KR20110087469A

KR20110087469A - 부레옥잠 추출물에서 배양된 생균제를 주성분으로 포함하는 사료첨가제

Info

Publication number: KR20110087469A
Application number: KR1020100006903A
Authority: KR
Inventors: 윤현식; 유덕상; 안득주
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2011-08-03
Also published as: KR101182754B1

Abstract

본 발명은 부레옥잠 추출물을 이용하여 배양된 생균제 균주를 주성분으로 포함하는 가축용 사료첨가제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 환경 생태계에 영향을 주는 부레옥잠을 처리하는 방법 중의 하나로써, 부레옥잠을 전 처리하여 사료첨가제용 생균제를 배양하여, 산업적으로 많이 사용되는 미생물의 생장에 유용하다는 점을 보여줌으로써 산업적으로 사용되는 생균제 배양 배지 가격 절감에 기여할 수 있다. 또한, 본 발명의 부레옥잠 배지는 다양한 미생물에 대하여 우수한 배양배지 역할을 하며, 재조합 기술에서의 미생물 배양에도 적합하여 형질전환된 플라스미드의 안정성을 유지시킬 수 있다.

Description

부레옥잠 추출물에서 배양된 생균제를 주성분으로 포함하는 사료첨가제{Feed Additives Containing Microorganisms Cultured in Water Hyacinth Extract as Main Ingredient}

본 발명은 부레옥잠 추출물을 이용하여 배양된 생균제 균주를 주성분으로 포함하는 가축용 사료첨가제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

부레옥잠은 수생식물로서 열대지역에서 서식하는 잡초의 일종이다. 수질정화를 할 수 있다는 장점이 있으나, 과량의 산소 및 영양분 소비로 인한 빠른 성장은 주변 생태계를 파괴하고 있다. 또한, 말라리아, 주혈흡충병(bilharziosis), 사상충증(river blindness) 등과 같은 전염병을 일으킬 수 있는 미생물체의 서식지를 제공하기도 해서 위생적으로도 많은 문제점이 있다.

한편, 부레옥잠에는 조단백질, 조섬유질, 질소원, 탄소원 등 여러 영양염류들이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 최근에는 부레옥잠의 수질정화로의 이용 이외에 바이오에너지 생산을 위한 바이오매스 재원(biomass feedstock), 동물용 사료 및 사료첨가제, 땔감 및 비료, 퇴비로의 이용 등으로 그 처리방법을 다양화하고 있는 실정이다.

사료첨가용 생균제는 미생물의 형태에 따라 박테리아성, 효모성, 곰팡이성 및 혼합형으로 크게 분류할 수 있다. 박테리아성 생균제는 락토바실러스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스, 비피도박테리움, 바실러스, 박테로이데스 속의 세균 등이 이용되며, 효모성 생균제에는 주로 발효효모인 사카로미세스 속의 곰팡이가 이용되고 있다. 사료첨가용 생균제로 사용되는 균주는 하기 표 1과 같다.

사료첨가용 생균제에 사용되는 주요 균주.

분류	균주
박테리아성 균주	락토바실러스 락티스, 락토바실러스 루테리, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 살리바리우스, 락토바실러스 애시도필러스, 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 커바투스, 락토바실러스 퍼멘텀, 락토바실러스 플란타럼, 락토바실러스 헬베티쿠스, 로돕슈도모나스 캡슐레이타, 바실러스 렌투스, 바실러스 리체니포미스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 세레우스(도요이에 한함.), 바실러스 코아글란스, 바실러스 폴리프멤티쿠스, 바실러스 푸밀루스, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 비피덤, 비피도박테리움 서모필럼, 비피도박테리움 인판티스, 엔테로코커스 락티스, 엔테로코커스 써모필러스, 엔테로코커스 훼시엄, 클로스트리듐 브티리컴, 페디오코커스 세레비지아, 페디오코커스 애시디락티시
곰팡이성 균주	아스퍼질러스 나이거, 아스퍼질러스 오리제
효모성 균주	맥주효모, 토룰라효모, 제빵효모, 양조효모, 조사건조효모, 효모배양물

상기 표 1의 생균제 균주 이외에도 다양한 미생물이 생균제의 균주로 이용될 수 있으며, 균주의 특성마다 유해균의 장관 벽 부착 방지, 유기산 생산, 항균물질의 생산, 효소의 생산, 면역능력 증진, 비타민의 합성, 독성물질의 분해, 축분의 악취 방지 등의 다양한 첨가효과를 기대할 수 있다.

