KR20160026263A

KR20160026263A - 양식어류용 사료 조성물 및 이를 이용하여 양식시킨 양식어류

Info

Publication number: KR20160026263A
Application number: KR1020140114430A
Authority: KR
Inventors: 장준환; 이건; 고대균; 배승철
Original assignee: (주)동창
Priority date: 2014-08-29
Filing date: 2014-08-29
Publication date: 2016-03-09
Also published as: KR101670955B1

Abstract

본 발명은 양식어류용 사료 및 이를 이용하여 양식한 양식어류에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로 설명하면, 기존에 어류 양식시 사용한 항생제를 대체할 수 있는 복합생균제를 도입한 양식어류용 사료제에 관한 것이다

Description

양식어류용 사료 조성물 및 이를 이용하여 양식시킨 양식어류{Feed for farming-fish and Farming-fish farmed using that}

본 발명은 양식어류용 사료 및 이를 이용하여 양식한 양식어류에 관한 것으로서, 기존에 어류 양식시 사용한 항생제를 대체할 수 있는 양식어류용 보조사료제에 관한 것이다.

인류의 늘어나는 수산물 소비량을 충당하기 위해 수산양식은 고밀도 사육을 통한 대량생산에 초점이 맞춰지고 있다. 그러나, 인위적인 고밀도 양식 시스템에 의해 양식생물은 다양한 형태의 스트레스(고밀도사육, 물리적 장애, 수질악화)에 노출되었고(Wendelaar Bonga, 1997), 그에 따른 여러 가지 질병에 감염되어 집단폐사로 이어졌다.

양식어류의 질병 대책으로서는 미연 방지보다 질병 발생 후에 항생제 및 여러 종류의 화학약품을 사용하고 있으며, 이와 같은 약제의 남용은 어류에게 스트레스를 주어 면역반응을 감소시킬 뿐만 아니라, 환경오염 및 병원체의 내성 증가 문제와 나아가서는 인체에도 영향을 줄 수 있는 가능성 등 많은 문제점을 야기하고 있다(Park, 2004). 이러한 이유로 최근 정부에서는 2011년 7월 1일부터 양어사료와 모든 동물사료에 수의사의 처방 이외에는 항생제를 사용하지 못하도록 법으로 규제 하였으며(농림수산식품부 2011), 점차적으로 양식 어류의 질병관리뿐만 아니라, 양어장 내 유입수와 배출수의 관리 등 안전한 양식어패류 생산을 위한 양식장의 위생 관리 조건을 강화할 계획에 있다.

배합사료 내 항생제의 사용이 제한적으로 금지됨에 따라 항생제를 대체할 천연 사료첨가제의 개발이 필요한 상황이다. 또한, 소비자들의 수산 식품안정성에 불신과, 유기양식 및 유기수산을 지향하는 정책 등에 의하여 항생제 대체용 친환경소재의 사료첨가제에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

생균제란, 동물 또는 사람이 섭취하였을 때 장내 토착미생물들의 특성을 향상시켜 숙주에게 유익한 영향을 주는 살아있는 단종 또는 혼합된 균주들로 정의된다. 이러한 균주들의 발효 산물인 유산과 초산은 발암물질의 생성을 억제하고, 장을 산성화하여 유해균의 발육을 저하시켜 상대적으로 유산균들의 생존율을 높이는 것으로 알려져있다(Lee, 2008). 그리고 생균제가 사료나 사육수를 통해서 제공 되었을 때 양식어류의 건강에 긍정적 영향을 미친다고 보고된 바 있으며(Ai et al., 2011), 양식어류의 사료이용률 향상, 장내 적정 미생물 분포조절, 면역력 강화 등 병원균의 길항작용에 긍정적으로 작용한다는 것이 많은 실험에 의해 밝혀지고 있다(Balcar et al., 2006; Irianto and Austin, 2002; Kesarcodi-Watson et al., 2008; Merrifield et al., 2010; Nayak, 2010; Wang et al., 2008). 그리고, 최근 연구에 의하면, 유용균주의 성질에 따라 특정 유해균만을 저해하는 종 특이성을 가지고 있기 때문에 복합생균제를 사용했을 때 좀더 넒은 범위의 질병 저항성을 높일 수 있다고 보고하였다(Chapman, 2014).

