CN112625974A - 侧孢短芽孢杆菌bl11、其发酵液及制备方法和应用 - Google Patents

侧孢短芽孢杆菌bl11、其发酵液及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及微生物的技术领域，具体公开了一种侧孢短芽孢杆菌BL11、其发酵液及制备方法和应用，本申请中提供了保藏编号为CGMCC No.21217的侧孢短芽孢杆菌BL11菌株，其具有优异的耐热、耐酸以及耐盐胆能力，还对ETEC和SA具有优良的拮抗抑制作用，抑菌率达99%以上；本申请还公开了采用上述侧孢短芽孢杆菌BL11发酵得到的发酵液，该发酵液在高温、强酸性条件下抑菌活性高，且发酵液中的抑菌物质不会被蛋白酶水解；本申请还公开了该发酵液的制备方法，以及侧孢短芽孢杆菌BL11和发酵液在生物试剂中的应用。

Description

侧孢短芽孢杆菌BL11、其发酵液及制备方法和应用
技术领域
本申请涉及饲用微生物的技术领域，更具体地说，它涉及一种侧孢短芽孢杆菌BL11、其发酵液及制备方法和应用。
背景技术
产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxic Escherichia coli，ETEC)是一种能够引起仔猪腹泻的最常见的致病性大肠埃希菌。据统计，美国等国家新生仔猪腹泻中，由ETEC引起的占45％以上；在我国，仔猪腹泻全年平均发病率为48.79％，大约有35％的仔猪腹泻是因感染ETEC引起的，死亡率在10％以上。当出现混合感染或继发感染的仔猪，病死率可高达60％以上，给养殖业带来极大的经济损失。
ETEC的毒力因子主要包括黏附素和肠毒素，当病原菌感染宿主后，ETEC通过宿主特异性菌毛和小肠粘膜上皮细胞上的特异性受体结合定居在肠道，而不易被肠道蠕动和肠内容物的流动排出，从而在肠道内大量繁殖，产生肠毒素。肠毒素可导致小肠粘膜细胞分泌功能增强和吸收功能下降，使肠内大量水分和电解质失衡，造成细胞吸收障碍，从而引起仔猪腹泻。
由产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻是仔猪腹泻中最常见的且也是危害最大的。该病流行广，无季节性，全年可发病，夏季尤为严重，具有高发病率和高死亡率的特点，即使仔猪病愈也会生长缓慢，饲料利用率低，经济损失严重。由于抗生素治疗具有见效快，疗程短的特点，对ETEC引起的腹泻，国内外长期采用抗生素治疗的方法。
但长期滥用此类抗菌药物，造成耐药菌株越来越多，导致抗生素治疗效果不理想，随之而来的便是不断加大药物剂量，这样恶性循环造成致病菌株耐药性越来越强，对猪的危害性也越来越大，负面影响日益突显。因此筛选出高效、稳定、安全，且对ETEC致病菌有显著拮抗作用的菌株对于本领域尤为迫切，且具有十分广阔的应用前景。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本申请的第一个目的在于提供一种侧孢短芽孢杆菌BL11，具有良好的耐热、耐酸性能，具有独特的益生特性，且对于ETEC和SA具有优异的抑制作用。
本申请的第二个目的在于提供一种发酵液，其不仅具有良好的耐热、耐酸性能，而且耐蛋白酶类，有利于在生物饲料中应用。
本申请的第三个目的在于提供一种发酵液的制备方法，其具有制备方法简单，易于实现产业化的优点。
本申请的第四个目的在于提供一种侧孢短芽孢杆菌BL11、由其发酵得到的发酵液的应用，其具有侧孢短芽孢杆菌BL11和/或发酵液应用于生物饲料中，具有优异的稳定性，耐热、耐酸且耐蛋白酶类，其发酵产生的细菌素还对于ETEC和SA具有优异的抑制作用，代替抗生素应用于生物制剂中，特别是应用于预防仔猪感染肠毒素性大肠杆菌方面。
本申请的第五个目的在于提供一种生物制剂，其具有优异的稳定性，耐热、耐酸且耐蛋白酶类，不会被蛋白酶类水解，对于ETEC和SA具有优异的抑制作用。
