CN111394361A - 一株侧孢短芽孢杆菌、其组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株侧孢短芽孢杆菌B8、包含其的组合物及其用途。本发明的侧孢短芽孢杆菌B8对金黄色葡萄球菌等动物病原菌具有较强的抑制作用；可以分泌抗菌肽、可制成抗菌制剂，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都具有良好的防治效果，从而可以替代抗生素在饲料中起到抗菌作用，减少生物饲料领域抗生素的使用；并且本发明的侧孢短芽孢杆菌B8无毒无致病性，对人畜安全、对环境友好，是生物饲料研发的有用资源，具有潜在的应用前景。

Description

一株侧孢短芽孢杆菌、其组合物及其用途

技术领域

本发明涉及生物饲料添加剂领域，具体而言，本发明涉及一种具有抑菌作用的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、包含其的抗菌组合物及它们的用途。

背景技术

抗生素作为20世纪医药界最伟大的发明之一，对各类疾病的防治起到了极为重要的作用。中国作为抗生素生产大国，对抗生素的使用尤为频繁。据估计，我国每年生产的抗生素原料大约为21万吨，其中约有9.7万吨应用于畜牧养殖业。自20世纪50年代发现饲料中的低浓度的抗生素使用不但可以预防疾病，还可以促进畜禽生长以来，各类抗生素就广泛添加于饲料中，由此导致的抗生素的滥用现象也频频发生。滥用抗生素的危害是极其严重的，不仅会造成耐药性细菌的产生，还会造成人体使用抗生素效果下降、破坏肠道微生物、抑制动物幼体骨髓造血能力、环境污染等各类问题。因此，抗生素替代物的研究变得极为迫切和重要。

抗菌肽是指氨基酸数目小于100，生物体内产生的一类具有强抗菌作用的阳离子多肽，多具有广谱抗菌、强碱性和热稳定性等特点。与抗生素相比，抗菌肽可在生物体内进行降解，细菌耐药率低，并且可以刺激先天免疫作用，提高机体对病原微生物的杀伤作用，尤其值得注意的是，其对某些耐药性病原菌也具有较强的杀灭作用，结合近几年的相关研究表明，抗菌肽完全具备替代抗生素的能力。

侧孢短芽孢杆菌是一类兼性厌氧细菌，在自然界分布极其广泛，在寒带、温带、热带均有分布，在土壤、淡水、海水等多种生境中存在。随着对侧孢短芽孢杆菌的深入研究，目前已知侧孢短芽孢杆菌具有抗菌、杀虫、杀线虫、溶磷、降解有机污染物、生产赖氨酸和多种酶类物质等功能。国外的研究主要集中于该菌用于防治临床上已经产生抗药性的革兰氏阳性菌和念珠菌的用途，例如从某些侧孢短芽孢杆菌(例如B.laterosporus 340-19)的发酵液中可获得对肺炎克雷伯氏菌等革兰氏阴性菌与金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌具有抑制作用的抗生素(例如侧孢菌胺)。而目前中国的相关研究主要关注侧孢短芽孢杆菌在杀线虫、杀虫和用作微生物肥料方面的应用以及该菌产生的抑菌物质。

因此，由于现有的抗生素存在的上述缺陷，有必要开发能够高效地产生对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有抗菌作用的抗菌肽的侧孢短芽孢杆菌，从而筛选和培育能够在饲料行业中应用的具有广谱抗菌性的侧孢短芽孢杆菌。

发明内容

为了解决上述技术问题，在第一方面，本发明提供了一株具有抑菌作用的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)B8，保藏编号为CGMCC No.16337。与从天然生境中分离出来的出发菌株相比，本发明所述的菌株对多种动物病原菌都表现出更好的抑制作用。本发明的侧孢短芽孢杆菌B8能够高效生产对革兰氏阳性细菌(如金黄色葡萄球菌、耐药性金黄色葡萄球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、肠球菌、抗万古霉素肠球菌)和革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)以及真菌(如白色念球菌、烟曲霉菌)均具有抑制作用的抗菌肽。

