KR100923223B1 - 바실러스 서브틸리스 엠27균주의 배양 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 상추 균핵병의 억제 혹은 제어능이 뛰어난 바실러스 서브틸리스 엠27균주의 배양방법을 제공하며, 유가배양으로 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 배양하는 것을 특징으로 한다. 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 대량배양하기 위한 배지조성은 수크로스 1~5%, 효모추출물 0.3~0.8%, 소이펩톤 0.3~0.8%, 옥수수 전분 0.3~1.0%, 대두박 0.3~1.0%, 이인산칼륨 0.1~0.5%, 황산마그네슘 0.01~0.05%이며, 추가적으로 수크로스 1~3%, 효모추출물 0.1~0.5%, 소이펩톤0.1~0.5%를 첨가하고, 생육온도는 20~30℃이며, 생육 pH 범위는 5.0~8.0이며, 배양시간은 60~80시간에서 잘 자란다. 또한 상기 배양방법은 기존의 TSB(Tryptic Soy Broth) 함유배지를 이용한 단일회분 배양시보다 훨씬 저렴한 배지를 이용하여 우수한 항균효능을 나타내며, 기존 농약보다 우수한 제품을 만들 수 있다.
바실러스 서브틸리스, 이투린, 균핵병, TSB, 유가배양

Description

바실러스 서브틸리스 엠27균주의 배양 방법{Method of culturing Bacillus subtilis M27}
본 발명은 바실러스 서브틸리스 엠27균주의 배양방법에 관한 것이다.
바실러스 속 균주는 그람양성 간균으로서 토양 내에서 쉽게 분리될 수 있고, 또한 여러가지 분해 효소를 이용하여 토양 내의 염류집적 현상을 해소할 뿐만 아니라 세포외로 분비되는 여러가지 독소를 이용하여 항진균 활성을 가지는 장점이 있어 토양 미생물 제제의 개발에 많은 관심의 대상이 되어지고 있다.
또한, 바실러스 속 균주는 대부분이 인간에게 비병원성이고, 쉽게 유전자 조작이 가능하며 배양이 용이한 특성을 가지고 있다. 더욱이 내생포자의 형성으로 오랜기간 유지 및 보존이 용이하고 항생물질 생산과 내생포자 형성 등의 이유로 생물농약의 재료로서 다른 균에 비해 광범위하게 이용되고 있다.
현재 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 약 66종류의 펩타이드 항생물질을 분비한다고 밝혀져 있는데, 그 중에 항진균 작용을 나타내는 물질로는 bacillomycin, mycobacilin, fungistain, iturin 등이 있다. 이들이 생성하는 펩타이드계 항생물질 중 지방산기를 포함하고 있는 그룹을 lipopetide antibiotics라 부르며, 바실러스 서브틸리스가 생산하는 항진균 cyclic lipopeptide 물질로는 iturin A, C, D, E, bacillomycin A, D, F, L, S surfactin, bacillopeptin 등을 들 수 있다. 특히 이 중에서도 바실러스 서브틸리스가 생산하는 iturin 계열의 cyclic lipopeptide는 모두 강력한 항진균제로 작용을 하는 것으로 밝혀져 있다.
바실러스 서브틸리스로부터 생산되는 항진균물질인 iturin계 항생물질은 7개의 α-amino acid와 1개의 β-amino acid가 결합한 환상의 구조를 가진다. 또 β-amino acid는 methylene의 수에 따라 탄소수에 따라 동일한 항생물질이라도 여러 분자량을 가지는데 이때 탄소수가 많을수록 항진균력이 증가 되는 것으로 보고되고 있다.
Iturin계 항진균제들은 진균의 세포막에 존재하는 인지질과 작용하여 세포막의 구조와 물리적 특성을 변화시킴으로써 세포막을 파괴하는 것으로 알려져 있다. 이들 lipo-peptide는 세포막의 ion conducting pore를 유도하여 투과성을 증가시키는데, 이때 칼륨이온과 필수적인 구성물질의 유실을 발생시킴으로써 세포의 회생불능의 손상을 유발하여 세포를 죽도록 한다.
국내에서 상추를 비롯한 70여종 작물에서 Sclerotinia sclerotiorum에 의한 균핵병이 발생하고 있다. 토양병해의 발생원인은 연작으로 인한 토양내 병원균 밀도의 증가, 불리한 환경에서도 장기간 생존할 수 있는 균핵을 형성한다는 점을 들 수 있다. 시설 상추 재배시에 균핵병은 주로 저온기에 발생하여 피해를 주고 있으며, 국내에서 상추 균핵병에 방제적용 약제는 베노밀 수화지 등 2종 약제가 등록되어 있으나 친환경 재배농가에서 방제법이 없어서 환경 친화적인 방제법 개발이 절 실히 요구되고 있는 실정이다.
