KR102044161B1 - 2r,3r-부탄디올 또는 2s,3s-부탄디올 처리에 의한 병원성 세균의 병원성 조절 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 2R,3R-부탄디올 또는 2S,3S-부탄디올 처리에 의한 병원성 세균의 병원성 조절 방법에 관한 것으로, 본 발명을 통해 2R,3R-부탄디올 또는 2S,3S-부탄디올은 효과적인 항균용 미생물제제로 사용될 수 있는 점을 확인함으로써, 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

2R,3R-부탄디올 또는 2S,3S-부탄디올 처리에 의한 병원성 세균의 병원성 조절 방법{Method for controlling pathogenicity of pathogenic bacteria by treating 2R,3R-Butanediol or 2S,3S-Butanediol}
본 발명은 부탄디올 이성질체인 2R,3R-부탄디올 또는 2S,3S-부탄디올 처리에 의한 병원성 세균의 병원성 조절 방법에 관한 것이다.
농업 분야에서 식물 병원균을 제어하기 위해서 화학 살충제가 널리 사용되고 있다. 그러나, 최근 화학 농약의 사용은 환경적 유독성 및 항생제 저항 미생물을 초래하는 가능성을 포함하여 많은 이슈들이 제기되고 있다. 따라서, 미생물 또는 식물로부터의 2차 대사산물로 만든 생물농약이 더욱 선호되고 있으며, 2,3-부탄디올은 그 중 한가지에 해당될 수 있다.
2,3-부탄디올은 프린터 잉크, 향수, 보습제, 연화제, 가소제, 식의약소재 등으로 다양하게 이용되는 화학원료로서, 특히 부타디엔으로 화학전환하여 합성고무의 원료로 이용될 수 있기 때문에 석유화학원료를 대체할 수 있는 대표적인 바이오화학원료로 최근 주목을 받고 있다. 또한 작물생장 촉진 등의 생리활성 기능으로 인해 농업분야에서도 2,3-부탄디올의 활용도는 증대할 것으로 예상된다.
기존에 식물 면역 증진 물질로 알려진 2,3-부탄디올이 식물의 면역을 증진시켜 식물병 발생을 줄이는 효과는 기존에 보고된 바가 있으나, 2,3-부탄디올이 직접적으로 병원성 세균의 병원성을 억제시키는 점에 대해서는 본 발명에서 최초로 확인하였고, 이에 대해 보고하고자 한다.
한편, 한국특허등록 제1482323호에는 방선균 추출물을 포함하는 펙토박테리움속 병원균에 대한 억제용 조성물이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제1589139호에는 식물병 방제용 조성물 및 이의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 2R,3R-부탄디올 또는 2S,3S-부탄디올 처리에 의한 병원성 세균의 병원성 조절 방법은 개시되어 있지 않다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 기존에 식물 면역 증진 물질로 알려진 2,3-부탄디올이 식물의 면역을 증진시켜 진균, 세균 및 바이러스 병원균에 의한 식물병 발생을 줄이는 효과는 기존에 보고된 바가 있으나, 2,3-부탄디올이 직접적으로 병원성 세균의 병원성을 억제시키는 점에 대해서는 본 발명에서 최초로 확인하였다.
본 발명에서는 식물 병원균인 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum)에 2R,3R-부탄디올을 처리한 결과, 병원성을 감소시키는 조절인자인 rsmC 및 rsmA 유전자의 발현은 증가하였고, 병원성을 증가시키는 조절인자인 gacA와 rsmB, 운동성 조절인자 flhC와 flhD, 그리고 식물 세포벽분해효소 pelA , pehA , pnl, prtW 및 celS의 발현은 감소하여 결과적으로 펙토박테리움 카로토보룸의 병원성이 감소되는 점을 확인하였고, 또다른 식물 병원균인 세균성 풋마름병균(Ralstonia solanacearum)에 2S,3S-부탄디올을 처리한 결과, 세균성 풋마름병균의 병원성이 감소되는 점을 확인하였다.
또한, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 세균성 폐렴균(Klebsiella pneumoniae), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)인 동물 병원균에 2R,3R-부탄디올 또는 2S,3S-부탄디올을 처리한 결과, 동물 병원균의 병원성이 감소되는 점을 확인하였다.
따라서, 본 발명을 통해 2R,3R-부탄디올 또는 2S,3S-부탄디올이 기존 항생제와 차별적인 효과로 세균의 밀도변화없이 항균용 미생물제제로 사용될 수 있는 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물 병원균에 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 또는 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol)을 처리하여 식물 병원균의 병원성 조절인자, 운동성 조절인자 또는 식물 세포벽 분해효소 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물 병원균의 병원성을 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 또는 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol)을 유효성분으로 함유하는 식물 병원균의 병원성 감소용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 동물 병원균에 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 또는 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol)을 처리하여 동물 병원균의 병원성을 감소시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 또는 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol)을 유효성분으로 함유하는 동물 병원균의 병원성 감소용 조성물을 제공한다.