为实现上述第一个目的，本申请提供了如下技术方案：
一种侧孢短芽孢杆菌BL11，所述菌株为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)，命名为侧孢短芽孢杆菌BL11，保藏编号为CGMCC No.21217。
进一步地，所述侧孢短芽孢杆菌BL11菌落表面粗糙，边缘呈不规则形态，形成皱醭的芽孢杆菌，革兰氏染色后菌株呈短杆状，有芽孢，芽孢侧生，椭圆形，孢囊膨大。
进一步地，所述侧孢短芽孢杆菌BL11发酵后的上清液对致病菌产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxic Escherichia coli，ETEC)和/或金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)抑菌率≥99％。
进一步地，所述侧孢短芽孢杆菌BL11具有耐酸性，在pH3.0的条件下能够生长。
进一步地，所述侧孢短芽孢杆菌BL11具有耐胆盐能力，在0.3％胆盐条件下能够生长；进一步地，所述侧孢短芽孢杆菌BL11具有耐热性，在85℃温度条件下存活率≥96％，100℃温度条件下能够存活。
进一步地，所述侧孢短芽孢杆菌BL11耐受人工胃肠液，经人工胃肠液处理4h后，存活率≥95％。
通过采用上述技术方案，本申请中的侧孢短芽孢杆菌BL11经过纯化并在酸碱以及金黄色葡萄球菌SA和产肠毒素性大肠杆菌ETEC环境下筛选得到，更加耐受酸性环境，而且对SA和ETEC具有拮抗抑制作用，应用于生物饲料时，耐酸性环境，且代替抗生素起到对SA和ETEC的抑制作用，且由于其自健康仔猪肠道内容物及粪便中分离筛选得到，来源安全，而且更加适合动物肠道特点，更加有利于饲料的制备和应用。
为实现上述第二个目的，本申请提供了如下技术方案：
一种发酵液，由所述侧孢短芽孢杆菌BL11发酵得到。
进一步地，所述发酵液具有热稳定性，在65℃时，发酵液的抑菌活性≥85％，85℃以上，发酵液的抑菌活性≥80％。
进一步地，所述发酵液具有pH稳定性，在pH3-pH8环境下，发酵液的抑菌活性≥92％；进一步地，所述发酵液经蛋白酶处理，发酵液仍然能够抑菌。
进一步地，所述蛋白酶选用胃蛋白酶。
进一步地，所述发酵液经胃蛋白酶处理后，发酵液对于产肠毒素性大肠杆菌的抑菌率≥99％。
进一步地，所述发酵液经胃蛋白酶处理后，发酵液对于金黄色葡萄球菌的抑菌率≥99％。
进一步地，所述蛋白酶选用胰蛋白酶。
进一步地，所述发酵液经胰蛋白酶处理后，发酵液对于产肠毒素性大肠杆菌的抑菌率≥99％。
进一步地，所述发酵液经胰蛋白酶处理后，发酵液对于金黄色葡萄球菌的抑菌率≥85％。
进一步地，所述蛋白酶选用木瓜蛋白酶。
进一步地，所述发酵液经木瓜蛋白酶处理后，发酵液对于金黄色葡萄球菌的抑菌率≥99％。
进一步地，所述蛋白酶选用蛋白酶K。
进一步地，所述发酵液经蛋白酶K处理后，发酵液对于产肠毒素性大肠杆菌的抑菌率≥99％。
为实现上述第三个目的，本申请提供了如下技术方案：
一种发酵液的制备方法，所述发酵液由侧孢短芽孢杆菌BL11通过下述步骤培养发酵得到：
(1)侧孢短芽孢杆菌BL11种子液制备：将侧孢短芽孢杆菌BL11菌种接种于LB固体培养基中，25-40℃静置培养18-24h，挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，25-40℃振荡培养24-32h；
(2)侧孢短芽孢杆菌BL11发酵液制备：将活化的种子液，按体积百分比为0.5-10％接种于LB液体培养基，振荡培养36-52h后，8000-12000rpm/min离心1-5min，取上清液，用0.22μm滤器过滤，即得。
进一步地，所述发酵液由侧孢短芽孢杆菌BL11通过下述步骤培养发酵得到：
(1)侧孢短芽孢杆菌BL11种子液制备：将侧孢短芽孢杆菌BL11菌种接种于LB固体培养基中，37℃静置培养18-24h，挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养24-32h；