바실러스(Bacillus)속 미생물은 토양의 단립화를 촉진, 공기의 유통, 보수력을 좋게 하고, 근권을 양호하게 하여 수세(樹勢)를 회복시켜 식물의 면역을 촉진한다. 우수한 인산 분해 능력을 갖고, 생산량 증대, 생산물의 맛을 좋게 하며, 화훼류는 깨끗한 꽃을 피우도록 한다. 또한, 토양 중 유해미생물의 증식을 억제하고, 특히 사상균 발육저해효과가 크며, 곰팡이의 증식을 억제한다. 퇴비 만들기에도 사용할 수 있으며, 안전함으로 자연환경을 고려한 토양개량제로도 활용할 수 있는 이점이 있다. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 내열성, 바실러스 코아글란스(Bacillus coagulans)는 항생물질의 생성, 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)는 다량의 셀룰로오스 분해효소 생산, 다당류와 조단백질의 생성이라는 특성을 지니고 있으며, 특히, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)는 단백질 및 전분 분해효소 생산으로 사료이용성을 증진시키는 이점이 있다.

효모(yeast)속 미생물은 당을 발효시켜 에탄올과 이산화탄소를 생산하는 능력을 가진 것이 많아 맥주의 제조나 빵의 발효에 이용되고 있으며, 효모 자체는 값싼 지방, 단백질원으로 사료에 사용된다. 비타민 B군을 풍부하게 함유하고, 비타민 D를 함유하는 것도 있다. 최근에는 의약품 공업에도 많이 쓰이는 균주이다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 소화효소를 함유하고, 항균성을 나타내는 특성을 지니고 있으며, 특히, 기호성 및 항병력 증진과 장내 유익균을 활성화시키는 이점이 있다.

락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물은 산업적으로 유제품, 맥주, 와인, 김치 등의 생산에 사용되고 있으며, 동물사료로도 쓰이고 있다. 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)는 젖산생성 및 약한 내열성, 항생물질인 애시도필린, 락토신, 애시돌린의 생산, 락토바실러스 플란타럼은 젖산생성 및 강한 담즙 저항성, 항생물질인 락톨린의 생산, 락토바실러스 카제이는 젖산생성 및 위산 및 효소 저항성을 가지는 특성을 지니고 있다.

본 발명은 환경 생태계에 영향을 주는 부레옥잠을 처리하는 방법 중의 하나로써, 부레옥잠을 전처리하여 값싼 사료첨가용 생균제를 제조, 실제 가축에게 급여하였을 때, 가축의 비육과 소화를 촉진시키고, 항균력을 지니고 있어 가축 소화기간 내 정상 균총으로 정착할 시 유해세균의 증식을 억제하는 효과를 보일 것으로 기대되며, 더 나아가 최근 사료값 인상으로 축산농가가 위축됨을 해소할 수 있을 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 가능한 저가의 경제적인 사료첨가제를 개발하되, 다양한 미생물에서 우수한 생장 상태(최소한 기존의 사료첨가제와 비슷한 수준의 생장 상태)를 보여 줄 수 있는 범용성의 가축용 사료첨가제를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 부레옥잠의 추출물이 위와 같은 장점을 발휘할 수 있는 성분으로 개발될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 사료첨가제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 사료첨가제의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 부레옥잠 추출물에서 배양된 생균제 균주를 유효성분으로 포함하는 가축용 사료첨가제를 제공한다.

본 발명자들은 가능한 저가의 경제적인 사료첨가제를 개발하되, 다양한 미생물에서 우수한 생장 상태(최소한 기존의 사료첨가제와 비슷한 수준의 생장 상태)를 보여 줄 수 있는 범용성의 가축용 사료첨가제를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 부레옥잠의 추출물이 위와 같은 장점을 발휘할 수 있는 성분으로 개발될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 사료첨가제는 부레옥잠 추출물을 주성분으로 포함하는 배지에서 배양된 생균제 균주를 유효성분으로 포함한다.

본 명세서에서 용어 “부레옥잠 추출물”은 부레옥잠의 다양한 기관(잎, 줄기 및 뿌리)로부터 추출하여 얻은 것을 의미한다. 용어 “부레옥잠 추출물”은 본 명세서에서 부레옥잠 추출액 및 부레옥잠 원액 등의 용어와 혼용된다. 하기의 실시예에서는 부레옥잠의 잎, 줄기 및 뿌리 모두를 이용하여 부레옥잠 추출물을 얻는다.

부레옥잠 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 기계적인 방법으로서 압출기에 부레옥잠을 적용하여 부레옥잠 추출물을 얻을 수 있다.

또한, 부레옥잠 추출물은 추출용매를 사용하여 얻을 수도 있다. 예를 들어, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 헥산, (i) 디에틸에테르, 또는 (j) 부틸아세테이트를 부레옥잠에 적용하여 부레옥잠 추출물을 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 부레옥잠 추출물은 압출기에 부레옥잠을 적용하여 얻는다. 추출용매를 이용하여 부레옥잠 추출물을 얻는 경우에는, 부레옥잠 추출물에 포함되어 미생물의 배양에 이용되는 성분, 예컨대 탄소원, 질소원, 미량원소 등이 파괴되는 문제점이 있다.