본 발명은 직접 또는 기체상태로 2,3-부탄디올(2,3-butanediol)에 노출시킨 식물 무름병 원인균인 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum, Pcc21) 균주를 감자 또는 애기장대에 접종한 결과, 특히 2R,3R-부탄디올(R-형)에 노출시킨 Pcc21 처리의 경우, 무름병의 징후가 감소되는 점을 확인하였다. 또한, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 세균성 폐렴균(Klebsiella pneumoniae), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)인 동물 병원균에 2R,3R-부탄디올 또는 2S,3S-부탄디올을 처리한 결과, 동물 병원균의 병원성이 감소되고, 세균성 풋마름병균(Ralstonia solanacearum)에 2S,3S-부탄디올을 처리한 결과, 세균성 풋마름병균의 병원성이 감소되는 점을 확인하였다. 따라서, 2R,3R-부탄디올 또는 2S,3S-부탄디올은 효과적인 항균용 미생물제제로 사용될 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.
또한, 2R,3R-부탄디올(R-형)에 노출된 병원성 세균 펙토박테리움 카로토보룸(Pcc21)에서 2S,3S-부탄디올(S-형) 합성에 관여하는 budA 및 budC 유전자의 발현이 감소되어 S-형 부탄디올(S-형) 합성이 저해되고, 병원성의 결정적 인자인 식물세포벽 분해효소인 펙티나제의 생산을 줄여 결국 병원성이 억제되는 결과를 통해, 본 발명은 식물 병원성을 나타내는 세균들의 2,3-부탄디올 분비 조절 기작에 대한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 2,3-부탄디올을 채소무름병원균에 노출 및 접종하는 방법에 대한 실험 모식도를 나타낸다.
도 2는 2R,3R-부탄디올에 의한 감자와 애기장대에서 병징 조사 결과를 나타낸다. (가) 감자 슬라이스 병원성 검정, (나) 애기장대 병원성 검정
도 3은 2R,3R-부탄디올에 의한 채소무름병원균(PCC21)의 병원성억제를 확인한 결과이다. (가) 병원성 조절 기작, (나) 운동성인자, 병원성인자 및 병원성 조절인자 유전자 발현 조사, (다) 운동성 측정, (라) 펙틴 분해 효소 활성 측정.
도 4는 애기장대에서 2R,3R-부탄디올에 노출된 채소무름병 병원균(PCC21)의 개체수와 유전자 발현 조사 결과이다. (A) 애기장대 잎 절편당 채소무름병원균(PCC21) 개체수, (B) 애기장대 액틴 유전자 발현양 대비 채소무름병원균의 리보좀 발현양. (C) 애기장대 잎에서 2,3-부탄디올에 노출된 채소무름병원균(PCC21)과 대조구의 아세토인 디카복실레이즈(budA) 발현양, (D) 펙틴가수분해효소(pelA)의 발현양.
도 5는 2,3-부탄디올의 이성질체형인 2R,3R-부탄디올, 2S,3S-부탄디올, meso-부탄디올에 의한 채소무름병원균(PCC21)의 병징 조사 결과이다. RR; 2R,3R-부탄디올, SS;2S,3S-부탄디올, meso; 2S,3R 부탄디올과 2R,3S-부탄디올의 혼합물, BVCs, 2R,3R-부탄디올 합성하는 바실러스 휘발성 물질, Control; 무처리 대조구
도 6은 2R,3R-부탄디올과 2S,3S-부탄디올 처리에 의한 채소무름병원균(PCC21) 생장 조사 및 병원성 인자 유전자 발현 조사 결과이다.
도 7은 디케야 다단티(Dikeya dadantii)의 2S,3S-부탄디올 합성 대사 경로(A) 및 2S,3S-부탄디올 합성유전자 아세토인 디카복실레이즈(budA)와 (budC)의 유전자 발현 조사(B) 결과이다.
도 8은 채소무름병원균의 2R,3R-부탄디올과 2S,3S-부탄디올의 농도에 따른 병원성 억제정도를 나타낸다. S; 2S,3S-부탄디올, R; 2R,3R-부탄디올, 1= 1μM, 0.1=0.1 μM, 0.01=0.01 μM 2,3-부탄디올 농도, BTH는 식물 면역을 증진시켜 병을 억제하는 물질, Con; 2,3-부탄디올 처리하지 않은 대조구
도 9는 2R,3R-부탄디올의 농도에 따른 병원성 억제 정도를 나타낸다. 상단 도면은 2R,3R-부탄디올을 농도별로 처리하였을 때 병원균의 생존율(%), 하단 도면은 2R,3R-부탄디올을 농도별로 처리하였을 때 시간에 따른 병원균의 생존율(%)
도 10은 곤충모델인 꿀벌 부채명나방을 이용한 2R,3R-부탄디올에 의한 동물병원세균 병원성억제를 확인한 결과이다.
도 11은 2S,3S-부탄디올에 의한 세균성 풋마름병균의 병원성 억제를 나타낸다.
도 12는 꿀벌 부채명나방을 이용한 2S,3S-부탄디올에 의한 동물병원세균 병원성 억제를 나타낸다.
도 13은 2S,3S-부탄디올 농도에 따른 녹농균의 병원성 억제 정도를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물 병원균에 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 또는 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol)을 처리하여 식물 병원균의 병원성 조절인자, 운동성 조절인자 또는 식물 세포벽 분해효소 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물 병원균의 병원성을 감소시키는 방법을 제공한다.