在第二方面，本发明提供了一种抗菌组合物，所述抗菌组合物包含上述的侧孢短芽孢杆菌B8或者由其产生的抗菌肽。所述抗菌组合物可替代生物饲料中使用的抗生素，用以防治革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染。

在第三方面，本发明提供了上述的侧孢短芽孢杆菌B8或抗菌组合物在制备抗菌制剂方面的用途。

本发明的侧孢短芽孢杆菌B8无毒无致病性，能够高效生产对革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌、耐药性金黄色葡萄球菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、肠球菌)和革兰氏阴性菌(大肠杆菌、肺炎杆菌)、真菌(白色念球菌、烟曲霉菌)具有抑制作用的抗菌肽，因此可被制成抗菌制剂替代现有的抗生素添加至微生物饲料中，该抗菌剂对人畜安全、对环境友好，具有潜在的广阔应用前景。

附图说明

图1为不同的侧孢短芽孢杆菌菌株(原始菌株以及突变菌株B8、B1和G3)在LB平板上的抑菌圈实验结果的照片。

图2为侧孢短芽孢杆菌B8的喷干粉与卡那霉素的抑菌圈实验对比结果的照片；其中，左侧图中各数值表示侧孢短芽孢杆菌B8的喷干粉无菌水溶液的浓度(单位：mg/mL)，Kan表示卡那霉素无菌水溶液(浓度为50μg/mL)；右侧图中各数值表示卡那霉素无菌水溶液的浓度(单位：μg/mL)。

图3为侧孢短芽孢杆菌B8的菌落形态照片。

具体实施方式

本发明通过将从土壤中分离出来的侧孢短芽孢杆菌作为出发菌株(也称为“原始菌株”)，然后利用常压室温等离子体(ARTP)诱变方式高通量筛选对指示菌株(如金黄色葡萄球菌ATCC25922)具有明显抑菌作用的侧孢芽孢杆菌突变菌株。对由此筛选获得的菌株的16S rDNA序列进行测序，与NCBI数据库进行比对，进行分子生物学鉴定。同时，根据生理生化特征的鉴定结果，最终将该菌株鉴定并命名为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)B8。该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院)，保藏编号为CGMCC No.16337，保藏日期为2018年8月24日，分类学名称为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)。本发明的侧孢短芽孢杆菌B8对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有很好的抑菌效果。

本发明所使用的术语“革兰氏阳性细菌”(也称为“革兰氏阳性菌”)具有本领域公知的含义，即，由于其细胞壁主要成分为肽聚糖而能够用革兰氏染色染成深蓝色或紫色的细菌。本发明所述的革兰氏阳性细菌可指符合革兰氏阳性细菌分类定义的任何细菌，包括但不限于：分枝杆菌属(Mycobacterium)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、梭菌属(Clostridium)、李斯特氏菌属(Listeria)、链球菌属(Streptococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)等。优选地，所述革兰氏阳性细菌选自：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、耐药性金黄色葡萄球菌(如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌等)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefacien)、肠球菌(Enterococcus)、抗万古霉素肠球菌。

本发明所述的术语“革兰氏阴性细菌”(也称为“革兰氏阴性菌”)具有本领域公知的含义，即，由于其细胞壁主要成分为脂类而能够用革兰氏染色染成红色或粉色的细菌。本发明所述的革兰氏阴性细菌可指符合革兰氏阴性细菌分类定义的任何细菌，包括但不限于：埃希菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门菌属(salmonella)、志贺菌属(Shigella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、包特菌属(Bordetella)等。优选地，所述革兰氏阴性细菌选自：大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎杆菌(Klebsiella Pneumoniae)、伤寒杆菌(Typhoid bacillus)、志贺痢疾杆菌(Shigella shigae)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)等。更优选地，所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌或肺炎杆菌。