본 발명의 부레옥잠 추출물은 상술한 방법을 통하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 부레옥잠 추출물에 포함된다.

본 발명의 부레옥잠 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다. 이 경우, 분말 상태로 된 부레옥잠 추출물은 사용 전에 물 또는 적합한 완충용액에 용해시켜 미생물 배지로서 사용될 수 있다.

본 명세서에서 부레옥잠을 언급하면서 사용되는 용어 “주성분”은 부레옥잠이 미생물 배지에서 에너지원, 탄소원 및 질소원으로 이용되는 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 미생물 배양에는 부레옥잠 추출물 이외에 다른 에너지원, 탄소원 및 질소원을 포함하지 않는다. 이러한 측면에서, 본 발명은 “부레옥잠 추출물을 포함하는 미생물 배양배지용 에너지원, 탄소원 또는 질소원 조성물”로 표현될 수 있다.

본 발명의 배지는 부레옥잠 추출물을 그대로 이용하거나 또는 부레옥잠 추출물에 추가적으로 물 또는 완충액을 첨가하여 이용할 수 있다.

본 발명의 배지는 다양한 미생물의 배양에 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지에 의해 배양될 수 있는 미생물은 원핵생물 또는 효모이고, 보다 바람직하게는 락토바실러스(Lactobacillus)속, 바실러스(Bacillus)속, 효모(yeast)속, 대장균, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속 또는 재조합 미생물(바람직하게는, 재조합 원핵생물)이고, 가장 바람직하게는 락토바실러스(Lactobacillus)속, 바실러스(Bacillus)속, 효모(yeast)속 또는 재조합 대장균이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 부레옥잠 추출물을 이용해 배양될 수 있는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물은 락토바실러스 액시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 브레비스(L. brevis), 락토바실러스 카제이(L. casei), 락토바실러스 코리니포미스(L. coryniformis), 락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum), 락토바실러스 김치아이(L. kimchii), 락토바실러스 무리너스(L. murinus), 락토바실러스 파라브레비스(L. parabrevis), 락토바실러스 파라플란타럼(L. paraplantarum), 락토바실러스 류테리(L. reuteri), 락토바실러스 사케이(L. sakei), 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius), 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum) 및 락토바실러스 파라카제이(L. paracasei)를 포함하며, 보다 바람직하게는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 또는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 부레옥잠 추출물을 이용해 배양될 수 있는 바실러스(Bacillus)속 미생물은 바실러스 알베이(B. alvei), 바실러스 아밀로리쿼페이션스(B. amyloliquefaciens), 바실러스 안트라시스(B. anthracis), 바실러스 시리어스(B. cereus), 바실러스 서쿨란스(B. circulans), 바실러스 글로비가이(B. globigii), 바실러스 인페르누스(B. infernus), 바실러스 라배(B. larvae), 바실러스 라테로스포루스(B. laterosporus), 바실러스 무실라기노서스(B. mucilaginosus), 바실러스 나토(B. natto), 바실러스 폴리믹사(B. polymyxa), 바실러스 슈도안트라시스(B. pseudoanthracis), 바실러스 푸미러스(B. pumilus), 바실러스 스패리쿠스(B. sphaericus), 바실러스 스포로써모듀란스(B. sporothermodurans), 바실러스 스테아로써모필러스(B. stearothermophilus), 바실러스 튜린겐시스(B. thuringiensis), 바실러스 리체니포르미스(B. licheniformis), 바실러스 코아굴런스(B. coagulans), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) 또는 바실러스 메가테리움(B. megaterium)을 포함하며, 보다 바람직하게는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 코아굴런스(Bacillus coagulans) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지에 의해 배양될 수 있는 효모(yeast)속 미생물은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 또는 스타메렐라 봄비콜라(Starmerella bombicola)을 포함하며, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)이다.

본 명세서에서 용어 “재조합 미생물”은 외래 유전자가 형질전환 되어 들어간 미생물을 의미한다.

본 발명의 부레옥잠 추출물을 이용한 생균제 배양은 다양한 미생물, 대표적으로 바실러스속 미생물, 대장균 미생물, 효모속 미생물, 스트렙토마이세스속 미생물, 락토바실러스속 미생물 및 슈도모나스속 미생물에 대해 우수한 배지 역할을 한다. 특히, 미생물의 속에 따라 종래의 배지 조성이 서로 상이하다는 점을 고려하면, 부레옥잠 단일 조성의 배지로서 모든 속의 미생물에 대하여 우수한 생장 상태를 나타내는 것은 매우 놀라운 것이다.