일반적으로 식물 병원균의 병원성 조절은 병원성 조절인자, 운동성 조절인자 또는 식물 세포벽 분해효소 등이 다양한 조절인자(regulator)에 의해 이들을 코딩하는 유전자의 발현을 조절함으로써 병원성을 감소시키거나 강화시킨다. 이전 논문에서 알려진 채소무름병원균(PCC21)의 병원성 인자 조절은 조절인자 RsmA이 많아지면 식물 세포벽 분해효소를 억제하여 병원성이 감소하는데 RsmA의 양은 다른 조절인자인 rsmB에 의해 억제된다. 따라서 rsmB의 양이 증가하면 RsmA의 양이 감소하고 식물 세포벽 분해 효소의 활성을 억제하지 못해 병원성이 강하게 나타난다. 또한, 병원성 조절은 채소무름병원균의 운동성과 관련이 있는데, 운동성 조절인자인 FlhCD가 증가하면 운동성이 활발해지고 병원성에 영향을 준다. 또한 운동성 조절인자인 FlhCD는 또 다른 조절인자인 GacA를 통해 병원성 조절인자 rsmB를 활성화시켜 병원성에 영향을 미친다. 이 운동성 조절인자 FlhCD 복합체는 조절인자 RsmC에 의해 억제된다. RsmC는 또한 직접적으로 RsmA의 발현을 증가시켜 병원성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 병원성 조절인자 코딩 유전자는 gacA , rsmA , rsmB , rsmC , pelA , pehA , pnl , prtW 또는 celS이며, 운동성 조절인자 코딩 유전자는 flhC 또는 flhD이며, 식물 세포벽 분해효소 코딩 유전자는 pelA , pehA, pnl , prtW 또는 celS이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 rsmC 및 rsmA 유전자의 발현은 증가하고, gacA , rsmB , flhC , flhD , pelA , pehA , pnl , prtW 및 celS 유전자의 발현은 감소하여 식물 병원균의 병원성을 감소시키는 것이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물 병원균은 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum), 디케야 다단티(Dikeya dadantii) 또는 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 디케야 다단티(Dikeya dadantii)에서는 2R,3R-부탄디올 처리에 의해 2S,3S-부탄디올의 합성 유전자의 발현이 억제되어 병원성이 감소하는 점을 확인하였다(도 7).
또한, 본 발명은 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 또는 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol)을 유효성분으로 함유하는 식물 병원균의 병원성 감소용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 유효성분으로 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 또는 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol)을 포함하며, 상기 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 또는 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol)을 식물 병원균에 처리함으로써 식물 병원균의 병원성을 감소시킬 수 있는 것이다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 식물 병원균은 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum), 디케야 다단티(Dikeya dadantii) 또는 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum) 및 디케야 다단티(Dikeya dadantii)는 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 처리에 의해 병원성이 감소되고, 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)은 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol) 처리에 의해 병원성이 감소되나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 동물 병원균에 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 또는 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol)을 처리하여 동물 병원균의 병원성을 감소시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 동물 병원균은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 세균성 폐렴균(Klebsiella pneumoniae), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 또는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 또는 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol)을 유효성분으로 함유하는 동물 병원균의 병원성 감소용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 또는 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol)을 포함하며, 상기 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol) 또는 2S,3S-부탄디올(2S,3S-butanediol)을 동물 병원균에 처리함으로써 동물 병원균의 병원성을 감소시킬 수 있는 것이다.
이하, 본 발명을 실시 예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
A. 2R,3R-부탄디올 처리에 의한 병원 세균의 병 발생인자 발현 조절 방법
목적
부탄디올 이성질체인 2R,3R-부탄디올과 2S,3S-부탄디올 이성질체 처리에 의한 동/식물 병원성 세균의 병원성을 조절하여 병원성 세균 제어
재료 및 방법
1. 2R,3R-부탄디올 처리에 의한 식물 병원세균의 병원성 조절
(1) 식물 병원균인 채소무름병원균(Pectobacterium carotovorum strain PCC21, 이하 PCC21) 세균에 2,3-부탄디올을 노출시키는 방법 및 접종방법
(가) 식물 병원균 배양 방법
채소무름병원균 PCC21은 Luria-Bertani(LB; 1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 1% NaCl) 고체 배지에서 자란 단일 콜로니를 LB 액체 배지에 접종하여 30℃에서 250rpm으로 16시간 동안하였다.
(나) 2,3-부탄디올 노출 방법
채소무름병원균의 2R,3R-부탄디올을 세균에 노출하는 방법은 직접 세균 배양액에 넣는 방법과 I-플레이트를 이용한 기체상태로 처리하는 두 가지 방법을 사용하였다. 직접 처리하는 방법은 50ml 튜브에 (가)에서 준비한 세균 배양액을 5ml 넣고 2R,3R-부탄디올을 1uM의 농도로 넣어 30℃에서 5시간 배양 후 원심 분리하여 상등액을 버리고 침전된 세균 배양체를 모아 사용하였다. 또한, I-플레이트를 이용한 기체 상태로 처리하는 방법은 LB 아가 배지를 부은 작은 페트리디시(60mm dish)에 채소무름병원균을 (가)의 방법으로 배양한 세균 배양액 2ml을 도말하였다. 도 1과 같이 채소무름병원균이 접종된 작은 페트리디시를 I-플레이트의 한 면만 넣고 다른 면에는 1uM 농도의 2,3-부탄디올 100μl를 떨어뜨렸다. 15시간 동안 30℃에서 채소 무름 병원균에 2R,3R-부탄디올이 노출되도록 하였다. 2R,3R-부탄디올(Cat no. 237639-1G, Sigma)을 실험에 사용하였다.