(2)侧孢短芽孢杆菌BL11发酵液制备：将活化的种子液，按体积百分比为2％接种于LB液体培养基，振荡培养48h后，10000rpm/min离心2min，取上清液，用0.22μm滤器过滤，即得。
通过采用上述技术方案，本申请中对由侧孢短芽孢杆菌BL11发酵得到的发酵液离心后的上清液，经过高温、强酸性以及蛋白酶处理后的抑菌性进行探究，由探究结果可知，上清液经过上述环境处理后，还具有一定的抑菌性能，说明得到的上清液性能稳定，上清液中可能存在发挥抑菌作用的细胞素，且上清液中含有的抑菌物质耐高温、耐强酸以及耐蛋白酶，更具体的说，pH、温度和蛋白酶类对上清液中的抑菌物质的活性影响不大，在pH3-8的范围以及温度85℃以下，其活性基本可以完全保留，经过胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，抑菌率也达85％以上，更加有利于其应用于生物饲料中。自然地，抑菌物质存在于发酵液离心后得到的上清液中，自然也存在于活化的种子液接种于LB液体培养基培养发酵后得到的原始发酵液，因此，本申请中由侧孢短芽孢杆菌BL11发酵得到的发酵液可以是指种子液接种于LB液体培养基培养发酵后得到的原始发酵液，也可以是原始发酵液离心后得到的上清液。
为实现上述第四个目的，本申请提供了如下技术方案：
一种生物制剂，包括侧孢短芽孢杆菌BL11，和/或其发酵液，和/或通过发酵液的制备方法制得的发酵液。
为实现上述第五个目的，本申请提供了如下技术方案：
一种侧孢短芽孢杆菌BL11、其发酵液、通过发酵液的制备方法制得的发酵液在生物制剂中的应用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请中得到的侧孢短芽孢杆菌BL11具有优异的耐热、耐酸性能，在高温和强酸条件下，存活率达95％以上，还对ETEC和SA具有很好的抑制作用，抑菌率达99％以上，作为抗生素替代物应用于生物制剂，尤其是生物饲料中具有极大的意义，尤其是预防仔猪感染产肠毒素性大肠杆菌方面的作用极强，具有很高的经济意义；
2、本申请中得到的侧孢短芽孢杆菌BL11自健康仔猪肠道内容物及粪便中分离筛选得到，来源安全，而且更加适合动物肠道特点，具有独特的益生特性和安全性；
3、本申请中通过侧孢短芽孢杆菌BL11发酵得到的含有细菌素的发酵液性质稳定，pH、温度和蛋白酶类对其活性影响不大，在pH3-8的范围以及温度85℃以下，其活性基本可以完全保留，更有利于生物饲料中的应用。
附图说明
图1是本申请中侧孢短芽孢杆菌BL11的菌落观察图，其中(a)是侧孢短芽孢杆菌BL11菌落形态图，(b)是侧孢短芽孢杆菌BL11革兰氏染色后观察图；
图2是本申请中侧孢短芽孢杆菌BL11系统发育树；
图3是本申请中侧孢短芽孢杆菌BL11菌株生长曲线；
图4是本申请中侧孢短芽孢杆菌BL11不同的培养时间下在模拟胃肠液中的存活率；
图5是本申请中侧孢短芽孢杆菌BL11对于产肠毒素性大肠杆菌的抑菌圈试验结果观察图；
图6是本申请中侧孢短芽孢杆菌BL11对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈试验结果观察图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本申请作进一步详细说明，予以特别说明的是：以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，以下实施例中所用原料除特殊说明外均可来源于普通市售。