따라서, 식물의 균핵병 방지 효과를 나타내는 바실러스 서브틸리스 균주를 이용한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 특히 대한민국 특허 등록번호 제10-0574346호에는 바실러스 서브틸리스 EB072균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는 방법, 대한민국 특허등록번호 제10-0819941 호에는 신규한 바실러스속 CMB32균주 및 이를 이용한 항균활성이 있는 미생물제제, 대한민국 특허등록번호 제10-587447호에는 바실러스 서브틸리스 EB120균주, 이를 포함하는 식물병 방제용 미생물 제제 및 이를 이용하여 식물병을 방제하는 방법이 공지되어 있다.
유가배양은 글리세롤, 부탄올, 아세톤, 유기산, 아미노산, 효소, 항생물질 생산 등 발효에 광범위하게 이용되며 필요한 영양원을 한꺼번에 투입하며 회분식 배양과 달리 발효가 이루어지는 동안에 필요한 물질을 첨가하며 배양액을 빼내는 일 없이 배지를 연속 혹은 간헐적으로 공급하는 배양법을 말한다. 배양액 첨가량은 배양시간과 함께 증가하며 이 방법의 이점은 배양액 중의 기질 농도를 임의로 제어할 수 있다는 것이다.
이것에 의해서 유가배양법에서 기질은 적당한 속도로 첨가되며 또한 유출이 없기 때문에 공급되는 기질의 양과 미생물에 의한 소비량과의 균형을 유지함으로 인해 기질을 자유롭게 희망하는 설정값으로 제어할 수가 있으며 발효가 완전히 끝날 때까지 영양공급원이 다양한 방법으로 이루어진다.
회분배양은 일정배지에서 폐쇄적으로 배양시키며 이러한 회분발효 공정은 항 시 스타터(starter)를 준비하고 일회성 소비적인 단점을 지니고 있다.
따라서, 유가배양을 이용한 균주의 배양방법에 대한 연구가 활발히 이루어 지고 있으며, 대한민국 특허공개번호 제2002-0096020호에는 모르티에렐라속 균주의 유기배양을 통한 아라키돈산의 생산방법, 대한민국 특허등록번호 제10-0255269호에는 인간성장호르몬의 대량생산을 위한 DO-STAT 유가식배양방법, 대한민국 특허등록번호 제10-0383078호에는 상황버섯 균사체의 유가식 배양을 통한 대량 생산 방법등이 공지되어 있으나, 상추 균핵병의 제어 또는 억제능에 효과가 있는 바실러스 서브틸리스 균주를 이용한 유가배양 방법은 연구가 미흡한 실정이다.
또한, 대한민국 특허공개번호 제2008-0045346호에는 신규한 바실러스 서브틸리스 엠27균주 및 이를 유효성분으로 한 식물 균핵병 방제방법이 공지되어 있으며, 여기서 균주 배양시 TSB(Tryptic Soy Broth) 복합배지를 이용하여 회분배양하는데 이는 대량으로 배양할 시 막대한 비용이 들어가는 단점이 있다.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 유가배양을 통하여 저렴한 비용으로 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 대량으로 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 해결하고자 하는 균주의 배양 방법은 유가배양을 통하여 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 배양하는 것을 특징으로 한다.
상기 바실러스 서브틸리스 엠27균주의 배양은 수크로스 1~5%, 효모추출물 0.3~0.8%, 소이펩톤(soypeptone) 0.3~0.8%, 옥수수 전분 0.3~1.0%, 대두박(soybean meal) 0.3~1.0%, 이인산칼륨 0.1~0.5%, 황산마그네슘 0.01~0.05%를 포함하는 배지조성에서 배양을 시작하고, 48~96시간동안 배양중에 추가적으로 2~4회 12~24시간 간격으로 수크로스(sucrose) 1~3%, 효모추출물 0.1~0.5%, 및 소이펩톤(soypeptone) 0.1~0.5%를 첨가하여 배양하며, 이때 생육온도는 15~35℃이며, 생육 pH 범위는 5.0~9.0이며, 배양시간은 36~96시간에서 잘 자란다.
상기 생육온도는 바람직하게는 20~30℃이다.
상기 생육 pH는 바람직하게는 pH 6.0~8.0이다.