(다) 식물에 채소무름병원균(PCC21) 접종방법
감자 슬라이스 병원균 처리 방법: 감자는 0.5mm 두께로 썰어 30% NaOCl에 10분간 담근 후 살균수로 5번 씻었다. 마르지 않도록 적신 3M 페이퍼를 덮어 준비하였다. 125mm 사각 플레이트에 3M 페이퍼를 깔고 준비한 감자를 올려 놓고 감자 중간에 2,3-부탄디올에 노출한 채소무름병원균(PCC21)을 105으로 희석하여 10μL를 떨어뜨려 접종하였다. 습도를 유지하기 위하여 뚜껑을 덮고 비닐랩으로 테두리만 막았다. 30℃에서 24시간동안 병징을 관찰하였다.
애기장대에 병원균 처리 방법: 애기장대는 토양에서 3주간 배양하여 준비하였고 2R,3R-부탄디올에 노출시킨 PCC21을 108cfu/ml로 준비하여 스프레이 방법으로 접종하였다. 습도 100%가 잘 유지되도록 한 후 24-48시간 동안 병징을 관찰하였다.
(2) 유전자 발현 조사
유전자 발현은 2R,3R-부탄디올에 노출된 채소무름병원균(PCC21)의 RNA를 추출하여 qRT-PCR 방법으로 조사하였다. RNA는 RNeasy Plus mini Kit(Cat. No 74134, Qiagen)의 방식으로 추출하였고, qRT-PCR을 Superscript III First strand cDNA synthesis kit(Cat. No 18080051, Invitrogen)과 iQ SYBR GREEn Supermix(Cat. No 170-8880, BioRad)를 이용하였다.
채소무름병원균(PCC21)의 병원성 유전자인 식물 세포벽 가수 분해효소(Plant cell wall degrading enzyme, PCWDE)인 펙틴 분해 효소(pelA, pehA, 그리고 pnl), 단백질 분해효소 (prtW), 그리고 섬유소 분해 효소(celS)와 병원성 인자의 발현을 조절하는 조절인자(regulator) gacA, rsmA, rsmC 그리고 rsmB 또한 병원성과 관련 있는 운동(motility) 관련 유전자 flhCD의 발현도 조사하였다(도 3). 그리고, 2S,3S-부탄디올을 합성 대사 경로 유전자인 budA(알파-아세토락테이트 디카복실레이즈)와 budC(2,3-부타네디올 디하이드로게네이즈) 유전자의 발현도 조사하였다. 유전자 발현 조사에 사용한 프라이머는 표 1에 나타냈다.
(3) 식물 세포벽 펙틴 가수 분해 효소 활성 조사
펙틴 가수 분해 효소 활성도를 측정하기 위하여 0.1M Tris-HCl(pH8.5), 2.2mM CaCl2 그리고 5.75mg/ml의 PGA(polyglacturonic acid)를 넣은 Pel(pectate lyase) 반응 용액을 준비하였다. Pel 반응용액 990μl 및 채소무름병원균체 배양액 10ul를 잘 섞어 상온에서 반응 후 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 235nm의 파장에서 10분간 흡광도 변화를 측정하였다(Activity= A235h-1*OD600nm-1로 변환하였다). 반응에 사용한 채소무름 병원균체는 LB 액체 배지에서 16시간 배양한 채소무름병원균(PCC21)을 100μl를 새로운 LB 액체 배지 5ml에 넣고 2R,3R-부탄디올에 9시간 노출시킨 채소무름병원균체와 2R,3R-부탄디올에 노출시키지 않은 대조구를 준비하여 활성도를 비교하였다.
(4) 채소무름병원균 운동성 조사
채소무름병원균의 운동성을 확인하기 위하여 I-플레이트의 한쪽 면에 LB 배지에 0.3% 아가를 넣어 운동성 조사배지를 준비하였다. 또한 다른 면에는 2R,3R-부탄디올을 떨어뜨려 2R,3R-부탄디올이 운동성에 영향을 미치는지 확인하였다. 대조구로는 2R,3R-부탄디올 대신 물을 떨어뜨렸다. 운동성 조사배지 중앙에 채소무름병원균을 배양액 1ul를 뜨리고 30℃에서 24시간동안 배양하며 움직인 정도를 측정하였다.
2. 2R,3R-부탄디올 처리에 의한 동물 병원성 세균의 병원성 조절
(1) 동물 병원성 세균 배양 방법 및 2R,3R-부탄디올 노출 방법
(가) 동물 병원성균 배양 방법
동물 병원균으로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 세균성 폐렴균(Klebsiella pneumonia), 황색 포도상 구균(Staphylococcus arueus), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)의 배양은 Luria-Bertani(LB) 고체 배지에서 자란 단일 콜로니를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 250rpm으로 16시간 배양하여 사용하였다.
(나) 2R,3R-부탄디올 노출 방법
LB 액체 배지 150ml에 LB 액체 배지에서 전배양한 동물 병원성균 1.5ml을 넣고 37℃에서 250rpm으로 OD600=0.3까지 배양 후 2R,3R-부탄디올을 첨가한 후 6시간 동안 반응시켜 사용하였다.