최근 항균제를 대체하여, 항균활성을 갖는 균주를 이용한 어류 양식용 사료 첨가제, 또는 양식 어류용 사료에 대한 개발이 지속되고 있으며, 일례로, 바실러스 속 KR-OF1 균주를 이용한 기술이 공지된 바 있으며, 녹차 추출물을 이용한 양식 어류용 사료에 대한 개발이 된 바 있으나, 항생제를 대체할만한 효과를 보지 못하는 문제가 있다.

대한민국 공개특허 10-2014-0091988(공개일 : 2014.07.23) 대한민국 공개특허 10-2012-0138181(공개일 : 2012.12.24)

본 발명자들은 항생제를 대체할 수 있는 양식어류용 사료를 개발하고자 노력한 결과, 특정 균주들의 혼합균주를 생균제로서 사료에 도입하면 송어 등의 양식어류의 면역력 향상을 통해 질병에 대한 저항성을 높여서, 항생제 대체제로써 환경친환적이며, 지속가능한 유기수산양식 가능함을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다. 즉 본 발명은 양식어류용 사료 및 이를 이용하여 양식시킨 양식어류를 제공하고자 한다.

본 발명은 양식어류용 사료에 관한 것으로서, 기초사료; 및 복합생균제를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 복합생균제는 바실러스 라이케니포미스균(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스균(Bacillus subtilis), 페니바실러스 폴리믹사균(Paenibacillus polymyxa), 아스퍼질러스 오리자에균(Aspergillus oryzae) 및 사카로미세스 세레비시아균(Sacchromyces cerevisiae)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 복합생균제는 바실러스 라이케니포미스균 1×10⁷ ~ 8×10⁸cfu/㎏, 바실러스 서브틸리스균 5×10⁷ ~ 1×10⁹cfu/㎏, 페니바실러스 폴리믹사균 5×10⁷ ~ 1×10⁹cfu/㎏, 아스퍼질러스 오리자에균 1×10⁸ ~ 5×10⁹cfu/㎏ 및 사카로미세스 세레비시아균 1×10⁸ ~ 5×10⁹cfu/㎏로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 양식어류용 사료는 상기 기초사료 100 중량부에 대하여, 상기 복합생균제를 0.1 ~ 5 중량부로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 양식어류용 사료에 있어서, 상기 기초사료는 어분, 대두박, 밀글루텐(wheat gluten meal), 혈분(blood meal), 오징어간 분말(Squid liver powder), 밀가루(wheat flour), 어유(fish oil), 비타민 프리믹스(vitamin premix) 및 미네랄 프리믹스(mineral premix) 및 셀룰로오스를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 양식어류용 사료에 있어서, 상기 기초사료는 어분 25 ~ 35 중량%, 대두박 8 ~ 15 중량%, 밀글루텐 5 ~ 10 중량%, 혈분 4 ~ 8 중량%, 오징어간 분말 3 ~ 7 중량%, 밀가루 20 ~ 30 중량%, 어유 8 ~ 14 중량%, 비타민 프리믹스 1 ~ 3 중량% 및 미네랄 프리믹스 1 ~ 3 중량% 및 셀룰로오스 0.1 ~ 1 중량%를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명의 양식어류용 사료 성분인 기초사료에 있어서, 상기 비타민 프리믹스는 비타민 프리믹스 1kg 당 아스코르빈산(Ascorbic acid) 250 ~ 350 mg/kg, dl-판토텐산칼슘(dl-Calcium pantothenate) 120 ~ 180 mg/kg, 콜린 바이테이트(choline bitate) 2,800 ~ 3,300 mg/kg, 이노시톨(Inositol) 120 ~ 180 mg/kg, 메나디온 3 ~ 10 mg/kg, 나이아신(Niacin) 100 ~ 200 mg/kg, 피리독신하이드로클로라이드(Pyridoxine·HCl) 10 ~ 30 mg/kg, 리보플라빈(Rivoflavin) 20 ~ 50 mg/kg, 티아민모노나이트레이트(Thiamine mononitrate) 5 ~ 30 mg/kg, dl-α-토코페롤아세테이트(dl-α-Tocopherol acetate) 100 ~ 300 mg/kg, 레티닐 아세테이트(Retinyl acetate) 2 ~ 10 mg/kg, 바이오틴(Biotin) 0.5 ~ 5 mg/kg, 엽산(Folic acid) 2 ~ 10 mg/kg 및 코발아민(Cobalamin) 0.01 ~ 0.5 mg/kg의 농도로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명의 양식어류용 사료 성분인 기초사료에 있어서, 상기 미네랄 프리믹스는 미네랄 프리믹스 1kg 당 NaCl 400 ~ 500 mg/kg, MgSO₄·H₂O 1200 ~ 1500 mg/kg, ZnSO₄·H₂O 200 ~ 250 mg/kg, Fe-시트레이트(Fe-Citrate) 250 ~ 350 mg/kg, MnSO₄ 0.005 ~ 0.050 mg/kg, FeSO₄ 0.0100 ~ 0.1000 mg/kg, CuSO₄ 0.00010 ~ 0.00100 mg/kg, 칼슘이오데이트(Calciumiodate) 0.0001 ~ 0.0050 mg/kg, MgO 0.00050 ~ 0.00500 mg/kg 및 NaSeO₃ 0.00005 ~ 0.00100 mg/kg의 농도로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 양식어류용 사료에 있어서, 상기 양식어류는 송어 또는 넙치인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 어류를 양식하는 방법에 관한 것으로서, 앞서 설명한 다양한 형태의 양식어류용 사료로 어류를 양식하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명은 양식어류에 관한 것으로서, 앞서 설명한 다양한 형태의 양식어류용 사료 및/또는 양식방법에 의해 양식시킨 양식어류인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 앞서 설명한 양식어류는 송어, 넙치, 메기 또는 뱀장어 중에서 선택된 1종일 수 있으며, 바람직하게는 송어 또는 넙치일 수 있고, 더욱 바람직하게는 무지개송어일 수 있다.

