KR101500930B1

KR101500930B1 - 항균활성을 가지는 바실러스 리체니포르미스 균주

Info

Publication number: KR101500930B1
Application number: KR1020100124601A
Authority: KR
Inventors: 박희태
Original assignee: 박희태
Priority date: 2010-12-08
Filing date: 2010-12-08
Publication date: 2015-03-09
Also published as: KR20120063581A

Abstract

본 발명은 항균활성을 가지며 기탁번호가 KCCM-11118P인 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주에 관한 것이다. 본 발명은 항진균활성을 가질 뿐 만 아니라 식물의 발육을 촉진하는데 있어서 우수한 효과를 발휘한다. 또한, 본 발명은 바실러스 균주를 이용하는 항균용 생균제 제약분야에 있어서 기초적인 자료를 제공한다.

Description

항균활성을 가지는 바실러스 리체니포르미스 균주{Bacillus Licheniformis Bacteria Having Anti―Microbial Activities}

본 발명은 항균활성을 가지며 기탁번호가 KCCM-11118P인 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주에 관한 것이다.

바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)는 일반적으로 토양에 존재하는 박테리아이다. 또한, 조류의 깃털(특히 가슴 및 등쪽 깃털0에서 발견되어지며, 특히 가금류에 많이 존재하는 박테리아이다.

바실러스 리케니포미스는 그람 양성균이며 열호기성 박테리아이다. 최적의 성장 온도는 50℃이나, 그 이상의 온도에서도 존재할 수 있다. 생육에 있어서 불리한 환경 조건하에서는 스포어 형태로 존재하다가 유리한 조건이 되면 빠르게 성장한다. 현재, 농업에 이용하기 위하여 바실러스 리케니포미스에 대하여 연구 개발하고 있으며, 비소화성 단백질을 많이 포함하고 있더라도 발효를 통하여 쓰레기 깃털을 값싸고 영양학적으로 우수한 우모분(feather meal)을 생산하여 가축 사료로 이용하가 위하여 개발하고 있다.

또한, Bacillus 속 균주들은 내생 포자를 가지고 있는 Gram 양성 세균으로, 많은 물질들을 세포 외부로 분비하는 것으로 보고되어 있어 각종 효소나 유용 화합물의 산업적 생산을 위한 숙주균으로 활발히 이용되고 있으며, 최근에는 iturin계 물질을 생산하여 항진균 활성을 나타내는 균주도 보고된 바 있다. 항진균 활성 균주의 식물병원성 진균에 대한 작용 기작으로는 진균 외막가수분해 효소를 이용한 용균작용, 항진균성 항생물질에 의한 항생작용(antibiosis), 그리고 siderophore에 의한 경쟁적 길항작용(competitive antagonism) 등이 알려져 있다. 이러한 항진균 활성 기작은 수 많은 유전자들에 의해서 조절되어지며, 최근 항진균 기작과 관련된 물질을 합성하는 유전자들도 일부 보고되고 있다.

따라서, 당업계에서는 항균 뿐 만 아니라 식물의 생육촉진에 있어서 우수한 활성을 가지며, 이러한 항균활성을 가지는 신규한 균주의 개발이 필요한 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 우수한 항균활성을 발휘하는 바실러스 속 신규 균주를 찾기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 다양 유해 균주에 대하여 우수한 항균활성을 가지는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주를 분리함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 항균활성을 가지며 기탁번호가 KCCM-11118P인 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)-PHT 153 균주를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 기탁번호가 KCCM-11118P인 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)-PHT 153 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 기탁번호가 KCCM-11118P인 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)-PHT 153 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 생장 촉진용 조성물을 제공한다.