在本发明中，除非另有说明，术语“辅料”包括但不限于饲料学上可接受的添加剂、载体、赋形剂、润滑剂、湿润剂、保湿剂、溶剂、分散介质、悬浮剂、缓冲介质、着色剂、甜味剂、调味剂、芳香剂和抗氧化剂，例如但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉等。对于饲料学上可接受的辅料，正如上文所述，本领域技术人员可根据现有技术中的相关记载(例如，《饲料添加剂品种目录(2013)》等)而容易地选择合适的物质。

在一个实施方式中，本发明提供了一株具有抑菌作用的侧孢短芽孢杆菌B8，保藏编号为CGMCC No.16337。所述菌株在LB固体培养基上于30-37℃下培养48小时后，培养物的菌落边缘不光滑，培养3天后菌落边缘呈火山口状。参照《伯杰细菌鉴定手册》，科学出版社，1984年中记载的标准，并经过16S rDNA测序和NCBI比对，将该菌株鉴定为侧孢短芽孢杆菌B8。

本发明所述的侧孢短芽孢杆菌的地理来源并不仅限于实施例中所述的具体来源，就这方面而言，本领域已知可从土壤、食物(如淀粉类食物、牛奶、奶酪)、火山泥流、淡水和海水、叶表面、昆虫体内、角豆树、堆肥、胶制品工厂废水、兽皮和羊毛等来源分离出侧孢短芽孢杆菌。作为示例，本发明中的作为出发菌株的侧孢短芽孢杆菌从土壤中分离得到，但其来源不应仅限于此。另外，侧孢短芽孢杆菌可通过本领域已知的菌种分离和纯化培养方法得到，所述的菌种分离和纯化培养方法可参见例如如下文献中的记载，但不仅限于此：(1)Solid-phase total synthesis of bogorol A:stereocontrolled construction ofthermodynamically unfavored(E)-2-amino-2-butenamide,organic letters,2015；(2)Brevibacillus laterosporus isolated from the digestive tract of honeybees hashigh antimicrobial activity and promotes growth and productivity ofhoneybees’s colonies,Environmental Science and Pollution Research,vol.25,pp.10477-10455,2017；(3)isolation and structural elucidation of brevibacillin,an antimicrobial lipopeptide from brevibacillus laterosporus that combatsdrug-resistant gram-positive bacteria,Applied and environmental microbiology,2016。或者，例如可通过如下方法得到本发明的野生型的侧孢短芽孢杆菌的纯培养物：(1)在无菌环境下，将采集的土壤样品利用无菌水进行稀释，并静置以取出上清液；(2)在无菌环境下，用接种环将所述上清液划线接种至TSA培养基(胰酪胨：15g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物：5g/L，氯化钠：5g/L，琼脂：15g/L，余量的水，pH＝7.3)，然后挑取单菌落，重复划线接种直至获得单菌落；挑取形态和镜检结果可以确定为芽孢杆菌的菌落进行如下的抑菌圈筛选实验，得到期望的野生型侧孢短芽孢杆菌：将TSA培养基平板上生长的单菌落转移到新鲜的TSA培养基，37℃下培养48h，在其上覆盖内含指示菌株的一层软琼脂TSA培养基(含7.5g/L琼脂的TSA培养基)，37℃下过夜培养，挑取具有明显抑菌圈的菌株，将该侧孢短芽孢杆菌菌株作为出发菌株。

在得到作为出发菌株的侧孢短芽孢杆菌的纯培养物后，可采用本领域已知的突变方法诱导上述的侧孢短芽孢杆菌发生突变，然后挑取单菌落的突变株，由此筛选得到对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出良好的抑菌效果的突变菌株。例如，可采用如下方法获得侧孢短芽孢杆菌的突变菌株：