또한, 본 발명의 부레옥잠 배지는 재조합 미생물에 대하여도 종래의 배지와 거의 동일한 생장 상태를 나타내어, 재조합 기술에서의 미생물 배양에도 적합하고, 형질전환 되어 들어간 플라스미드의 안정성을 유지시킬 수 있다.

본 발명의 사료첨가제가 적용될 수 있는 가축은 개, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 닭, 오리, 칠면조, 거위 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 부레옥잠 추출물은 병원성균에 대해 우수한 항균활성을 가진다. 본 발명의 부레옥잠 추출물의 항균활성 테스트에 따르면, 부레옥잠 에탄올 또는 메탄올 추출물이 부레옥잠 클로로포름 추출물에 비교하여 다양한 병원성균(또는 지시균)의 저해환 크기가 큼을 확인할 수 있었다(참조: 표 8).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 병원성균은 대장균 KCTC 2571, 대장균 O157, 살모넬라 엔테리카 KCTC 1925, 스타필로코커스 아우레우스 KCCM 40881, 스타필로코커스 아루레우스 KCTC 3881, 칸디다 알비칸스 KCCM 11282, 엔테로코커스 파에칼리스 SL-5, 스트렙토코커스 뮤탄스 KCTC 3065, 스트렙토코커스 산구이니스 KCTC 5293 또는 비브리오 프로테올리티쿠스 KCCM 11992이며, 보다 바람직하게는 대장균 KCTC 2571, 살모넬라 엔테리카 KCTC1925 또는 칸디다 알비칸스 KCCM 11282이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 부레옥잠으로부터 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 가축용 사료첨가제의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 부레옥잠으로부터 추출물을 수득하는 것은 압출기에 부레옥잠을 적용하여 실시된다.

압출기를 이용하여 부레옥잠 추출물을 제조하는 경우, 바람직하게는, 본 발명의 방법은 (a) 압출기에 부레옥잠을 적용하여 액상의 추출액 및 고상의 잔사를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 액상의 추출액 및 고상의 잔사를 혼합한 다음 산 또는 알칼리 처리하여 조직을 연질화 시키고 부레옥잠의 성분들을 추출하는 단계를 포함한다.

본 발명에 이용되는 산 또는 알칼리는 당업계에서 통상적으로 알려진 어떠한 것도 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 산은 황산, 염산, 과염소산, 옥화수소산, 브롬화수소산 및 질산과 같은 강산, 아세트산, 시트르산, 붕산 및 인산과 같은 약산을 포함하며, 가장 바람직하게는 황산 및 염산이다.

본 발명에 이용되는 바람직한 알칼리는, 수산화나트륨, 수산화칼슘, 수산화칼륨, 수산화바륨, 수산화세슘, 수산화스트론튬, 수산화리튬, 수산화루비듐 및 수산화마그네슘과 같은 강알칼리, 암모니아 및 피리딘과 같은 약알칼리를 포함하며, 가장 바람직하게는 수산화나트륨 및 수산화칼슘이다.

산 또는 알칼리의 사용량은 바람직하게는 부레옥잠에 대하여 0.05-10 wt%, 보다 바람직하게는 0.05-5 wt%, 가장 바람직하게는 0.1-1 wt%이다.

산 또는 알칼리 처리에 의해, 부레옥잠의 조직이 연질화 되며 부레옥잠의 성분들(에너지원, 탄소원 및 질소원으로서의 단백질 및 당 성분들)이 추출되며 이에 의해 생균제 배지의 에너지원, 탄소원 및 질소원이 공급된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b) 이후에 단계 (b)의 결과물을 압출기에 다시 적용하여 액상의 추출액을 수득하는 단계 (c)를 추가적으로 포함하며, 이 액상의 추출액을 생균제 배지로 이용한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b) 및 단계 (c) 사이에 단계 (b)의 결과물을 냉장보관(바람직하게는 1-10℃, 보다 바람직하게는 2-8℃, 가장 바람직하게는 4℃)하는 단계를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (b)의 결과물 또는 단계 (c)의 결과물을 미생물 배지로 사용하기 전에 pH를 조절하는 단계를 추가적으로 포함한다. 미생물 종마다 생장에 적합한 최적 pH(optimum pH) 값을 가지고 있다. pH 조절은 산 또는 알칼리 물질을 이용하여 조절할 수 있다.