본 발명의 복합생균제를 함유한 양식어류용 사료는 양식어류의 장내에서 분비효소, 유기산, 비타민 및 무독성 향균물질 등을 분비를 촉진하여 유해균의 장점막 부착을 막는 경쟁적억제제로 작용할 수 있는 바, 어류의 성장과, 사료섭취 및 비특이적 면역반응을 개선시키는 효과를 성장과 면역을 증강시킬 수 있기 때문에, 기존의 항생제 대체시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에서 수행한 무지개송어 사육에 사용된 파일럿 플랜트(pilot plant)를 찍은 사진이다.

송어인 일종인 무지개송어는 1965년 미국으로부터 들여온 냉수성 어종으로, 일찍이 종묘생산 기술이 확립되었고, 질병에 대한 내성이 강하며, 광온성 어종으로 사육관리가 용이하여 국내 주요 양식 대상종으로 각광받는 종이다. 송어 양식은 1970년대부터 꾸준한 생산증대로 2013년에는 국내 담수어 양식의 총 생산량인 20,461톤 중 3,390톤으로 뱀장어, 메기 다음으로 많이 생산되고 있다(KOSTAT, 2014).

생균제란, 살아있는 미생물 균체를 섭취함으로써 미생물이 분비하는 효소, 유기산, 비타민 및 무독성 항균물질 등에 의한 정상 장내 세균총의 균형을 유지하고 병원성 세균의 증식을 억제하는데 중요한 역할을 담당한다. 따라서 일반적으로 사육하는 동물의 장내 안정을 위하여 유익한 미생물을 사료에 섞어 공급하고 있다. 주로 사용되는 유익 미생물은 Lactobacillus 속, Bifidobacterium 속, Clostridium 속, Bacillus 속 등이다. 이들 미생물은 젖산(lactic acid)을 생성하여 장내 유해 미생물의 사멸 및 증식억제 효과가 있는 것으로 알려져 있어 소화력 증진 및 면역력 증대 등의 목적으로 널리 사용되고 있는 물질이다.

본 발명은 이와 같은 생균제를 양식사료 성분으로 도입한 발명에 관한 것으로서, 본 발명의 양식사료는 특정 균을 도입한 복합생균제를 포함하는 것을 특징으로 하며, 이하 이에 대해서 더욱 자세하게 설명을 한다.

본 발명은 양식어류용 사료에 관한 것으로서, 기초사료; 및 복합생균제를 포함 수 있다.