(2) 꿀벌 부채명나방을 이용한 킬링 어세이
3-4령의 꿀벌 부채명나방을 이용하여 동물 병원균의 병원성을 조사하였다. 1처리구마다 5마리를 사용하였으며 한 처리구당 3개의 반복을 수행하였다. 2R,3R-부탄디올에 노출된 동물 병원균은 106 cfu/2ul가 되도록 준비하여 주사기로 꿀벌 부채명나방의 표피 안쪽으로 감염시켰다. 30℃에서 배양하여 6시간 단위로 생존율을 관찰하였다.
유전자 발현에 사용된 프라이머 서열
Gene Primer (5 -> 3')(서열번호)
pehA Forward CCA GCA TAG TTT GCC AGT TTA TC (1)
Reverse GGT CAA TGG CGT TCG GTA TAG (2)
pelA Forward CTG GAA GAG CAC CGG TAA AT (3)
Reverse CCA GCA TAG TTT GCC AGT TTA TC (4)
pnl Forward TAC CTG GGA GCT GCG TAA TA (5)
Reverse ACG TAG GGC TTG GAA TCT TTA TC (6)
prtW Forward CAT CAC GGC GAT CCA ATA TCT (7)
Reverse GGC TAT TGC TGG TAG TGG TAT AG (8)
celS Forward GTG CCG GTA GAT TTG ATG GA (9)
Reverse CAC TGG ACG GCA GGT TAT AC (10)
gacA Forward CAC TGG ACG GCA GGT TAT AC (11)
Reverse ATG TCC ATC AGG ACA ACA TCT AC (12)
rsmA Forward CAT GAT CGG CGA TGA GGT AA (13)
Reverse TCT TCA CGG TGG ACA GAA AC (14)
rsmB Forward CCG AGA TAG AGA CAT CGA AGA ATT AG (15)
Reverse GCA GAA TAG AGC AGG TAG CAT AG (16)
rsmC Forward CAT GAT CGG CGA TGA GGT AA (17)
Reverse TCT TCA CGG TGG ACA GAA AC (18)
flhC Forward ACT CAC GCT CAT CAA CCT AAA (19)
Reverse TTC ATC CAG CAG TTG AGG TAT T (20)
flhD Forward TAC TGG CGC AAC GCT TAA T (21)
Reverse CAA TTT CAC CAT CTG CGG TAA AG (22)
budA Forward CCA GCT TAC ACT CAG GGA ATT A (23)
Reverse GCA ATC ACA CCA AAC GTC AG (24)
budC Forward GCG AAC AGG CAT TGA TGA TTT (25)
Reverse ACG TTG TCG ATC GCG TTT A (26)
B. 2S,3S - 부탄디올 처리에 의한 병원 세균의 병 억제 방법
목적
2S,3S-부탄디올 이성질체 처리에 의한 동/식물 병원성 세균의 병원성을 조절하여 병원성 세균 제어
재료 및 방법
1. 2S,3S - 부탄디올 처리에 의한 식물 병원세균의 병원성 조절
(1) 식물 병원균 세균성 풋마름병균(Ralstonia solanacearum)에 2S,3S-부탄디올을 노출시키는 방법 및 접종방법
(가) 식물 병원균 배양 방법
세균성 풋마름병균은 CPG(0.1% casamino acid, 1% Peptone, 0.5% Glucose, 2% agar) 고체 배지에서 30℃에서 16시간 동안 배양하였다.
(나) 2S,3S-부탄디올 노출 방법
세균성 풋마름병균은 CPG 고체 배지에서 배양한 균을 CPG 액체 배지에 잘 풀어 준비하였다. 2S,3S-부탄디올이 든 CPG 배지에 넣어 굳힌 배지 위에 세균성 풋마름 병원균 배양 혼탁액 2S,3S-부탄디올을 섞어서 도말해 준다. 30℃에서 12시간 배양 후 배양 균체를 고체 배지에서 회수한다. 회수한 배양 균체를 2S,3S-부탄디올을 넣은 1mM MgCl2 용액에 희석한 후 3시간 동안 반응 후 식물 접종에 사용하였다. 실험에 2S,3S-부탄디올(Cat. No. B1343, TCI)을 사용하였다.
(다) 식물에 세균성 풋마름병균 접종방법
2S,3S-부탄디올을 처리한 세균성 픗마름병균을 108cfu/ml의 농도를 7주 배양한 담배 식물 뿌리에 관주하였다. 병 접종 후 3주 동안 병징을 관찰하였다.
2. 2S,3S - 부탄디올 처리에 의한 동물 병원성 세균의 병원성 조절
(1) 동물 병원성 세균 배양 방법 및 2S,3S-부탄디올 노출 방법
(가) 동물 병원성균 배양 방법
동물 병원균으로 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 세균성 폐렴균(Klebsiella pneumonia), 황색 포도상 구균(Staphylococcus arueus), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)의 배양은 Luria-Bertani(LB) 고체 배지에서 자란 단일 콜로니를 LB 액체 배지에 접종하여 37℃에서 250rpm으로 16시간 배양하여 사용하였다.
(나) 2S,3S-부탄디올 노출 방법
LB 액체 배지 150ml에 LB 액체 배지에서 전배양한 동물 병원성균 1.5ml을 넣고 37℃에서 250rpm으로 OD600=0.3까지 배양 후 2S,3S-부탄디올을 첨가한 후 6시간 동안 반응시켜 사용하였다.