본 발명에 따르면, 매우 간단한 공정을 통하여 우수한 미생물 생장력 및 기존 미생물 배지 대체 배지를 매우 경제적으로 얻을 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 부레옥잠 추출물을 이용하여 배양된 생균제 균주를 주성분으로 포함하는 가축용 사료첨가제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

(b) 본 발명은 환경 생태계에 영향을 주는 부레옥잠을 처리하는 방법 중의 하나로써, 부레옥잠을 전처리하여 사료첨가제용 생균제를 배양하여, 산업적으로 많이 사용되는 미생물의 생장에 유용하다는 점을 보여줌으로써 산업적으로 사용되는 생균제 배양 배지 가격 절감에 기여할 수 있다.

(c) 본 발명의 부레옥잠 배지는 다양한 미생물에 대하여 우수한 배양배지 역할을 하며, 재조합 기술에서의 미생물 배양에도 적합하여 형질전환된 플라스미드의 안정성을 유지시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 균주 배양액을 함유하는 사료첨가제를 제조하는 공정도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 부레옥잠의 성분 분석

본 발명자들은 부레옥잠의 수분, 중금속 함량(Pb, Cd, As, Cr), 주요원소(C, H, O, N, S), 조단백질, 조지방, 조섬유, 조회분, NDF(Neutral detergent fiber, 중성세제불용성섬유) 및 ADF(Acid detergent fiber, 산성세제불용성섬유) 성분을 분석하였다.

부레옥잠의 수분 함량을 분석하기 위해서, 부레옥잠의 잎, 줄기, 뿌리별로 10 g씩 채취하여 초저온냉동기(deep freezer)에 하루 동안 보관하였다. 이후, 동결건조기(freezer dryer)를 이용하여 동결건조를 실시하고 건조중량을 측정하였다(참조: 표 2). 중금속의 경우, 부레옥잠의 잎, 줄기, 뿌리 시료 1 g을 각각 63%(w/v) HNO₃와 60%(w/v) HClO₄와 혼합하여 200℃에서 전처리를 한 후, ICP-OES(Optima 7300DV, Perkin Elmer, USA)를 이용하여 분석하였다(참조: 표 3). 부레옥잠의 부위별 주요 원소분석(C, H, O, N, S)은 잎, 줄기, 뿌리를 각각 동결건조 후, 파우더 형태로 분쇄하여 EA(FLASH EA 1112 Series, Thermo, USA)를 이용하여 분석하였으며(참조: 표 4), 조단백질, 조지방, 조섬유, 조회분, NDF 및 ADF는 파우터 형태의 부레옥잠 시료를 한국단미사료협회에 의뢰하여 분석하였다(참조: 표 5).

부레옥잠의 부위별 수분 함량.

부위	동결건조 전	동결건조 후	수분 함량
잎	10 g	0.94 g	90.6%(w/w)
줄기	10 g	0.49 g	95.1%(w/w)
뿌리	10 g	0.67 g	93.3%(w/w)

사료 내 유해물질 범위 및 기준과 부레옥잠의 부위별 중금속 함량.

유해물질	사료의 종류			허용기준	부레옥잠
납 (Pb)	배합사료	프리믹스사료		30 ppm	① 잎 : 0.936 ppm ② 줄기 : 0.907 ppm ③ 뿌리 : 0.799 ppm
		기타 배합사료		10 ppm
	단미사료	동물성단백질류		10 ppm
		알파파, 건초		10 ppm
		곡물류, 식물성단백질류, 남은음식물사료		20 ppm
		동물성무기물류, 광물성 (식염류 제외)		30 ppm
카드뮴 (Cd)	배합사료	프리믹스사료		50 ppm	① 잎 : 0 ppm ② 줄기 : 0 ppm ③ 뿌리 : 0 ppm
		기타 배합사료 (기타동물 및 어류용은 제외)		1.0 ppm
	단미사료	곡물류, 식물성 단백질류, 어분(배합사료 원료용은 제외), 남은음식물사료		2.5 ppm
		광물성 (식염류는 제외)		50 ppm
비소 (As)	배합사료	프리믹스사료		12 ppm	① 잎 : 0 ppm ② 줄기 : 0 ppm ③ 뿌리 : 0 ppm
		어류용 배합사료		10 ppm
		기타 배합사료		2 ppm
	단미사료	광물성 (식염류는 제외)		40 ppm
크롬 (Cr)	배합사료	전체 배합사료 (프리믹스사료 제외)		100 ppm	① 잎 : 0.234 ppm ② 줄기 : 0.843 ppm ③ 뿌리 : 5.289 ppm
	단미사료	동물성 단백질류	어분 및 어즙흡착사료	100 ppm
			우모분육본육골분 및 동물성단백질 혼합물	300 ppm
			피혁가공부산물	1,000 ppm
		동물성무기물		100 ppm

부레옥잠의 부위별 주요 원소 함량.