삭제

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 항균활성을 가지는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 제조 방법을 제공한다:

(a) 인분 50-500 중량부, 동물성 유지 10-150 중량부, 유기농 채소 5-100 중량부, 염분 0.1-20 중량부 및 증류수 10000-30000 중량부를 포함하는 혼합물을 15-60℃ 온도에서 1-12개월 동안 음지에서 산소를 공급하면서 정치시키는 단계; 및

(b) 상기 정치시킨 혼합물로부터 바실러스 리체니포르미스 균주를 동정 및 분리시키는 단계.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 항균활성을 가지며 기탁번호가 KCCM-11118P인 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명은 항진균활성을 가질 뿐 만 아니라 식물의 발육을 촉진하는데 있어서 우수한 효과를 발휘한다.

(ⅲ) 또한, 본 발명은 바실러스 속 균주를 이용하는 항균용 생균제 제약분야에 있어서 기초적인 자료를 제공한다.

도 1은 본 발명인 바실러스 리체니포르미스 균주의 항균활성을 나타낸 결과 이미지이다.
도 2는 본 발명인 바실러스 리체니포르미스 균주의 Phytophothora capsici 균주에 대한 항균활성을 나타낸 결과 이미지이다.
도 3은 본 발명인 바실러스 리체니포르미스 균주의 Colletotrichum coccodes 균주에 대한 항균활성을 나타낸 결과 이미지이다.
도 4는 본 발명인 바실러스 리체니포르미스 균주가 라파누스 사티부스 L.(Raphanus sativus L.)의 생체량(잎폭, 잎길이, 뿌리길이, 생중량 및 줄기 길이)을 향상시킨 결과에 대한 그래프이다. CA는 Bacillus licheniformis-PHT 153 균주를 의미한다.
도 5는 본 발명인 바실러스 리체니포르미스 균주가 브라시카 캄페스트리스(Brassica campestris)의 생체량(잎폭, 잎길이, 뿌리길이, 생중량 및 줄기 길이)을 향상시킨 결과에 대한 그래프이다. CA는 Bacillus licheniformis-PHT 153 균주를 의미한다.
도 6은 본 발명인 바실러스 리체니포르미스 균주를 포함하는 시료를 흙에 분주한 후 라파누스 사티부스 L.을 파종하고 재배시킨 생체량 비교 결과 이미지이다. C는 대조군로서 일반 수도물을 흙에 각각 관주한 후 성장시킨 결과이고, CA는 Bacillus licheniformis-PHT 153 균주를 흙에 각각 관주한 후 성장시킨 결과이며, 비타민을 포함하는 시료를 흙에 관주한 후 성장시킨 결과를 의미한다.
도 7은 본 발명인 바실러스 리체니포르미스 균주를 포함하는 시료를 흙에 분주한 후 브라시카 캄페스트리스를 파종하고 재배시킨 생체량 비교 결과 이미지이다. C는 대조군로서 일반 수도물을 흙에 각각 관주한 후 성장시킨 결과이고, CA는 Bacillus licheniformis-PHT 153 균주를 흙에 각각 관주한 후 성장시킨 결과이며, 비타민을 포함하는 시료를 흙에 관주한 후 성장시킨 결과를 의미한다.
도 8은 본 발명인 바실러스 리체니포르미스 균주를 포함하는 시료를 흙에 분주한 후 라파누스 사티부스 L.를 파종하고 재배시킨 생체량 비교 결과 그래프이다. C는 대조군로서 일반 수도물을 흙에 각각 관주한 후 성장시킨 결과이고, CA는 Bacillus licheniformis-PHT 153 균주를 흙에 각각 관주한 후 성장시킨 결과를 의미한다.
도 9는 본 발명인 바실러스 리체니포르미스 균주를 포함하는 시료를 흙에 분주한 후 브라시카 캄페스트리스를 파종하고 재배시킨 생체량 비교 결과 이미지이다. C는 대조군로서 일반 수도물을 흙에 각각 관주한 후 성장시킨 결과이고, CA는 Bacillus licheniformis-PHT 153 균주를 흙에 각각 관주한 후 성장시킨 결과이며, 비타민을 포함하는 시료를 흙에 관주한 후 성장시킨 결과를 의미한다.
도 10a-10b는 본 발명인 바실러스 리체니포르미스 균주내의 지방산 조성물에 대한 MIDI 데이타베이스 분석결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%“는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 분리된 바실러스 균주의 항균활성 실험

가축의 감염을 유발하는 Staphylococcus aureus(황색포도구균)과 Escherichia coli(대장균)에 대하여 신규 분리된 균주인 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)가 항균활성이 있는지 측정하였다.