상기 배양시간은 바람직하게는 48~72시간이다.
상기 균주는 한국농업미생물자원센터(KACC, Korean Agricultural Culture Collection)에서 동결건조하여 소형 유리용기에 진공으로 보관된 바실러스 서브틸리스 엠27(기탁번호 KACC 91208P)을 분양받은 것이다.
본 발명은 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 이용하여 제제한 식물 병원균 방제제 및 이를 이용한 식물병원균의 방제방법을 제공한다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 이용하여 방제할 수 있는 처리대상균으로 균핵을 형성하는 Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia minor, Sclerotium cepicorum, Sclerotinia sp., Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani와 주요 채소병원균 Colletotrichum gloeosporioides, Corynespora cassiicola, Didymella bryoniae, Alternaria solani, Fusarium oxysporum, Phytophotra capsici 등이 해당된다.
본 발명의 바실러스 서브틸리스 엠27균주는 상기 균의 생육을 저지하여 방제할 수 있다.
TSB 함유 YI 배지에 배양하였을 때와 상응하는 항생물질이 분비되며 작물의 재배 기존의 TSB 함유 YI 배지와는 달리 비용이 저렴하므로 경제적 부담감을 줄일 수 있다.
본 발명에 따른 TSB 함유 YI 배지와 동일한 효능을 하는 저렴한 배지를 사용하여 유가배양을 실시하면 TSB 함유 YI 배지를 사용하여 회분배양한 것과 비교시 생균수가 높아 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 TSB 함유 YI 배지를 이용한 회분배양시 보다 수십배 적은 비용으로 많은 균주를 대량생산할 수 있다.
회분배양에 의해 생산하는 것에 비해 지속적 및 간헐적으로 탄소원 또는 탄소원과 질소원을 공급하는 유기배양공정을 사용하여 균사체의 생산량 증가와 배양기간을 단축시킬 수 있는 효과가 있으며 단백다당체의 대량생산에 있어서 경제성을 확보하는 효과가 있다.
아울러, 균주 배양시 사용되는 배지비용의 감소와 실제로 제품화 하였을때 가격하락 효과가 있으며 농약에 대한 가격 경쟁력 및 실제 작물의 상품 가치가 극대화될 수 있어 산업적으로 매우 유용하다.
작물 출하시 일주일 전에는 잔류농약 등의 문제로 화학농약의 사용을 금지해야 하기 때문에 작물저장성이 문제점이 있으나, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 생물농약으로 사용시 친환경이기 때문에 출하 2일전까지 사용하여도 문제가 되지 않아 상추균핵병 등의 획기적인 생물학적 방제방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되어지는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다.
<실시예 1> 균주의 선별
한국농업미생물자원센터(KACC, Korean agricultural culture collection) 에서 분리한 상추의 균핵병에 유효한 미생물인 바실러스 서브틸리스 엠27(수탁번호 KACC 91208P)을 동결건조하여 소형 유리용기에 진공으로 보관된 엠27균주를 분양받아 TSB 함유 배지 50㎖에 넣고 37℃에서 진탕배양하였다.
<실시예 2> TSB 함유 배지(이하, 'YI 배지'라고 칭함)에 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 배양
상기 실시예 1의 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 YI 배지(sucrose 1.5%, 효모추출물 0.5%, soypeptone 0.5%, 옥수수 전분 0.3%, soybean meal 0.3%, 이인산칼 륨 0.2%, 황산마그네슘 0.04%, 적당량 증류수, NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조절하여 멸균)에 30℃로 진탕배양하여 배양액을 제조하고, YI 배지(800㎖)에 상기 실시예 1의 배양액을 10㎖ 접종하고 진탕 배양기 30℃에서 72시간 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 배양하였다.
<실시예 3> YI 배지에 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 유가배양
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 하되, YI 배지(sucrose 1.5%, 효모추출물 0.5%, soypeptone 0.5%, 옥수수 전분 0.3%, soybean meal 0.3%, 이인산칼륨 0.2%, 황산마그네슘 0.04%, 적당량 증류수, NaOH를 사용하여 pH 7.0으로 조절하여 멸균)에서 바실러스 서브틸리스 엠27균주 배양을 시작하였으며, 24시간, 48시간째 2회에 걸쳐 sucrose 1.0%, 효모추출물 0.2%, soypeptone 0.2%를 추가로 첨가하여 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 배양하였다.