원소명	잎 (%)	줄기 (%)	뿌리 (%)
질소	1.83± 0.03	0.82± 0.01	0.96± 0.00
탄소	40.13± 0.07	37.15± 0.01	39.24± 0.07
수소	5.57± 0.01	5.45± 0.09	5.82± 0.12
산소	39.38± 0.19	39.49± 0.17	41.46± 0.07
황	0.0	0.0	0.0

부레옥잠의 부위별 조단백질, 조지방, 조섬유, 조회분, NDF 및 ADF 함량.

	잎(%)	줄기(%)	뿌리(%)
조단백질	10.99	11.19	5.92
조지방	2.40	0.95	0.94
조섬유	14.09	20.97	27.37
조회분	11.39	21.75	8.06
NDF	48.08	45.69	63.30
ADF	18.24	28.35	30.57

실시예 2: 부레옥잠에서의 원액 성분 추출

본 발명은 부레옥잠을 알칼리 처리를 하고, 압출기를 이용 원액을 획득하였다. 보다 상세하게는, 최초 부레옥잠을 잎, 줄기, 뿌리부분으로 분리하였다. 흐르는 물에 깨끗이 씻은 후, 압출기를 이용 고상, 액상부분으로 분리하였다. 고상과 액상부분을 다시 섞은 후, 알칼리 처리를 하여 조직을 연질화시켰다. 사용한 알칼리는 수산화칼슘과 수산화나트륨을 사용하는 것이 바람직하며, 수산화나트륨을 사용하는 것이 좀 더 바람직하다. 알칼리는 부레옥잠 무게비로 0.1%에서 1% 사이로 처리하는 것이 바람직하며, 0.5%로 처리하여 사용하는 것이 좀 더 바람직하다. 알칼리 처리 후, 12시간에서 24시간 동안 냉장 보관(4℃)하였다. 다시 압출기를 이용, 알칼리 처리된 것을 액상부분만 분리하여 미생물 배양배지로 사용하였다(참조: 도 1).

실시예 3: 부레옥잠 추출물의 원가 검토

한편, 부레옥잠을 이용, 제조된 사료첨가용 생균제의 경제성을 측정하기 위해 부레옥잠 추출물의 원가를 검토하였다. 통상 부레옥잠을 압출기를 이용, 액상부분만을 분리할 경우 1 kg 당 약 600 ml 정도 획득할 수 있다. 또한, 국내에서 재배되는 부레옥잠의 경우 1톤 당(수분 20% 제거) 가격이 약 10만원이다. 상기의 정보를 감안했을 때, 부레옥잠에서 추출된 원액은 리터당 약 200원이다.

실험예 1: 부레옥잠 추출물에서의 사료첨가용 생균제 균주의 생균수 측정

부레옥잠을 전처리한 후, 사료첨가용 생균제에 사용되는 균주의 생육 상태를 조사해 보았다. 본 발명자는 사료첨가용 생균제에 사용되는 균주 중 락토바실러스 속, 바실러스 속, 효모 속 미생물을 사용하였다. 알칼리 처리 후, 압출기를 이용 액상부분만 분리하였다. 250 ml 플라스크에 50 ml씩 분주를 하였으며, 고온습식 멸균(121℃, 15분)을 하고 최종 수소이온 농도는 3 M NaOH 및 3 M H₂SO₄를 이용하여 보정하였다.

락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물로는 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)를 사용하였으며, 전배양에 사용된 배지는 MRS 배지(OMG, 한국)를 사용하였다(참조: 표 6). 전배양은 MRS 배지 5 ml(테스트 튜브)에 1%로 접종하여 37℃, 정치 배양하였으며, 본배양은 부레옥잠 유래 배지 50 ml(cap test tube)에 상기 배양 조건과 동일하게 1일 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액 1 ml를 회수하여 연속적 희석(serial dilution)을 수행하였으며, MRS 한천배지에 도말을 하여 생균수를 측정하였다(참조: 표 7).

바실러스(Bacillus)속 미생물로는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 코아굴런스(Bacillus coagulans), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 사용하였으며, 전배양에 사용된 배지는 LB 배지(OMG, 한국)를 사용하였다(참조: 표 6). 전배양은 LB 배지 5ml(test tube)에 1%로 접종하여 30℃, 250 rpm으로 배양하였으며, 본배양은 부레옥잠 유래 배지 50 ml (250 ml 플라스크)에 상기 배양 조건과 동일하게 1일 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액 1 ml를 회수하여 연속적 희석(serial dilution)을 수행하였으며, LB 한천배지에 도말을 하여 생균수를 측정하였다(참조: 표 7).