본 실시예에서 이용하는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)를 동정 분리하기 위한 배양 배지는 인분 200 g, 동물성 유지 50 g, 유기농 채소 20 g, 염분 5 g 및 증류수 20 L가 혼합된 조성물을 이용하여 제조하였다. 혼합된 배지 조성물을 40 L 플라스틱통에 넣고 30-40℃의 온도 조건하에서 6개월간 숙성시켰다. 인분에 포함된 여러 미생물 중 호기성 미생물이 흡착되어 배양될 수 있도록 6개월의 숙성기간 동안 기포발생기를 이용하여 플라스틱통 안으로 산소를 공급하였으며, 직사광선이 비치지 않도록 플라스틱통을 음지에 고정시켰다.

6개월간 배양시킨 후 배양액으로부터 바실러스 리체니포르미스를 분리 동정하였으며, 미생물 동정을 마친 바실러스 리체니포르미스 균주를 해당 배지에서 24시간 동안 30℃에서 배양을 하였다. 바실러스 리체니포르미스 균주는 원심분리기를 이용하여 상층액만 채취하였다. 상층액 채취 후 모아서 동결건조를 하였다. 동결건조 후 멸균된 물로 적정 농도 희석 후 각각의 병원 균주에 반응시켰다(단 균주 수는 2 x 10⁴ CFU/ml로 일정하게 희석). 30℃온도로 12시간 배양 후 결과 확인하였다.

그 결과, 바실러스 리체니포르미스의 상층액이 항균활성을 나타내었으나, 유황의 경우 100 mg/ml에서도 항균활성이나 곰팡이 활성 등이 잘 안 나타나지 않았다(표 1 내지 표 2, 그리고 도 1 내지 도 3).

균주	Bacillus licheniformis	Bacillus lentimorbus	유황	Kanamycin	Chloramphenicol
E. carotovora sub sp. carotovora	100 mg/ml	100 mg/ml	> 100 mg/ml	3 μg/ml	6 μg/ml
R. Solanacearum	12.5 mg/ml	50 mg/ml	> 100 mg/ml	3 μg/ml	>24 μg/ml
S. aureus	12.5 mg/ml	>100 mg/ml	> 100 mg/ml	>24 μg/ml	0.75 μg/ml
E. coli	>100 mg/ml	>100 mg/ml	> 100 mg/ml	3 μg/ml	3 μg/ml

구분	Bacillus licheniformis	Bacillus lentimorbus	유황	Amphotericin B	Fluconazole
F. oxysporum	400 mg/ml	> 800 mg/ml	> 100 mg/ml	1.5 μg/ml	1.5 μg/ml
C. coccodes	800 mg/ml	800 mg/ml	> 100 mg/ml	3 μg/ml	6 μg/ml
C. acutatum	800 mg/ml	> 800 mg/ml	> 100 mg/ml	< 0.75 μg/ml	< 0.75 μg/ml
P. capsici	800 mg/ml	> 800 mg/ml	100 mg/ml	3 μg/ml	3 μg/ml

본 실시예에 의하여 항균활성이 가장 우수한 바실러스 리체니포르미스 균주를 Bacillus licheniformis-PHT 153이라 명명하고, 미생물기탁기관 한국미생물보존센터에 2010년 10월 22일자로 기탁하고, 기탁번호 KCCM-11118P를 부여받았다.

실시예 2: 식물 발아 촉진 실험

수미A(수미+미네랄5%), 수미B(원액), 미네랄(5%), CA(Bacillus licheniformis-PHT 153), BS그린 및 비타민을 각각 포함하는 시료가 식물의 발아 촉진에 있어서 각각 어떠한 영향을 나타내는지에 대하여 실험을 하였다.