1)挑取出发菌株的单菌落并接种入新鲜LB液体培养基中，37℃培养24h，转接到新鲜的LB液体培养基中，培养至菌液的O_D600为2-3；

2)使用无菌水将上述菌液稀释至OD₆₀₀为1，吸取10μL稀释后的菌液并均匀涂布于载片上，采用常压室温等离子体(ARTP)诱变育种仪进行诱变，将上述载片置于处理源下，诱导处理60s-100s、优选80s(优选相应的处理参数可设置为气流量8-12SLM，功率80-120W，距处理源距离2-3mm)；

3)将诱变处理过的菌液震荡5min，稀释后取50μL涂布于新鲜的LB平板上，然后在该平板上铺一层含有金黄色葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌ATCC26001)的LB固体培养基，过夜培养，根据抑菌圈大小，筛选并采用单克隆挑取机器人挑取抑菌圈相对最大的菌株；

4)将上述的抑菌圈相对最大的菌株按照上述步骤1)-步骤3)再次诱变，从而获得本发明的侧孢短芽孢杆菌B8(保藏号为CGMCC No.16337)。

在另一个实施方式中，本发明提供了一种抗菌组合物，所述抗菌组合物包含上述的侧孢短芽孢杆菌B8或由其产生的抗菌肽。该抗菌组合物可用于替代生物饲料中使用的抗生素，用以防治革兰氏阴性菌和/或革兰氏阳性菌感染。优选，所述抗菌肽为从侧孢短芽孢杆菌B8的发酵液中经常规的蛋白分离纯化而获得的多肽；另外优选，所述侧孢短芽孢杆菌B8的发酵液为将所述侧孢短芽孢杆菌B8采用如下培养基发酵40h-64h的发酵液：葡萄糖15g/L；酵母浸粉15g/L；牛肉膏5g/L；NaCl 5g/L；MgSO₄ 0.1g/L；以及余量的水。进一步优选，所述抗菌肽的分子量为1.5-1.6kDa。常规的蛋白质的分离纯化是本领域熟知的常规操作，例如，相关的方法可见于如下中的记载：《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔等著，科学出版社，2002年；《蛋白质与蛋白质组学实验指南》，理查德J.辛普森，化学工业出版社，2006年等。

在优选的实施方式中，上述的抗菌组合物进一步包含饲料学上可接受的辅料或饲料学上可用的益生菌，所述益生菌例如地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌或干酪乳杆菌，但不仅限于此。

作为示例，制备上述的抗菌组合物的方法包括如下步骤：

1)将本发明的侧孢短芽孢杆菌B8接种在侧孢短芽孢杆菌培养基中，在28-37℃、优选37℃，150-250rpm、优选200rpm下连续培养至少12小时、优选36小时，获取发酵液；

2)将所述侧孢短芽孢杆菌B8的发酵培养物在100℃下煮沸至少15min；随后进行喷雾干燥(示例的喷雾干燥条件包括：入口温度为120℃-180℃，出口温度为50℃-60℃，泵速度为0.3L/h)得到喷干粉剂；或者可从所述发酵培养物中通过常规的蛋白分离纯化而获得抗菌肽；将所述喷干粉剂或者所述抗菌肽与任选的饲料学上可接受的辅料或饲料学上可用的益生菌进行混合，得到所述抗菌组合物。

但是，制备本发明上述的抗菌组合物的方法并不仅限于此，其它常规的方法也包含在本发明的范围之内。

通常而言，将所得到的侧孢短芽孢杆菌B8通过选自如下的一种或多种方法进行保藏：甘油管冷冻保藏、斜面保藏、石蜡油封藏、沙土管保藏等。对于保藏的侧孢短芽孢杆菌B8，在使用时，通常先对保藏的侧孢短芽孢杆菌B8进行活化，例如将侧孢短芽孢杆菌B8的菌种接种至新鲜的LB培养基中，在37℃、200rpm下培养12-24h，然后再将得到的培养液以一定的比例(例如1v/v％)接种至新鲜的侧孢短芽孢杆菌培养基中。所述侧孢短芽孢杆菌培养基是指适合用于侧孢短芽孢杆菌培养的任何培养基，例如包含碳源、氮源、无机盐的可商购或者根据本领域常规知识配制的任何液体培养基，例如，所述侧孢短芽孢杆菌培养基可为具有如下组成的液体培养基：碳源为葡萄糖5-15g/L或者甘油5-15g/L；氮源为酵母浸粉15-35g/L；NaCl 5-10g/L；MgSO₄ 0.1-0.5g/L；以及余量的水。