针对由产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻，随着抗生素治疗的副作用越来越多，研发对ETEC新的治疗方法和替代物变的极为迫切。益生菌可通过改善宿主肠道微生物菌群平衡，对宿主产生诸多有益效果。首先，益生菌能黏附在动物肠道黏膜上定植并大量生长繁殖，从而干预和降低ETEC对宿主的黏附和侵袭，降低ETEC引起的宿主肠道功能性疾病；其次，益生菌在肠道大量繁殖后，与病原微生物争夺营养物质，并产生相应的细菌素等生物活性物质，来抑制致病菌的生长和繁殖，维持肠道上皮细胞细菌菌群的正常分布，从而提高宿主的健康水平；第三，益生菌能刺激肠道黏膜，产生黏膜免疫应答，增强体液和细胞免疫，提高宿主抵抗ETEC毒力因子侵袭的能力。
基于益生菌具有上述优点，选用益生菌治疗ETEC具有良好的前景，但是在实际应用中，由于现有的益生菌抑菌效果不理想，抗菌性能不稳定，尤其对ETEC等致病菌的抑菌效果不显著，因此无法取代抗生素的作用和地位。筛选高效、稳定、安全，对ETEC致病菌有显著拮抗作用的益生菌治疗ETEC变的极为迫切，且具有广阔的应用前景。
本申请提供了一种侧孢短芽孢杆菌BL11，自健康仔猪肠道内容物及粪便中分离筛选得到，经16S rDNA鉴定该菌株为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，命名为侧孢短芽孢杆菌BL11，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21217，保藏时间为：2020年11月23日。
本申请还提供了由上述保藏编号为CGMCC No.21217的侧孢短芽孢杆菌BL11发酵制得的发酵液，具体通过下述步骤培养发酵得到：
(1)侧孢短芽孢杆菌BL11种子液制备：将侧孢短芽孢杆菌BL11菌种接种于LB固体培养基中，25-40℃(如25℃、28℃、35℃、40℃)静置培养18-24h(如18h、20h、22h、24h)，挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，25-40℃(如25℃、28℃、35℃、40℃)振荡培养24-32h(如24h、28h、30h、32h)；
(2)侧孢短芽孢杆菌BL11发酵液制备：将活化的种子液，按体积百分比为0.5-10％(如0.5％、2％、5％、10％)接种于LB液体培养基，振荡培养36-52h(如36h、42h、48h、52h)后，8000-12000rpm/min(如8000rpm/min、10000rpm/min、12000rpm/min)离心1-5min(如1min、3min、5min)，取上清液，用0.22μm滤器过滤，即得含抑菌物质的发酵液。
以下实施例中涉及到的培养基以及原料来源如下：
LB固体培养基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水定容1000ml，pH6.8-7.2；
LB培养液：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水定容1000ml，pH6.8-7.2；
耐酸LB液体培养基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水定容1000ml,，pH3.0；
耐胆盐LB液体培养基：酵母粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，猪胆盐3g，蒸馏水定容1000ml。
以下实施例中涉及的指示菌产肠毒素性大肠杆菌(型号为ATCC35401)和金黄色葡萄球菌(型号为ATCC29213)来源于普通市售；
以下实施例中涉及的人工胃肠液购于北京雷根生物技术有限公司；
以下实施例中涉及的仔猪肠道内容物及新鲜粪便采于法库康达生态农业有限公司；
以下实施例中所指的菌株活化是指：将菌株由保存管中划线入固体培养基平板，并长出单菌落的过程。
实施例1
侧孢短芽孢杆菌BL11菌株的分离筛选如下：