(2) 꿀벌 부채명나방을 이용한 킬링 어세이
꿀벌 부채명나방은 곤충병원성 선충, 병원성 진균 및 세균에 대한 병원성과, 병원성 인자에 대한 연구에 널리 사용한다. 쥐와 같은 척추동물을 모델동물로 사용하는 것에 비해 실험에 필요한 개체수를 획득하기 용이하며, 비용이 저렴하며 번식주기가 짧아 빠르게 결과를 얻을 수 있어 모델동물의 대안으로 주목받고 있는 모델 시스템으로 병원균의 병원성 검사를 위해 사용하였다.
3-4령의 꿀벌 부채명나방을 이용하여 동물 병원균의 병원성을 조사하였다. 1처리구마다 5마리를 사용하였으며 한 처리구당 3개의 반복을 수행하였다. 2R,3R-부탄디올에 노출된 동물 병원균은 106 cfu/2ul가 되도록 준비하여 주사기로 꿀벌 부채명나방의 표피 안쪽으로 감염시켰다. 30℃에서 배양하여 6시간 단위로 생존율을 관찰하였다.
실시예 1. 2R,3R - 부탄디올에 노출된 채소무름병원균 ( Pectobacterium carotovorum PCC21 , 이하 PCC21 ) 세균은 감자와 애기장대에서 병징이 감소된다 .
채소무름병원균(Pectobacterium carotovorum PCC21)을 2R,3R-부탄디올에 노출시킨 것과 노출시키지 않은 것을 감자와 애기장대에 접종하여 병징을 관찰하였다. 감자는 0.5mm 두께로 잘라 NaOCl로 살균 후 살균수로 5번 씻어 준비하였다. PCC21을 105 cfu/ml로 희석한 세균 배양액 10ul를 감자 위에 떨어뜨려 접종하였다. 접종한 감자는 100% 습도가 잘 유지되도록 밀폐 용기에 넣어 30℃에서 24시간 동안 병징을 관찰하였다. 병징이 나타나는 부위의 면적을 측정하고 병징의 상태를 관찰하여 병징의 정도로 나타내었다.
2R,3R-부탄디올을 처리한 채소무름병원균(PCC21)을 접종한 부위는 병징 면적이 작지만, 2R,3R-부탄디올을 처리하지 않은 대조구(Control)는 병징 면적이 넓은 것을 확인할 수 있었다(도 2). 애기장대에는 2R,3R-부탄디올에 노출한 PCC21을 108 cfu/ml 농도로 준비하여 골고루 스프레이 하는 방식으로 접종하였다. 100% 습도가 유지되도록 하였으며 48시간 동안 병징을 관찰하였다. 2R,3R-부탄디올을 처리한 애기장대는 병징이 거의 나타나지 않았지만 대조구에서는 입자루가 녹아 줄기에서 떨어지는 병징을 나타내었다. 감자와 애기장대 모두에서 2R,3R-부탄디올을 처리한 PCC21에서 병징이 감소된 것을 알 수 있었다.
실시예 2. 2R,3R - 부탄디올은 채소무름병(PCC21)의 병원성 유전자의 발현과 세균의 병원성인자인 펙틴 가수분해 효소 활성을 억제시킨다 .
PCC21의 병원성은 식물 세포벽 가수분해효소(Plant cell wall degradingenzyme) 분비에 의한 것으로 알려져 있다. 식물 세포벽의 가수분해효소는 섬유소 분해효소(celS), 펙틴분해효소(pelA, pehA, pnl) 그리고 단백질 분해 효소(prtW) 등이 알려져 있다. 이들 유전자의 발현은 다양한 조절인자(regulator)에 의해 영향을 받는다. 이전 논문에서 알려진 채소무름병원균의 병원성 인자 조절은 조절인자 RsmA이 많아지면 식물 세포벽 분해효소를 억제하여 병원성이 감소하는데 RsmA의 양은 다른 조절인자인 rsmB에 의해 억제된다. 따라서 rsmB의 양이 증가하면 RsmA의 양이 감소하고 식물 세포벽 분해 효소의 활성을 억제하지 못해 병원성이 강하게 나타난다.
또한, 병원성 조절은 채소무름병원균의 운동성과 관련이 있는데, 운동성 조절인자인 FlhCD가 증가하면 운동성이 활발해지고 병원성에 영향을 준다. 또한 운동성 조절인자인 FlhCD는 또 다른 조절인자인 GacA를 통해 병원성 조절인자 rsmB의 활성화시켜 병원성에 영향을 미친다. 이 운동성 조절인자 FlhCD 복합체는 조절인자 RsmC에 의해 억제된다. RsmC는 또한 직접적으로 RsmA의 발현을 증가시켜 병원성을 감소시킬 수 있다. 이러한 조절 기작은 도 3의 (가)에 나타내었다.
따라서 2R,3R-부탄디올에 노출된 채소무름병원균(PCC21)에서 병원성 감소가 도 3의 (가)의 병원성 조절 기작에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 병원성 조절인자(gacA, rsmA, rsmB, rsmC), 운동성인자(flhC, flhD), 병원성인자(pelA, pehA, pnl, prtW, celS)의 발현을 조사하였고, 또한 채소무름병원균의 운동성과 식물 세포벽분해효소 활성을 측정하였다. 그 결과 병원성을 감소시키는 조절인자인 rsmC, rsmA 유전자의 발현은 증가하였고, 병원성을 증가시키는 조절인자인 gacA, 운동성 조절인자 flhC, flhD 그리고 식물 세포벽분해효소 pelA, pehA, pnl, prtW, celS의 발현은 감소한 것을 확인하였으며(도 3의 (나)), 병원성을 증가시키는 조절인자인 rsmB은 2R,3R-부탄디올에 노출되지 않은 것에 대비하여 2R,3R-부탄디올에 노출된 것에서의 발현율은 1.1 정도로 매우 유사하게 나타나는 것을 확인하였는데, 도 6을 통해 3 시간 이후에 그 발현량이 대조구에 비해 감소할 것으로 분석되었다.