应当指出的是，对侧孢短芽孢杆菌的发酵培养的方法是本领域技术人员熟知，其可根据实际需要对上述参数进行优化和调整，这些优化和调和调整也在本发明的范围内。

在优选的实施方式中，所述抗菌组合物处于喷干粉剂的形式。

在一个实施方式中，本发明提供了上述的侧孢短芽孢杆菌B8或抗菌组合物在制备抗菌制剂、优选抗革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的制剂方面的用途。例如，可将侧孢短芽孢杆菌B8制成各种抗菌制剂用于防治革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌感染。

实施例

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特别说明，全部试剂、耗材和仪器均为市售的。

实施例中所用的培养基：

1.LB固体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂17g/L，余量的水，pH 6.8-7.2；

2.LB液体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，余量的水，pH 6.8-7.2；

3.TSA培养基：胰酪胨15g/L；大豆木瓜蛋白酶水解物5g/L；氯化钠5g/L；琼脂15g/L；余量的水；pH 7.3；

4.软琼脂TSA培养基：含0.75％(w/v)琼脂的TSA培养基；

5.侧孢短芽孢杆菌B8的发酵培养基：葡萄糖15g/L，酵母浸粉15g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，MgSO₄ 0.1g/L，余量的水。

6.侧孢短芽孢杆菌培养基：葡萄糖10g/L，氮源为酵母浸粉20g/L；NaCl 10g/L；MgSO₄ 0.1g/L，余量的水。

实施例1：侧孢短芽孢杆菌的出发菌株的分离和筛选

根据文献“Isolation and structural elucidation of brevibacillin,anantimicrobial lipopeptide from Brevibacillus laterosporus that combats drug-resistant gram-positive bacteria”,Applied and environmental microbiology(2016)的记载，从新疆福海县土壤中分离并筛选出一株对金黄色葡萄球菌ATCC26001具有较好抑制作用的野生型的侧孢短芽孢杆菌(原始菌株)。

对获得的菌株进行16S rDNA鉴定和生理生化特征鉴定(参照《伯杰细菌鉴定手册》，科学出版社，1984年中记载的标准进行鉴定)，确定其为侧孢短芽孢杆菌，将其作为出发菌株进行后续实验。

实施例2：野生型的侧孢短芽孢杆菌的诱变和突变株筛选

利用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对实施例1中得到的野生型的侧孢短芽孢杆进行诱变，再通过高通量筛选从而得到对金黄色葡萄球菌ATCC26001具有明显抑制作用的侧孢短芽孢杆菌B8。具体步骤如下：

1)挑取出发菌株的单菌落并接种入新鲜LB液体培养基中，37℃培养24h，转接到新鲜的LB液体培养基中，培养至菌液的OD₆₀₀为2-3；

2)使用无菌水将上述菌液稀释至OD₆₀₀为1，吸取10μL稀释后的菌液并均匀涂布于载片上，采用常压室温等离子体(ARTP)诱变育种仪进行诱变，将上述载片置于处理源下，诱导处理80s，相应的处理参数设置为气流量8-12SLM，功率80-120W，距处理源距离2-3mm；