(1)菌株纯化：取法库康达生态农业有限公司猪场的仔猪肠道内容物及新鲜粪便5g于95mL的LB液体培养基中富集，37℃培养24h。富集液80℃水浴作用20min，静止后，梯度稀释，取100μL均匀涂布于无菌的固体LB平板，37℃培养24h，至长出菌落。按照芽孢杆菌的形态特征挑取单菌落，分离纯化，得到初筛的菌株。
(2)耐酸碱试验
将初筛的菌株按2％的接种量，接种到pH值为3.0的LB液体培养基中，37℃下摇床培养24h，稀释，涂布于无菌LB固体平板，平板于37℃下倒置培养；将经过pH为3.0的LB液体培养基的菌株接种于0.3％胆盐的LB培养基中，37℃下摇床培养24h，稀释，涂布于无菌LB固体培养基，平板于37℃下倒置培养，挑取单菌落转至LB固体培养基划线纯化，纯化菌株于-80℃甘油保存。
(3)拮抗试验
将进一步筛选的菌株的培养液点接法接种于涂有金黄色葡萄球菌(SA)和产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的LB固体培养基上，37℃培养12-18h，观察抑菌效果。
试验获得7株具有抑菌效果的阳性菌株，选取抑菌效果最好的菌株作为目标菌株进行下一步实验。
实施例2
目标菌株的生物学鉴定
生理生化鉴定：目测观察菌落的形状、大小是否符合芽孢杆菌属的基本形态特征。革兰氏染色挑选G+杆菌，后进行芽孢染色，挑取具有内生孢子的菌株；根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对筛选的菌株进行生化试验。
表1 目标菌株的生理生化特征
测定项目 目标菌株 测定项目 BL11
触酶试验 + 精氨酸双水解酶试验 -
甘露醇发酵试验 + 葡萄糖发酵试验 +
V-P试验 + 产气 -
果糖发酵试验 + 淀粉水解 -
硝酸盐还原试验 + 柠檬酸盐利用 -
注：表中“+”表示呈阳性，“－”表示呈阴性。
参见图1，图1(a)中箭头所指菌株即为目标菌株，图1(b)为菌株革兰氏染色结果。从图1(a)和图1(b)中可以看出，筛选菌株菌落表面粗糙，边缘呈不规则形态，形成皱醭的芽孢杆菌，菌株呈短杆状。芽孢染色(未示出)后，菌株有芽孢，芽孢侧生，椭圆形，孢囊膨大。由表1生化试验可知，目标菌株酶促试验、V-P试验、硝酸盐还原试验阳性，可以分解葡萄糖、果糖和甘露醇。
菌种16S rDNA分子生物学鉴定：由哈尔滨睿博兴科生物技术有限公司进行菌种鉴定，用16S rDNA序列扩增测序，序列用GenBank的BLAST进行比对。将测序的结果在美国国家生物信息中心(NCBI)数据库中进行BLAST分析，采用MEGA 5.0软件构建系统发育树。参见图2，结果表明，目标菌株与侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)同源性高达99％。
根据形态学观测和生理生化试验结果，结合16S rDNA序列相似性分析，参比《伯杰氏细菌鉴定手册》鉴定该菌株为一株侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，命名为侧孢短芽孢杆菌BL11。
实施例3
侧孢短芽孢杆菌BL11菌株的益生特性分析
1、菌株生长特性
配置300mL LB液体培养基，高压蒸汽灭菌备用，按菌液2％的接种量接种于培养基中，37℃培养，分别在0、2、4、6、8、10、14、18、24、28h处取样，测OD600值。
结果表明，从生长曲线图3可以看出：0-2h处于短暂的延滞期，后进入对数生长期，之后进入一段较长的稳定期，28h后进入衰亡期。选择18h作为一个发酵周期，既保持菌株的增殖能力，有达到了较高的菌体浓度，缩短菌株发酵周期，节约生产成本。
2、菌株稳定性
(1)热稳定性试验：
取培养18h的菌液分别于75℃、85℃、100℃水浴加热20min，用平板计数法测定活菌数，存活率的测量结果如下表2。
表2 BL11菌株在不同培养温度下的存活率
Figure BDA0002885183070000081