<실시예 4> ZI 배지에 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 배양
상기 실시예 2와 동일한 방법으로 하되, ZI 배지(sucrose를 fructose로 대체하고, 탄소원으로 acetic acid 0.5%, 질소원으로 (NH4)2SO4 0.5%, KOH를 사용하여 pH 7.0으로 조절하여 멸균)에 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 배양하였다.
<시험예 1> 바실러스 서브틸리스 엠27의 배양 배지별 생육 측정
상기 실시예 2~4의 배양방법에 따른 바실러스 서브틸리스 엠27의 대량 배양조건에 대한 생육을 측정하였다. 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 YI 배지(실시예 2), YI 배지 유가배양(실시예 3), ZI 배지(실시예 4)에 배양한 균주의 생육을 분광광도계로 600nm에서 측정하여 비교평가 하였다. 생육의 비교평가 결과는 표1 에 나타내었다.
표1. 바실러스 서브틸리스 엠27의 배양 배지별 생육 결과
배 지 시 간 OD 값
YI 배지 (실시예 2) 48 0.462
72 0.549
YI 배지 유가배양 (실시예 3) 48 0.678
72 0.874
ZI (실시예 4) 48 0.205
72 0.222
상기 표1 과 같이, 바실러스 서브틸리스 엠27균주는 ZI 배지(실시예 4)에서는 OD값이 48시간과 72시간에서 0.205와 0.222로 매우 낮게 나타났으며, YI 배지(실시예 2)는 48과 72시간에서 0.462와 0.549로 OD값이 높게 나타났으며, YI 배지 유가배양(실시예 3)에서는 48시간과 72시간에서 0.678과 0.874로 시간이 지남에 따라 OD값이 가장 우수한 것으로 나타났다.
<시험예 2> 바실러스 서브틸리스 엠27의 배지별 생균수 측정
상기 실시예 2~4의 배양방법에 따른 바실러스 서브틸리스 엠27의 대량 배양조건에 대한 생균수를 72시간에 측정하였다. 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 엠27균주를 YI 배지(실시예 2), YI 배지 유가배양(실시예 3), ZI 배지(실시예 4)에 배양한 균주의 생균수를 비교평가하였다. 생균수의 비교평가 결과는 표2 에 나타내었다.
표2. 바실러스 서브틸리스 엠27의 배지별 생균수 측정 결과
배 지 생균수(cfu/㎖)
YI 배지 (실시예 2) 1~2×109
YI 배지 유가배양 (실시예 3) 5~9×1010
ZI 배지 (실시예 4) 1~5×107
상기 표2 와 같이, 바실러스 서브틸리스 엠27균주는 YI 배지에서 1~2×109cfu/㎖로 생균수가 낮게 나타났으며, ZI 배지에서는 1~5×107cfu/㎖로 생균수가 가장 낮게 나타났으나, YI 배지 유가배양(실시예 3)에서 5~9×1010cfu/㎖로 생균수가 높아 가장 우수한 것으로 나타났다.
따라서 상기 표1 과 표2 에서와 같이, YI 배지 유가배양은 바실러스 서브틸리스 엠27의 가장 적합한 배양배지 및 방법이라는 것으로 확인되었다.
<시험예 3> 바실러스 서브틸리스 엠27의 배양온도에 따른 생육 측정
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 하되, 배양온도를 20,30,40 및 50℃에서 180rpm으로 18시간 배양하여 바실러스 서브틸리스 엠27균주의 배양온도에 따른 균주 생육을 비교평가 하였다. 생육의 비교평가 결과는 표3 에 나타내었다.
표3. 배양 온도에 따른 균주 생육 측정 결과
온도(℃) OD 값
20 0.684
25 0.871
30 0.772
40 0.304
50 0.215
상기 표3 과 같이, 바실러스 서브틸리스 엠27균주는 20, 25와 30℃에서는 0.684, 0.871와 0.772로 높은 생육을 보였으나 40과 50℃에서는 0.304와 0.215로 생육이 현저하게 낮아진 것을 볼 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 엠27균주는 20~30℃의 온도범위에서 생육도가 높은 것으로 확인되었다.
<시험예 4> pH에 따른 균주 생육 측정
상기 실시예 3과 동일한 방법으로 하되, pH 4.0~9.0으로 각각 조절하여 배양을 실시하고 바실러스 서브틸리스 엠27균주의 pH에 따른 균주 생육을 측정하여 비교평가 하였다. 생육의 비교평가 결과는 표4 에 나타내었다.