3)将诱变处理过的菌液在200rpm的转速下震荡5min，稀释后取50μL涂布于新鲜的LB平板上，待诱变菌株生长后，采用单克隆挑取机器人挑取单菌落接种含LB培养基的96孔深孔板，培养24h后，对生长菌株进行保藏，并采用单克隆挑取机器人接种至LB固体平板，培养24h后，在该平板上铺一层含有金黄色葡萄球菌ATCC26001的LB固态培养基，过夜培养，根据抑菌圈大小，筛选具有相对最好的抑菌活性的菌株(抑菌圈相对最大)；

4)将上述的抑菌圈相对最大的菌株按照上述步骤1)-3)再次诱变，筛选获得三株能高产抑菌物质的侧孢短芽孢杆菌，将其分别命名为侧孢短芽孢杆菌B8、B1和G3(也称为突变株B8、B1和G3)。

采用牛津杯法检测原始菌株(即出发菌株)和诱变后的突变菌株(侧孢短芽孢杆菌B8、B1和G3)发酵液上清的抑菌活性。将原始菌株、B8、B1和G3三株突变菌在30℃下于上述的侧孢短芽孢杆菌培养基中培养40h后，室温下以12000rpm离心2min，获得各菌株的发酵液的上清，分别取100μL各上清加入处于接种有1×10⁵CFU/mL的指示菌金黄色葡萄球菌ATCC26001的LB平板上的平均分布的牛津杯中，静置10min，使用无菌镊子将牛津杯取出，在将平板37℃下培养约17h后，测量抑菌圈直径。

结果如图1所示，原始菌株的抑菌圈直径为1.57cm，突变株B8的抑菌圈直径为2.00cm，突变株G3的抑菌圈直径为0.88cm，突变株B1的抑菌圈直径为1.91cm。可见，ARTP诱变获得的突变株既有正突变，也有负突变，选择抑菌效果相对而言最好的突变株B8进行保藏，保藏编号为CGMCC No.16337。

实施例3：侧孢短芽孢杆菌B8的培养和抗菌活性测定

3-1侧孢短芽孢杆菌B8的培养物的喷干粉及其抗菌活性

采用以下步骤将实施例2获得的侧孢短芽孢杆菌B8的培养物制备成喷干粉：

1)将侧孢短芽孢杆菌B8的菌种以0.2v/v％的接种量转接入新鲜LB培养基中，37℃培养过夜，然后将得到的培养液以1v/v％接入上述的侧孢短芽孢杆菌培养基中，37℃下以200rpm转速培养三天，获取发酵液；取出1mL发酵液在常温下离心(8000rpm，10min)得到发酵液上清

2)将剩余的发酵液在100℃的温度下煮沸15min，喷雾干燥得到喷干粉(设置喷雾干燥的条件：入口温度为120-180℃，出口温度为40-60℃，泵速度：0.3L/h)。

采用牛津杯法测定上述步骤(1)中收集得到的发酵液上清对乳杆菌和芽孢杆菌的抑制效果，并选用5ppm红霉素作为对照试剂进行对比，采用含有下述各测试菌株的LB固体培养基平板，向不同的牛津杯中分别加入100μL所述上清和100μL 5ppm红霉素并静置5min，使用无菌镊子将牛津杯取出，将平板在37℃下培养17h后测定抑菌圈直径，抑菌圈结果见下表1。

可见，实施例2中得到的侧孢短芽孢杆菌B8发酵可产生对多种乳杆菌和芽孢杆菌具有抑制效果的抑菌物质，尤其是针对解淀粉芽孢杆菌，侧孢短芽孢杆菌B8的发酵液上清具有与5ppm红霉素基本相当的抑菌效果。

