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 540 tagggggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gctctttaag 600 tctggtgttt aatcccgagg ctcaacttcg ggtcgcactg gaaactgggg agcttgagtg 660 cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca 720 ccagtggcga agcgactctc tgggctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc 780 aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgaatgctag gtgttagggg 840 tttcgatacc cttggtgccg aagttaacac attaagcatt ccgcctgggg agtacggtcg 900 caagactgaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcagtggagt atgtggttta 960 attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc cctctgaccg gtctagagat 1020 agacctttcc ttcgggacag aggagacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080 gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat gcttagttgc cagcaggtca 1140 agctgggcac tctaagcaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa 1200 atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtactac aatggccggt acaacgggaa 1260 gcgaagccgc gaggtggagt gaatcctaga aaagccggtc tcagttcgga ttgcaggctg 1320 caactcgcct gcatgaagtc ggaattgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat 1380 acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttacaa cacccgaagt 1440 cggtgaggta accgcaaggg gccagccgcc gaaggtgggg tagatgattg gggtgaagtc 1500 gtaacaaggt agcc 1514

Claims (2)

  1. 식중독균인 살모넬라 (Salmonella)에 길항력을 가지는 신규 미생물인 패니바실러스 폴리메이샤(Paenibacillus polymyxa) SE-85(KCTC 11323BP).
  2. 신규 미생물 패니바실러스 폴리메이샤(Paenibacillus polymyxa) SE-85의 배양액 추출물을 이용한 항균 난좌의 제조방법.
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