표4. pH에 따른 균주 생육 측정 결과
pH 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0
OD값 0.601 0.653 0.742 0.850 0.712 0.635
상기 표4 와 같이, 바실러스 서브틸리스 엠27균주의 생육은 pH 5.0에서 pH 9.0까지 비교적 넓은 범위에서 높게 나타났으며, pH 7.0에서 0.850로 생육이 높게 나타났다.
따라서, 본 발명에 따른 바실러스 서브틸리스 엠27균주는 pH 7에서 생육도가 높은 것으로 확인되었다.
<시험예 5> 바실러스 서브틸리스 엠27의 상추 균핵병에 대한 방제 효과
바실러스 서브틸리스 엠27(기탁번호 KACC 91208P)의 상추 균핵병(Sclerotinia sclerotiorum)에 대한 방제 효과 시험을 하였다. 바실러스 서브틸 리스 엠27균주를 YI 배지와 YI 배지 유가배양에 접종한 다음 3일 동안 30℃, 150rpm으로 진탕배양하고 1배(원액), 3배, 9배 및 18배 희석액으로 제조한 후 잔탄 검을 100㎍/㎖ 수준으로 첨가한 후 7엽기 상추의 옆면에 분무 처리하였다. 이 후 1주일 후 2차 처리하였으며 2차 처리 7일 후에 균핵병의 발병도를 조사하였다.(도 1은 무처리, 실시예 2의 YI 배지와 실시예 3의 YI 배지 유가배양 방법으로 얻은 원액에 대한 상추 균핵병의 방제효과 비교사진이다.)
표5. 바실러스 서브틸리스 엠27의 상추 균핵병에 대한 방제 효과 결과
배 지 희석배수 방제가 (%)
YI 배지 (실시예 2) 1배 희석액(원액) 3배 희석액 9배 희석액 18배 희석액 55 43 29 14
YI 배지 유가배양 (실시예 3) 1배 희석액(원액) 3배 희석액 9배 희석액 18배 희석액 99 88 79 64
상기 표5 와 같이, YI 배지(실시예 2)와 YI 배지 유가배양(실시예 3)하여 얻은 바실러스 서브틸리스 엠27균주의 액체배양체를 각각 1배, 3배, 9배, 18배로 희석하여 분무 처리한 상추에서의 방제가는 각각 55%, 43%, 29%, 14%와 99%, 88%, 79%, 64%로 나타났다. 희석배수에 반비례하여 농도가 높을수록 방제가가 높게 나타났으며, YI 배지 유가배양(실시예 3)은 YI 배지(실시예 2)보다 균체수가 더 높아 20배 농도로 희석하였어도 상추 균핵병에 대한 방제가가 현저하게 높은 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명에 따른 YI 배지 유가배양은 YI 배지보다 상추 균핵병 억제 및 제어능력이 뛰어나 저렴한 비용으로 대량생산이 가능하고 상추 균핵병 방제효과가 우수한 것으로 확인되었다.
도 1 은 YI 배지와 YI 배지 유가배양 방법으로 얻은 바실러스 서브틸리스 엠27균주의 액체배양체 원액의 상추 균핵병의 방제효과 비교 그림이다.

Claims (7)

  1. 바실러스 서브틸리스 엠27(Bacillus subtilis M27, KACC 91208P) 균주의 배양방법에 있어서,
    수크로스 1~5%, 효모추출물 0.3~0.8%, 소이펩톤 0.3~0.8%, 옥수수 전분 0.3~1.0%, 대두박(soybean meal) 0.3~1.0%, 이인산칼륨 0.1~0.5%, 황산마그네슘 0.01~0.05%를 포함하는 배지조성에서 온도 20~30℃, pH 6.0~8.0에서 배양을 시작하고,
    추가적으로 48~72시간동안 12~24시간 간격으로 2~3회 수크로스 1~3%, 효모추출물 0.1~0.5%, 소이펩톤 0.1~0.5%를 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 바실러스 서브틸리스 엠27(Bacillus subtilis M27, KACC 91208P) 균주의 유가배양 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항의 바실러스 서브틸리스 엠27(Bacillus subtilis M27, KACC 91208P) 균주의 유가배양 방법으로 배양된 균체를 유효성분으로 하는 식물 병원균 방제 미생물 제제.
  6. 삭제
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 식물 병원균은 Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia minor, Sclerotium cepicorum, Sclerotinia sp., Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Colletotrichum gloeosporioides, Corynespora cassiicola, Didymella bryoniae, Alternaria solani, Fusarium oxysporum, 또는 Phytophotra capsici 중에 선택되는 것을 특징으로 하는 식물 병원균 방제 미생물 제제.
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