효모(yeast)속 미생물로는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하였으며, 전배양에 사용된 배지는 YM 배지(OMG, 한국)를 사용하였다(참조: 표 6). 전배양은 YM 배지 5 ml(테스트 튜브)에 1%로 접종하여 30℃, 200 rpm으로 배양하였으며, 본배양은 부레옥잠 유래 배지 50 ml(250 ml 플라스크)에 상기 배양 조건과 동일하게 1일 내지 2일 동안 배양하였다. 배양 후, 배양액 1 ml를 회수하여 연속적 희석(serial dilution)을 수행하였으며, YM 한천배지에 도말을 하여 생균수를 측정하였다(참조: 표 7).

발명에 사용된 균주의 전배양을 위해 사용된 배지의 조성 및 배양조건.

균주	배지 조성	배양조건
락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물	MRS 배지 (배지 1리터 당)	정치배양 37℃, pH 7.0
	글루코즈 20 g, 프로테오즈 펩톤 10 g, 비프 추출물 10g, 효모 추출물 5 g, 트윈-80 1 g, 암모늄 시트레이트 2.0 g, 소디움 아세테이트 5.0 g, 디포타슘 포스페이트 2 g, 마그네슘 설페이트 0.1 g, 망간네이즈 설페이트 0.05 g
바실러스(Bacillus)속 미생물	LB 배지 (배지 1리터 당)	진탕배양 30℃, pH 7.0
	트립톤 10.0 g, 염화나트륨 5.0 g, 효모 추출물 5.0 g
효모(yeast)속 미생물	YM 배지 (배지 1리터 당)	진탕배양 30℃, pH 5.0
	효모 추출물 3.0 g, 말트 추출물 3.0 g, 펩톤 5.0 g, 글루코오스 10.0 g

부레옥잠 추출물에서의 사료첨가용 생균제 균주의 생균수 측정.

균주		생균수 (CFU/ml)		생균제 생균수 (CFU/ml)
락토바실러스 ( *Lactobacillus* )속 미생물	락토바실러스 파라카세이 KLB 58	8.00× 10⁷	1.35× 10⁸	1.00× 10⁶
	락토바실러스 퍼멘텀 ATCC 23271	1.05× 10⁸	1.76× 10⁸
	락토바실러스 카세이 ATCC 393	9.35× 10⁷	1.00× 10⁸
	락토바실러스 플란타럼 ATCC 14917	6.15× 10⁷	5.20× 10⁷
바실러스 ( *Bacillus* ) 속 미생물	바실러스 서브틸리스 IB101	8.40× 10⁸	2.55× 10⁹
	바실러스 리체니포르미스 KCCM 11237	2.20× 10⁸	1.04× 10⁹
	바실러스 코아굴란스 KCCM 11715	2.10× 10⁸	2.72× 10⁸
효모 (yeast) 속 미생물	사카로미세스 세레비지에 KCTC 7928	3.69× 10⁷	3.94× 10⁷

실험예 2: 부레옥잠 부위별 항균활성 측정

본 발명자는 부레옥잠의 항균효과를 확인하기 위해서 항균활성 테스트를 수행하였다. 구체적으로는, 항균 활성 테스트는 아가 확산 방법(Agar Diffusion Method; Kirby-Bauer test)을 기초로 실시하였으며, 아가 배지(1.5% 아가, 180 ml)에 병원성균 배양액(OD = 1로 보정) 1 ml를 혼합하여 바이오어세이 4각 디쉬(square bioassay dishes; 245 mm * 245 mm)에 분주하였다. 1~2시간 정도 실온에서 보관하여 고체화를 시킨 후, 유리 파스테르 파이펫을 이용하여 고체화된 아가 배지에 구멍을 만들었다. 그 후, 준비된 부레옥잠 유기용매 추출물(1/50 농축) 50 ㎕를 구멍에 로딩하였다. 각각의 병원성균 생존 온도를 유지하면서 12~24시간 동안 배양한 후 생성된 저해환을 관찰하여 항균활성 정도를 비교하였으며, 대조군은 암피실린(Sigma) 100 ppm을 사용하였다(참고: 표 8).

부레옥잠 부위별 항균활성 측정.