운동성 조절인자 flhC와 flhD의 발현 감소가 운동성도 감소시켰는지 확인하기 위하여 I-플레이트의 한쪽 면에 운동성 조사 배지인 0.3% 아가를 넣은 LB 배지를 준비하고 채소무름병원균(PCC21)을 접종하였다. 다른 면에는 2R,3R-부탄디올을 떨어뜨린 후 운동성을 조사하였다. 대조구로는 2R,3R-부탄디올 대신 물을 떨어 뜨려 조사하였다. 그 결과 도 3의 (다)와 같이 2R,3R-부탄디올에 노출된 채소무름병원균의 운동성이 대조구에 비해 감소한 것을 확인할 수 있었다. 식물 세포벽 분해 효소인 PelA(pectate lyase)의 활성도 대조구에 비해 2R,3R-부탄디올에 노출된 채소무름병원균에서 감소한 것을 확인하였다(도 3의 라).
또한, 채소무름병원균을 애기장대에 접종 후 0일, 1일, 2일에 채소무름병원균의 개체수와 병원성 관련인자 아세토인 디카복실레이즈(budA)와 펙틴가수분해효소(pelA)의 발현양을 조사한 결과 2R,3R-부탄디올에 노출된 채소무름병원균(PCC21)을 처리한 곳에서 2R,3R-부탄디올에 노출되지 않은 채소 무름 병원균(PCC21)을 처리한 곳보다 2일째 채소무름병원균(PCC21)의 개체수와 병원성 관련 인자의 발현양이 감소됨을 확인하였다(도 4).
또한, 2R,3R-부탄디올, 2S,3S-부탄디올, meso-부탄디올, 그리고 2R,3R-부탄디올 합성 바실러스 휘발성 물질 처리에 의해 채소무름병원균(PCC21)의 병원성 억제를 통한 병징 감소 효과를 확인한 결과, 2R,3R-부탄디올을 처리한 경우, 채소무름병원균(PCC21)의 병원성 억제 효과가 현저하게 높은 점을 확인하였다(도 5).
또한, 2R,3R-부탄디올과 2S,3S-부탄디올에 의해 채소무름병원균(PCC21)의 생장에는 영향이 없었으며(상단 도면), 유전자 발현은 2S,3S-부탄디올에 의해 병원성 관련 유전자 rsmB, pehA와 2S,3S-부탄디올 합성 유전자 budA의 유전자 발현이 대조구보다 증가하였지만, 2R,3R-부탄디올 처리에 의해 처리 초기에는 유전자 발현이 증가하지 않았으며 3시간째에 2R,3R-부탄디올 처리시 병원성 조절인자 rsmB의 발현이 대조구보다 감소하였는데, 이는 3시간 이후 병원성인자의 발현 감소를 유도할 것으로 분석되었다(도 6).
또한, 다른 무름병원균인 디케야 다단티(Dikeya dadantii)에서 2S,3S-부탄디올 합성 대사 돌연변이체는 병원성이 낮아졌다는 보고가 있다. 따라서 2R,3R-부탄디올에 의해 2S,3S-부탄디올의 합성 저해를 통한 병원성 억제 효과가 있는지 조사한 결과 2R,3R-부탄디올이 2S,3S-부탄디올의 합성 유전자의 발현을 억제하는 점을 확인하였다(도 7).
또한, 2S,3S-부탄디올은 낮은 농도(0.01 μM)에서 병원성 억제 기능이 있으며, 또한, 2R,3R-부탄디올은 다양한 농도(1 μM 및 0.01 μM)에서 병원성 억제 기능이 있음을 확인하였다(도 8).
슈도모나스 애루기로사(Pseudomonas aeruginosa)에 2R,3R-BDO를 10μM-100pM의 농도에서 배양하여 102CFU/2㎕를 꿀벌 부채명나방 유충에 주입하였다. 24시간 후 비처리구에 비하여 꿀벌 부채명나방 유충의 생존율이 7~14배 증가하였다. 24시간 후, 2R,3R-BDO 100nM 처리구의 꿀벌 부채명나방 유충 생존율은 86%로 가장 높았다. 슈도모나스 애루기로사에 2R,3R-BDO를 처리하였을 때 병원성이 감소함을 확인하였다(도 9).
실시예 3. 2R,3R - 부탄디올에 의한 동물 병원균들의 병원성 억제
동물 병원균의 병원성을 2R,3R-부탄디올에 의해 억제되는지 확인하였다. 실험에 사용한 동물 병원균은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 세균성 폐렴균(Klebsiella pneumoniae), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)를 사용하였다. 각 동물 병원성 균에 2R,3R-부탄디올에 노출시킨 후 꿀벌 부채명나방 애벌레에 감염시켜 생존률을 통해 병원성을 조사하였다.