表1发酵液上清与5ppm红霉素的抑菌效果对比情况

采用牛津杯法，采用无菌水对500mg/mL的喷干粉无菌水溶液和250μg/mL的卡那霉素无菌水溶液进行梯度稀释，将稀释后的各样品、无菌水(阴性对照)以及中农颖泰公司的颖泰二号抗菌肽产品(对照)各取100μL加入放置在含指示菌的LB平板上的牛津杯中，静置10min后用无菌镊子将牛津杯取出，将该LB平板在37℃下培养24h后，测定抑菌圈直径，根据各样品对金黄色葡萄球菌ATCC26001的抑菌圈大小来对比上述得到的喷干粉与卡那霉素的抑菌性能。结果如图2所示，抑菌圈直径随着喷干粉浓度的升高逐级增大。同时，将相近直径对应的喷干粉与卡那霉素的浓度总结在下表2中。

表2：相近抑菌圈直径对应的喷干粉与卡那霉素的浓度

可见，100mg/mL喷干粉对金黄色葡萄球菌的抑菌活性与约23μg/mL卡那霉素的抑菌性能相当。通过BCA蛋白定量试剂盒对上述得到的喷干粉中的抗菌肽的含量进行测定，其中的抗菌肽的含量为2.12wt％。

另外，根据上文的抑菌圈实验结果，将上述得到的本发明的喷干粉产品与中农颖泰公司市售的抗菌肽产品(颖泰二号，即，“对照”)进行对比。其中，市售产品(颖泰二号)的抗菌肽浓度为0.3wt％，该产品对大肠杆菌ATCC25922的最小抑菌浓度为0.15mg/mL；而本发明上述得到的喷干粉中的抗菌肽含量为2.12wt％，该喷干粉对大肠杆菌ATCC25922的最小抑菌浓度为0.053mg/mL，对金黄色葡萄球菌ATCC26001的最小抑菌浓度为0.021mg/mL。

此外，经过耐高温试验发现，本发明上述得到的喷干粉可以耐受121℃、30min的高温处理，其抑菌活性不会受到影响；并且直至在160℃下处理3h后，抑菌活性才会发生较严重的损失。可见，所述喷干粉可耐受较高的温度，性能很稳定。

3-2纯化的抗菌肽及其抗菌活性

应用高效液相色谱法(选用SB-C18色谱柱，4.6×150mm，5μm，Agilent 1100；流动相：A相为含0.1％TFA的超纯水，B相为80％乙腈含0.09％TFA；洗脱梯度0min:A 75％，B25％；10min：A 54％，B 46％；12min：A 75％，B 25％，并维持10min；流速0.8ml/min；进样量5μL)纯化该抗菌肽产品，并通过质谱联用检测到该抗菌肽为分子量1.5-1.6kDa的五种同系物。

采用抗生素最小抑菌浓度(MIC)的测定方法对纯化样品的MIC进行测定，具体步骤如下：将用无菌水溶解纯化样品得到的母液(浓度256μg/mL)进行不同倍数的梯度稀释，得到256μg/mL、128μg/mL、60μg/mL、32μg/mL、12.8μg/mL、6μg/mL、3μg/mL、1μg/mL共8个浓度的待测样品；应用牛津杯法测定抑菌效果，吸取100μL的各待测样品加入置于致病菌的活菌数为约10⁵CFU/mL的LB平板上的牛津杯中，静置10min后用无菌镊子将牛津杯取出，将该LB平板在37℃培养16h，分别观察抑菌圈大小。以出现抑菌圈的最小浓度为该纯化样品的MIC值。结果如表3所示，纯化样品对金黄色葡萄球菌、耐药金黄色葡萄球菌、肠球菌的最小抑菌浓度分别为6.0μg/mL、6.0μg/mL和12.8μg/mL。

表3纯化样品对致病菌的MIC值

由此可见，本发明实施例3制备的侧孢短芽孢杆菌B8的喷干粉可作为抗菌产品使用，具有比起目前的市售产品更高的抗菌肽含量，而且性能稳定，同时，本发明的喷干粉发挥出了与比市场上可商购的产品更好的抑菌效果，并且该喷干粉及由其纯化得到的抗菌肽能同时对埃希菌属(大肠杆菌)和葡萄球菌属(金黄色葡萄球菌、耐药金黄色葡萄球菌)、肠球菌属、乳杆菌属(干酪乳杆菌、植物乳杆菌)以及芽孢杆菌属(凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌)的致病菌表现出良好的抑菌作用。