지시균	저해환 크기(mm)
	Amp. (100ppm)	클로로포름 추출물 (1/50 농축)			에탄올 추출물 (1/50 농축)			메탄올 추출물 (1/50 농축)
	Amp. (100ppm)	잎	줄기	뿌리	잎	줄기	뿌리	잎	줄기	뿌리
대장균 KCTC 2571	27.5± 0.0	0.0± 0.0	0.0± 0.0	0.0± 0.0	6.8± 0.2	6.0± 0.0	5.7± 0.2	7.0± 0.0	0.0± 0.0	6.3± 0.3
대장균 O157	31.5± 0.0	6.3± 0.2	6.0± 0.0	6.5± 0.0	13.0± 0.0	8.3± 0.2	9.7± 0.3	16.0± 0.0	7.2± 0.2	13.0± 0.0
살모넬라 엔테리카 KCTC 1925	37.0± 0.0	0.0± 0.0	0.0± 0.0	0.0± 0.0	5.8± 0.2	7.5± 0.3	5.8± 0.2	6.0± 0.0	5.5± 0.0	6.5± 0.0
스타필로코커스 아우레우스 KCCM 40881	17.0± 0.0	6.0± 0.0	5.7± 0.2	6.2± 0.2	18.5± 0.8	11.0± 0.0	10.8± 0.4	20.2± 0.6	5.8± 0.2	11.7± 1.2
스타필로코커스 아우레우스 KCTC 3881	53.0± 0.0	6.0± 0.0	3.7± 1.8	6.3± 0.2	12.7± 0.2	10.2± 0.2	10.8± 0.3	12.8± 0.2	8.8± 0.2	11.2± 0.2
칸디다 알비칸스 KCCM 11282	0.0± 0.0	0.0± 0.0	0.0± 0.0	0.0± 0.0	5.2± 0.2	5.0± 0.2	5.2± 0.2	6.3± 0.2	5.0± 0.0	5.3± 0.3
엔테로코커스 파에칼리스 SL-5	35.0± 0.0	9.3± 0.3	14.3± 0.3	11.0± 0.0	22.0± 0.0	9.0± 0.0	9.8± 0.4	24.0± 0.0	14.3± 0.2	6.3± 0.2
스트렙토코커스 뮤탄스 KCTC 3065	42.0± 0.0	5.8± 0.2	0.0± 0.0	6.0± 0.0	16.3± 0.2	5.3± 0.2	15.7± 0.2	15.8± 0.2	5.5± 0.0	15.7± 0.4
스트렙토코커스 산구이니스 KCTC 5293	35.0± 0.0	7.3± 0.2	6.7± 0.2	6.2± 0.2	6.7± 0.2	5.3± 0.2	7.2± 0.2	12.2± 0.6	5.5± 0.0	15.7± 0.4
비브리오 프로테올리티쿠스 KCCM 11992	57.0± 0.0	10.5± 0.0	9.3± 0.2	0.0± 0.0	10.3± 0.3	6.0± 0.0	10.8± 0.2	11.0± 0.0	9.3± 0.3	9.0± 0.0

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

부레옥잠 추출물에서 배양된 생균제 균주를 유효성분으로 포함하는 가축용 사료첨가제.
제 1 항에 있어서, 상기 부레옥잠 추출물은 잎, 줄기 또는 뿌리로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 1 항에 있어서, 상기 부레옥잠 추출물은 병원성균에 대한 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 3 항에 있어서, 상기 병원성균은 대장균 KCTC 2571, 대장균 O157, 살모넬라 엔테리카 KCTC1925, 스타필로코커스 아우레우스 KCCM 40881, 스타필로코커스 아루레우스 KCTC 3881, 칸디다 알비칸스 KCCM 11282, 엔테로코커스 파에칼리스 SL-5, 스트렙토코커스 뮤탄스 KCTC 3065, 스트렙토코커스 산구이니스 KCTC 5293 또는 비브리오 프로테올리티쿠스 KCCM 11992인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 1 항에 있어서, 상기 생균제 균주는 락토바실러스(Lactobacillus)속, 바실러스(Bacillus)속, 효모(yeast)속 및 재조합 미생물로 구성된 군으로부터 선택되는 미생물인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 5 항에 있어서, 상기 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 또는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 5 항에 있어서, 상기 바실러스(Bacillus)속 미생물은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 코아굴런스(Bacillus coagulans) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
제 5 항에 있어서, 상기 효모(yeast)속 미생물은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
부레옥잠으로부터 추출물을 수득하는 단계를 포함하는 가축용 사료첨가제의 제조방법.
제 9 항에 있어서, 상기 부레옥잠으로부터 추출물을 수득하는 것은 압출기에 부레옥잠을 적용하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a) 압출기에 부레옥잠을 적용하여 액상의 추출액 및 고상의 잔사를 수득하는 단계; 및
(b) 상기 액상의 추출액 및 고상의 잔사를 혼합한 다음 산 또는 알칼리 처리하여 조직을 연질화 시키고 부레옥잠의 성분들을 추출하는 단계.
제 11 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b) 이후에 단계 (b)의 결과물을 압출기에 다시 적용하여 액상의 추출액을 수득하는 단계 (c)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b) 및 단계 (c) 사이에 단계 (b)의 결과물을 냉장보관(4℃) 하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (b)의 결과물 또는 단계 (c)의 결과물을 생균제 배지로 사용하기 전에 pH를 조절하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 단계 (b)에 사용되는 물질은 알칼리 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 항에 있어서, 상기 알칼리 물질은 수산화칼슘 또는 수산화나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.