由上表2可以看出，本申请中得到的侧孢短芽胞杆菌BL11在不同温度下处理菌液，分别在75℃、85℃、100℃下处理20min，在85℃时，存活率达96％以上，存活率很高。说明侧孢短芽胞杆菌BL11菌株具有优异的耐热稳定性。
(2)人工胃肠液稳定性试验菌液离心、冲洗获得菌体BL11，将菌体用等体积配置好的人工动物胃液重悬，37℃、80r/min上培养模拟胃液的消化作用，4h后，把人工胃液离心以获取消化处理过后的菌体，随后用等体积的人工动物肠液重悬，按照上述条件培养，肠液中培养5h，每隔1h取样计活菌数。
结果表明，如图4所示，BL11菌株在胃液培养4h后，胃液中活菌数均呈现出缓慢降低的趋势，进入肠液中活菌数出现瞬间降低的现象，但后趋于平稳，存活率达95％。可见，BL11菌株在胃肠道内能够保持较高的菌浓度，对胃肠道的耐受能力很强，可以在肠道内发挥作用。
实施例4
侧孢短芽孢杆菌BL11菌株的抑菌实验
(1)抑菌圈检测
将本申请的侧孢短芽孢杆菌BL11菌株采用牛津杯平板法测定对于产肠毒素性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，分别做4组平行试验，对于产肠毒素性大肠杆菌抑菌圈实验结果如图5所示，对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈实验结果如图6所示，分别计算抑菌圈直径平均值，结果如下表3所示。
表3 BL11对ETEC和SA的抑菌圈直径
Figure BDA0002885183070000091
(2)抑菌率检测
本申请中还通过吸光度来测定发酵上清液的抑菌性，这一方法比传统的测量抑菌圈方法更为直观、准确，且操作鉴定，出结果快，可在细菌实验广泛应用，检测方法如下：
1、侧孢短芽孢杆菌BL11种子液制备：将侧孢短芽孢杆菌BL11菌株接种于LB固体培养基中，37℃静置培养18-24h，挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养24-32h；
2、侧孢短芽孢杆菌BL11发酵液制备：将得到的侧孢短芽孢杆菌BL11种子液按体积百分比2％接种于LB液体培养基中，37℃下摇床培养48h，将细菌培养液10000r/min离心2min，取上清液，用0.22μm滤器过滤，备用，得到发酵上清液。
3、指示菌浓度的调整：取指示菌菌液加入LB液体培养基中(一般情况1mL菌液加到100mL LB液体培养基中)，测定600nm处吸光度，使其吸光度约为OD600＝0.05。
4、抑菌性测定：将细菌的发酵上清液以体积分数为2.5％与10mL的LB液体培养基(已加入指示菌)混合，做3个平行组；同时设立空白对照A空(不加细菌发酵上清液)，37℃摇床200r/min培养12h，利用分光光度计测波长600nm时各样品的OD值，记录读数(用无菌LB培养基调零)。
抑菌率(％)＝[(A空-A空0)-(A样-A样0)/(A空-A空0)]×100％。
根据OD600进行抑菌活性分析，由于发酵上清液有一定的基底颜色，因此将发酵上清液与LB培养基(含指示菌)混合液0h为初始的OD600，即A样0；培养12h后混合液OD600作为指示菌增长值，即A样。空白对照组0h的初始OD600，即A空0；培养12h后混合液OD600作为对照组指示菌增长值，即A空。
表4 BL11发酵上清液抑菌率/％
菌株编号 抑产肠毒素性大肠杆菌率 抑金黄色葡萄球菌率
BL11 99.85±0.14 99.84±0.04
由表3和表4可知，侧孢短芽孢杆菌的上清液对ETEC和SA均表现出很高的抑制作用，综合耐酸、耐胆盐及耐热等试验可知，BL11具备益生菌的潜在应用价值。
实施例5
侧孢短芽孢杆菌BL11的发酵液抑菌稳定性试验
1、热稳定性
将侧孢短芽孢杆菌BL11发酵液制备中制备好的无菌上清液分别置于65℃、85℃、100℃条件下水浴20min，用未经过高温处理的无菌上清液作为空白对照，用ETEC和SA作为指示菌，BL11的发酵上清液以体积分数为2.5％与10mL的LB液体培养基(已加入指示菌)混合，做三个平行组，进行抑菌能力的测定。具体方法参照上述侧孢短芽孢杆菌BL11菌株的抑菌实验中抑菌试验的抑菌率检测。