꿀벌 부채명나방은 곤충병원성 선충, 병원성 진균 및 세균에 대한 병원성과 병원성 인자에 대한 연구에 널리 사용한다. 쥐와 같은 척추동물을 모델동물로 사용하는 것에 비해 실험에 필요한 개체수를 획득하기 용이하며, 비용이 저렴하며 번식주기가 짧아 빠르게 결과를 얻을 수 있어 모델동물의 대안으로 주목받고 있는 모델 시스템으로 병원균의 병원성 검사를 위해 사용하였다. 그 결과, 동물 병원세균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 세균성 폐렴균(Klebsiella pneumoniae), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 그리고 아시네토박터바우마니(Acinetobacter baumannii)은 2R,3R-부탄디올에 의해 병원성이 억제되는 점을 확인할 수 있었다(도 10).
실시예 4. 2S,3S - 부탄디올에 의한 세균성 풋마름병균 ( Ralstonia solanacearum )의 병원성 억제
2S,3S-부탄디올에 노출된 세균성 풋마름병균을 7주된 담배 식물 뿌리 관주 방식으로 접종하였다. 3주 후 2S,3S-부탄디올에 노출된 세균성 풋마름병균의 대조구에 비해 시들음 증상이 감소한 것을 확인하였다(도 11).
실시예 5. 2S,3S - 부탄디올에 의한 동물 병원균들의 병원성 억제
2S,3S-부탄디올이 동물 병원균에도 영향을 미치는지 조사하였다. 사용한 동물 병원균은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 세균성 폐렴균(Klebsiella pneumoniae), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii)를 사용하였다. 각 동물 병원성 균에 2S,3S-부탄디올에 노출시킨 후 꿀벌 부채명나방 애벌레에 감염시켜 생존률을 통해 병원성을 조사하였다. 녹농균, 세균성 폐렴균, 황색포도상 구균 그리고 아시네토박터 바우마니에서 2S,3S-부탄디올에 노출되었을 때 대조구에 비해 꿀벌 부채명나방의 생존률이 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 12).
또한, 2S,3S-부탄디올 농도에 따른 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 병원성 억제 정도를 살펴본 결과, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에 2S,3S-BDO를 10μM-100pM의 농도에서 배양하여 102CFU/2㎕를 꿀벌부채명나방 유충에 주입하였다. 24시간 후 비처리구에 비하여 꿀벌부채명나방 유충의 생존율이 7~12배 증가하였다. 24시간 후, 2S,3S-BDO 100pM 처리구의 꿀벌부채명나방 유충 생존율은 73%로 가장 높았다. 녹농균에 2S,3S-BDO를 처리하였을 때 병원성이 감소하였다(도 13).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Method for controlling pathogenicity of pathogenic bacteria by treating 2R,3R-Butanediol or 2S,3S-Butanediol <130> PN17250 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ccagcatagt ttgccagttt atc 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggtcaatggc gttcggtata g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctggaagagc accggtaaat 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ccagcatagt ttgccagttt atc 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tacctgggag ctgcgtaata 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acgtagggct tggaatcttt atc 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 catcacggcg atccaatatc t 21 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggctattgct ggtagtggta tag 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gtgccggtag atttgatgga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cactggacgg caggttatac 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cactggacgg caggttatac 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 atgtccatca ggacaacatc tac 23 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 catgatcggc gatgaggtaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tcttcacggt ggacagaaac 20 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ccgagataga gacatcgaag aattag 26 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gcagaataga gcaggtagca tag 23 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 catgatcggc gatgaggtaa 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tcttcacggt ggacagaaac 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 actcacgctc atcaacctaa a 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ttcatccagc agttgaggta tt 22 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tactggcgca acgcttaat 19 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 caatttcacc atctgcggta aag 23 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ccagcttaca ctcagggaat ta 22 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 gcaatcacac caaacgtcag 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gcgaacaggc attgatgatt t 21 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 acgttgtcga tcgcgttta 19

Claims (9)

  1. 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol)을 유효성분으로 함유하는 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum) 식물 병원균의 병원성 감소용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 2R,3R-부탄디올(2R,3R-butanediol)은 식물 병원균의 병원성 조절인자, 운동성 조절인자 또는 식물 세포벽 분해효소 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하여 병원성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 조성물로서,
    상기 병원성 조절인자 코딩 유전자는 gacA (global regulator), rsmA (regulator of secondary metabolites A), rsmB (regulator of secondary metabolites B), rsmC (regulator of secondary metabolites C), pelA (pectate lyase A), pehA (polygalacturonase A), pnl (pectin lyase), prtW (extracellular metalloprotease) 또는 celS (cellulase S)이며, 운동성 조절인자 코딩 유전자는 flhC (flagellar transcriptional regulator C) 또는 flhD (flagellar transcriptional regulator D)이며, 식물 세포벽 분해효소 단백질 코딩 유전자는 pelA (pectate lyase A), pehA (polygalacturonase A), pnl (pectin lyase), prtW (extracellular metalloprotease) 또는 celS (cellulase S)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 삭제
  5. 제3항에 있어서, 상기 rsmC (regulator of secondary metabolites C) 및 rsmA (regulator of secondary metabolites A) 유전자의 발현은 증가하고, gacA (global regulator), rsmB (regulator of secondary metabolites B), flhC (flagellar transcriptional regulator C), flhD (flagellar transcriptional regulator D), pelA (pectate lyase A), pehA (polygalacturonase A), pnl (pectin lyase), prtW (extracellular metalloprotease) 및 celS (cellulase S) 유전자의 발현은 감소하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
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