식물발아를 촉진시킬수 있는지를 확인하기 위하여 브라시카 캄페스트리스(Brassica campestris)와 라파누스 사티부스 L.(Raphanus sativus L.)를 이용하였다.

각 시료를 농도(1:500) 별로 희석하여 흙에 관주 후 씨앗을 뿌렸다. 씨앗을 뿌린 뒤 각 식물 별로 씨앗의 발아 정도를 비교하였으며, 대조군은 일반 상수도로 하였다.

그 결과, 라파누스 사티부스 L.에서는 대조군에 비해 Bacillus licheniformis-PHT 153의 발아가 1-2일 정도 먼저 일어났다(표 3).

구분	C	BS (BS 그린)	S-A (수미+미네랄)	S (수미)	10M (미네랄)	CA-001 (Bacillus licheniformis-PHT 153)	V (비타민)
발 아	6	13	14	14	9	18	21

또한, 브라시카 캄페스트리스에서는 Bacillus licheniformis-PHT 153을 제외하면 대조군과 실험군의 차이가 크게 나지 않았다(표 4).

구분	C	BS (BS 그린)	S-A (수미+미네랄)	S (수미)	10M (미네랄)	CA-001 (Bacillus licheniformis-PHT 153)	V (비타민)
발 아	27	21	28	23	25	31	27

실시예 3: 식물 생육 촉진 실험

CA(Bacillus licheniformis-PHT 153)를 포함하는 시료가 식물의 생육 촉진에 있어서 각각 어떠한 영향을 나타내는지에 대하여 실험을 하였다.

CA(Bacillus licheniformis-PHT 153)와 비타민을 포함하는 시료는 농도를 1:500로 각각 희석하고 흙에 관주하고 하였으며, 대조군은 일반 상수도를 흙에 관주하였다. 그 다음 씨앗을 뿌린 뒤 각 식물 별로 생육 정도를 비교하였다.

식물발아를 촉진시킬수 있는지를 확인하기 위하여 브라시카 캄페스트리스(Brassica campestris)와 라파누스 사티부스 L.(Raphanus sativus L.)을 이용하였다.

그 결과, CA(Bacillus licheniformis-PHT 153)를 관주한 브라시카 캄페스트리스(Brassica campestris)와 라파누스 사티부스 L.(Raphanus sativus L.)이 잎폭, 잎길이, 뿌리길이, 생중량 및 줄기 길이에 있어서 대조군과 비교하여 현저하게 증가된 것을 확인할 수 있었다(표 5 내지 표 6, 그리고 도 4 내지 도 9).

구분	대조군	CA
잎폭	3.2	5.2
잎길이	7.5	9.5
뿌리길이	12	19
생중량	1.8	4.7
줄기길이	20	27

구분	대조군	CA
잎폭	5	5.8
잎길이	7.5	9.5
뿌리길이	6	16.5
생중량	3.1	4.8
줄기길이	14.5	17

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11118P

20101022

Claims

랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에 대한 항균활성을 가지는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) PHT-153(기탁번호 KCCM 11118P) 균주.
랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에 대한 항균활성을 가지는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) PHT-153(기탁번호 KCCM 11118P) 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 항균용 약제학적 조성물.
랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에 대한 항균활성을 가지는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) PHT-153(기탁번호 KCCM 11118P) 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 생장 촉진용 조성물.
삭제
다음 단계를 포함하는 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에 대한 항균활성을 가지는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) PHT-153(기탁번호 KCCM 11118P) 균주 제조 방법:
(a) 인분 50-500 중량부, 동물성 유지 10-150 중량부, 유기농 채소 5-100 중량부, 염분 0.1-20 중량부 및 증류수 10000-30000 중량부를 포함하는 혼합물을 15-60℃ 온도에서 1-12개월 동안 음지에서 산소를 공급하면서 정치시키는 단계; 및
(b) 상기 정치시킨 혼합물로부터 바실러스 리체니포르미스 균주를 동정 및 분리시키는 단계.