表5 热处理BL11发酵上清液对抑菌活性的影响/％
Figure BDA0002885183070000101
由上表5可以看出，发酵液的耐热性很好，85℃热处理20min，其抑菌活性基本保留；100℃高温处理后的上清液，对SA的抑菌率没有出现明显变化，意味着上清液中的一些抑菌物质对热不敏感。
2、蛋白酶稳定性
将侧孢短芽孢杆菌BL11发酵液制备中制备好的无菌上清液分别用过氧化氢酶(反应条件25℃、pH7.0)、胃蛋白酶(反应条件37℃、pH3)、胰蛋白酶(反应条件37℃、pH8)、蛋白酶K(反应条件37℃、pH8)、木瓜蛋白酶(反应条件50-60℃、pH6-7)处理2h，酶浓度均为3mg/mL，处理完毕后将无菌上清液调回至最初的pH值，以未加酶并且进行相同处理的无菌上清液作为空白对照组，用上述同种病原菌作为指示菌，BL11无菌上清液以体积分数为2.5％与10mL的LB液体培养基(已加入指示菌)混合，做三个平行组，测定抑菌能力。具体方法上述侧孢短芽孢杆菌BL11菌株的抑菌实验中抑菌试验的抑菌率检测。
表6 蛋白酶处理无菌上清液抑菌活性的影响/％
Figure BDA0002885183070000102
由上表6可以看出，与空白对照组相比，经过胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后，上清液的抑菌活性仍然很高，经过胃蛋白酶处理后，上清液对于ETEC和SA的抑菌率均达到99％以上，经过胰蛋白酶处理后，上清液对于ETEC的抑菌率也达到99％以上。
另外，考虑到若是侧孢短芽孢杆菌BL11发酵过程中产生过氧化氢，也会起到抑菌的作用，还对上清液经过过氧化氢酶处理后的抑菌率进行探究，探究发现，加入过氧化氢酶后，对于ETEC和SA的抑菌率稍有降低，产生的过氧化氢微乎其微，对于抑菌效果基本没有影响，发挥抑菌作用的还是上清液中的抑菌物质，且上清液中可能存在发挥抑菌作用的细胞素。
考虑到木瓜蛋白酶和蛋白酶K属于两种高活性的蛋白溶解酶，有较广泛的特异性，再进行上清液对木瓜蛋白酶和蛋白酶K的稳定性进行探究，由上表可以看出，上清液用木瓜蛋白酶处理后，影响了BL11对ETEC的抑菌作用，抑菌率下降了34.47％，而对SA的抑菌率仍然≥99％；同时，用蛋白酶K处理上清液，也影响了BL11对SA的抑菌作用，抑菌率下降了77.49％，而对ETEC的抑菌率仍然≥99％，上清液对于木瓜蛋白酶和蛋白酶K仍然具有抑菌效果，上清液耐蛋白酶，不会被蛋白酶水解。
3、pH稳定性
用HCl或者NaOH调节无菌上清液到对应pH，37℃恒温水浴3h后再调回初始pH，测试其抑菌活性。
表7 不同pH对无菌上清液抑菌活性的影响/％
Figure BDA0002885183070000111
由上表7可以看出，在pH耐受性上，上清液在pH3-pH8处理后，其抑菌活性基本保留；在pH2和pH9条件下，对抑菌活性有所影响，抑菌率下降30％左右。
综上，可以看出，本申请中得到的侧孢短芽孢杆菌BL11耐热、耐酸、耐盐胆，而且对于ETEC和SA具有很好的抑制作用，抑菌率达99％以上；BL11在85℃温度条件下存活率≥96％，100℃温度条件下存活率≥89％；在0.3％胆盐条件下能够生长，在pH3.0的条件下能够生长，且经人工胃肠液处理4h后，存活率≥95％；由侧孢短芽孢杆菌BL11发酵得到的发酵液性质稳定，pH、温度和蛋白酶类对其活性影响不大，发酵液在85℃高温处理后，抑菌率≥80％，100℃处理后对于SA的抑菌率还达80％以上；pH3-8环境处理后，发酵液的抑菌率≥90％，抑菌活性基本保留，经过胃蛋白酶处理后，抑菌率≥99％，经过胰蛋白酶处理后，对ETEC抑菌率≥90％，对SA抑菌率≥85％，抑菌效果好。