因此，本发明的侧孢短芽孢杆菌B8或由其产生的抗菌肽可作为抗菌剂来替代抗生素在生物饲料中使用，用以防治革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染，具有良好的商业应用前景。

实施例4：侧孢短芽孢杆菌B8的抑菌活性的变化

采用单因素实验和响应面设计优化得到优选的侧孢短芽孢杆菌B8的发酵培养基配方：葡萄糖：15g/L；酵母浸粉：15g/L；牛肉膏：5g/L；NaCl：5g/L；MgSO₄：0.1g/L；余量的水。应用该配方的培养基对发酵过程中的抑菌物质生成情况进行监控。收集发酵16h、22h、40h、46h、64h和88h时的发酵液并在常温下离心(8000rpm，10min)得到上清，取100μL各上清样品，采用牛津杯法研究发酵产物的抑菌活性，指示菌为金黄色葡萄糖球菌ATCC26001，采用含有金黄色葡萄糖球菌ATCC26001的LB平板进行实验，在37℃下培养17h后，测定抑菌圈直径。抑菌圈的测定结果如表4所示。

表4侧孢短芽孢杆菌B8的抑菌活性随发酵时间变化的情况

结果显示，侧孢短芽孢杆菌B8代谢生成的抑菌活性物质的最佳发酵生产时间段为40h-64h，之后该抑菌活性物质的量会降低。

Claims (10)

1.一株具有抑菌作用的侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)B8，保藏编号为CGMCC No.16337。

2.一种抗菌组合物，所述抗菌组合物包含权利要求1所述的侧孢短芽孢杆菌B8或由其产生的抗菌肽。

3.如权利要求2所述的抗菌组合物，其中，所述抗菌肽为从所述侧孢短芽孢杆菌B8的发酵液中经蛋白分离纯化而获得的多肽。

4.如权利要求2或3所述的抗菌组合物，其中，所述侧孢短芽孢杆菌B8的发酵液为将所述侧孢短芽孢杆菌B8采用如下培养基发酵40h-64h的发酵液：葡萄糖15g/L；酵母浸粉15g/L；牛肉膏5g/L；NaCl 5g/L；MgSO₄ 0.1g/L；以及余量的水。

5.如权利要求2-4中任一项所述的抗菌组合物，其中，所述抗菌肽的分子量为1.5-1.6kDa。

6.如权利要求2-5中任一项所述的抗菌组合物，其中，所述抗菌组合物进一步包含饲料学上可接受的辅料或饲料学上可用的益生菌；优选地，所述益生菌选自地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌或干酪乳杆菌；

优选地，所述抗菌组合物处于喷干粉剂的形式。

7.权利要求1所述的侧孢短芽孢杆菌B8或权利要求2-6中任一项所述的抗菌组合物在制备抗菌制剂方面的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其中，所述抗菌制剂为抗革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的制剂。

9.如权利要求8所述的用途，其中，所述革兰氏阳性细菌选自分枝杆菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、梭菌属、李斯特氏菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、棒杆菌属和乳菌杆属；优选地，所述革兰氏阳性细菌选自金黄色葡萄球菌(例如耐药性金黄色葡萄球菌，如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌)、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、肠球菌(例如抗万古霉素肠球菌)。

10.如权利要求8或9所述的用途，其中，所述革兰氏阴性细菌选自埃希菌属、克雷伯氏菌属、沙门菌属、志贺菌属、假单胞菌属和包特菌属；优选地，所述革兰氏阴性细菌选自大肠杆菌、肺炎杆菌、伤寒杆菌、志贺痢疾杆菌、绿脓杆菌和百日咳杆菌；更优选地，所述革兰氏阴性细菌为大肠杆菌。

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