본 발명 성분 중 하나인 상기 복합생균제는 바실러스 라이케니포미스균(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스균(Bacillus subtilis), 페니바실러스 폴리믹사균(Paenibacillus polymyxa), 아스퍼질러스 오리자에균(Aspergillus oryzae) 및 사카로미세스 세레비시아균(Sacchromyces cerevisiae) 중에서 선택된 3종 이상을, 바람직하게는 5종 모두를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

그리고, 상기 복합생균제는 바실러스 라이케니포미스균 1×10⁷ ~ 8×10⁸cfu/㎏, 바실러스 서브틸리스균 5×10⁷ ~ 1×10⁹cfu/㎏, 페니바실러스 폴리믹사균 5×10⁷ ~ 1×10⁹cfu/㎏, 아스퍼질러스 오리자에균 1×10⁸ ~ 5×10⁹cfu/㎏ 및 사카로미세스 세레비시아균 1×10⁸ ~ 5×10⁹cfu/㎏로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 라이케니포미스균 1×10⁸ ~ 6×10⁸cfu/㎏, 바실러스 서브틸리스균 1×10⁸ ~ 5×10⁸cfu/㎏, 페니바실러스 폴리믹사균 8×10⁷ ~ 5×10⁸cfu/㎏, 아스퍼질러스 오리자에균 8×10⁸ ~ 5×10⁸cfu/㎏ 및 사카로미세스 세레비시아균 5×10⁸ ~ 3×10⁹cfu/㎏로 포함할 수 있다.

본 발명의 양식어류용 사료는 상기 기초사료 100 중량부에 대하여, 상기 복합생균제를 0.1 ~ 5 중량부로, 바람직하게는 0.3 ~ 2 중량부로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 이때, 복합생균제를 0.1 중량부 미만으로 포함하면 항균 활성 효과 등이 떨어지는 문제가 있을 수 있고, 2 중량부를 초과하여 사용하더라도 사용량 증가에 따른 항균 활성 효과 증대가 없는 바, 비경제적인 문제가 있다.

그리고, 상기 기초사료는 어분 25 ~ 35 중량%, 대두박 8 ~ 15 중량%, 밀글루텐 5 ~ 10 중량%, 혈분 4 ~ 8 중량%, 오징어간 분말 3 ~ 7 중량%, 밀가루 20 ~ 30 중량%, 어유 8 ~ 14 중량%, 비타민 프리믹스 1 ~ 3 중량% 및 미네랄 프리믹스 1 ~ 3 중량% 및 셀룰로오스 0.1 ~ 1 중량%를 포함하는 것을, 바람직하게는 어분 28 ~ 32 중량%, 대두박 10 ~ 12 중량%, 밀글루텐 6 ~ 8 중량%, 혈분 5 ~ 7 중량%, 오징어간 분말 5 ~ 6 중량%, 밀가루 23 ~ 27 중량%, 어유 10 ~ 13 중량%, 비타민 프리믹스 1.5 ~ 2.5 중량% 및 미네랄 프리믹스 1.5 ~ 2.5 중량% 및 셀룰로오스 0.2 ~ 0.8 중량%를 포함할 수 있다.

또한, 상기 비타민 프리믹스는 비타민 프리믹스 1kg 당 아스코르빈산(Ascorbic acid) 250 ~ 350 mg/kg, dl-판토텐산칼슘(dl-Calcium pantothenate) 120 ~ 180 mg/kg, 콜린 바이테이트(choline bitate) 2,800 ~ 3,300 mg/kg, 이노시톨(Inositol) 120 ~ 180 mg/kg, 메나디온 3 ~ 10 mg/kg, 나이아신(Niacin) 100 ~ 200 mg/kg, 피리독신하이드로클로라이드(Pyridoxine·HCl) 10 ~ 30 mg/kg, 리보플라빈(Rivoflavin) 20 ~ 50 mg/kg, 티아민모노나이트레이트(Thiamine mononitrate) 5 ~ 30 mg/kg, dl-α-토코페롤아세테이트(dl-α-Tocopherol acetate) 100 ~ 300 mg/kg, 레티닐 아세테이트(Retinyl acetate) 2 ~ 10 mg/kg, 바이오틴(Biotin) 0.5 ~ 5 mg/kg, 엽산(Folic acid) 2 ~ 10 mg/kg 및 코발아민(Cobalamin) 0.01 ~ 0.5 mg/kg의 농도로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