此外，本申请中得到的侧孢短芽孢杆菌BL11自健康仔猪肠道内容物及粪便中分离筛选得到，来源安全，而且更加适合动物肠道特点，具有独特的益生特性和安全性，作为抗生素替代物应用于生物制剂，尤其是生物饲料中具有极大的意义，尤其是预防仔猪感染产肠毒素性大肠杆菌方面的作用极强，具有很高的经济意义。将本申请中得到的侧孢短芽孢杆菌BL11应用于生物制剂(如饲料)的时候，可以是将其制作菌株干粉直接添加于生物制剂中，也可以是将侧孢短芽孢杆菌BL11按照本申请中提供的发酵方法发酵后得到的发酵液加入生物制剂中应用，当然也可以是两者结合应用。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (8)

1.一种侧孢短芽孢杆菌BL11，其特征在于，所述菌株为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，命名为侧孢短芽孢杆菌BL11，保藏编号为CGMCC No.21217。
2.一种发酵液，其特征在于：由权利要求1所述的侧孢短芽孢杆菌BL11发酵得到。
3.如权利要求2所述的一种发酵液的制备方法，其特征在于：所述发酵液由侧孢短芽孢杆菌BL11通过下述步骤培养发酵得到：
（1）侧孢短芽孢杆菌BL11种子液制备：将侧孢短芽孢杆菌BL11菌种接种于LB固体培养基中，25-40℃静置培养18-24 h，挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，25-40℃振荡培养24-32 h；
（2）侧孢短芽孢杆菌BL11发酵液制备：将活化的种子液，按体积百分比为0.5-10 %接种于LB液体培养基，振荡培养36-52h后，8000-12000 rpm/min离心1-5 min，取上清液，用0.22μm滤器过滤，即得。
4.根据权利要求3所述的一种发酵液的制备方法，其特征在于：所述发酵液由侧孢短芽孢杆菌BL11通过下述步骤培养发酵得到：
（1）侧孢短芽孢杆菌BL11种子液制备：将侧孢短芽孢杆菌BL11菌种接种于LB固体培养基中，37℃静置培养18-24 h，挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养24-32 h；
（2）侧孢短芽孢杆菌BL11发酵液制备：将活化的种子液，按体积百分比为2 %接种于LB液体培养基，振荡培养48 h后，10000 rpm/min离心2 min，取上清液，用0.22 μm滤器过滤，即得。
5.一种生物制剂，其特征在于：包括如权利要求1所述的侧孢短芽孢杆菌BL11，和/或如权利要求2所述的一种发酵液。
6.如权利要求1所述的侧孢短芽孢杆菌BL11在生物制剂中的应用。
7.如权利要求2所述的一种发酵液在生物制剂中的应用。
8.如权利要求3或4所述的制备方法所制备的发酵液在生物制剂中的应用。
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Application publication date: 20210409

Assignee: Liaoning Shengwei Biotechnology Co.,Ltd.

Assignor: LIAONING POWER LIGHT AGRICULTURE AND ANIMAL HUSBANDRY INDUSTRIAL CO.,LTD.

Contract record no.: X2023210000135

Denomination of invention: Bacillus subtilis BL11, its fermentation broth, preparation method, and application

Granted publication date: 20211207

License type: Common License

Record date: 20230922