그리고, 상기 미네랄 프리믹스는 미네랄 프리믹스 1kg 당 NaCl 400 ~ 500 mg/kg, MgSO₄·H₂O 1200 ~ 1500 mg/kg, ZnSO₄·H₂O 200 ~ 250 mg/kg, Fe-시트레이트(Fe-Citrate) 250 ~ 350 mg/kg, MnSO₄ 0.005 ~ 0.050 mg/kg, FeSO₄ 0.0100 ~ 0.1000 mg/kg, CuSO₄ 0.00010 ~ 0.00100 mg/kg, 칼슘이오데이트(Calciumiodate) 0.0001 ~ 0.0050 mg/kg, MgO 0.00050 ~ 0.00500 mg/kg 및 NaSeO₃ 0.00005 ~ 0.00100 mg/kg의 농도로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 양식어류용 사료에 있어서, 상기 양식어류는 송어, 넙치, 메기 또는 뱀장어 중에서 선택된 1종일 수 있으며, 바람직하게는 송어 또는 넙치일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 송어 중 무지개송어일 수 있다.

또한, 본 발명은 앞서 설명한 양식어류용 사료로 어류를 양식하는 방법에 관한 것으로서, 15±0.5℃의 수온 하에서, 1일 2회씩 어류 체중의 3 ~ 3.5%의 무게 정도의 본 발명의 양식어류용 사료를 공급하여 사육시킬 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 양식어류용 사료 및 상기 양식 방법으로 양식된 어류는 성장과 면역이 크게 증가될 수 있다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의거하여 더욱 자세하게 설명을 하나, 이하에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

[ 실시예 ]

준비예 1

(1) 하기 표 1과 같이 표준균주를 한국생명공학연구원 미생물자원센터(KCTC)로부터 분양받았다.

Sacchromyces cerevisiae	KCTC 7906
Aspergillus oryae	KCTC 6292
Lactobacillus acidophillus	KCTC 3171
Paenibacillus polymyxa	KCTC 1761
Lacdtobacillus plantarum subsp . plantarum	KCTC 3103

(2) 다음으로 하기 표 2와 같은 성분의 β-글리칸(β-Glucan) 생산균주 분리용배지용 배지를 준비하였다.

구분	함량
수크로즈(Sucrose)	100g
NH₄Cl 4.2g	4.2g
KH₂PO₄	1.0g
MgSO₄·7H₂O	0.4g
미네랄 용액(Mineral sol.)	10ml
아닐린블루(Anilline blue)	2.0g
아가(Agar)	15g
증류수(Distilled water)	1,000ml
(1)미네랄 용액 성분 : FeSO₄ 5g, MnSO₄ 2g, CoCl₂ 1g, ZnCl₂ 2g in 0.1M HCl 1L

다음으로, 수영뿌리 맥아류의 근권토양을 채취하여 풍건한 후, 토양시료를 멸균 생리식염수에 넣어 열처리(80, 1hr) 한 것과 열처리하지 않은 것을 상기 선별배지에 평판도말한 다음, 배양기에서 정치배양하였다. 그 후,지시약 아닐린 블루가 컬러니(colony)에 집적된 균을 β-글리칸 생산균주로 선별하였다(도 1 참조).

(3) 분리 균주 동정

1차분리 균주를 순수분리하여, 동정 전문기관(솔젠트)에 의뢰하여 16S rRNA gene experiment methods로 다음과 같이 동정을 실시하였다.

① Bacterial DNA isolation 수행

적당량의 셀(cell)을 solgent purification bead를 사용하여 DNA isolation을 수행하였다.

② 중합효소 연쇄반응(PCR, polymerase chain reaction)

universal primer 27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3') 및 1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'), Solgent EF-Taq 사용하여, PCR을 수행하였으며, 이때, PCT은 9700(ABI) PCR 기계를 사용하였다.

③ 다음으로, solgent PCR purification kit 사용하여, PCR product purify 실시하였다.

④ 다음으로, 전기영동 확인(1% agarose gel)하였고, 시퀀싱(sequencing)을 실시하여 얻어진 유전자 서열을 표준균주와 비교하여 구하였다.

이때, 도 1의 DC-HRP01의 유전자 적합도로 Bacillus horikoshii 로 동정되었고, 그 유전자 서열은 도 2에 나타내었다.

그리고, DC-HRP02는 유전자 서열 적합도로 Bacillus sp. ABR4로, 그리고 DC-NHRP01은 Bacillus megaterium으로 동정되었다.

여기서 생균제로서 사용 가능한 균주로 성분등록(농림수산식품부 고시 제2011-125호 별표 3 사료공정서)된 균주에 속하는 것은 DC-NHRP01인 Bacillus megaterium 이어서 이 분리균주만 첨가하는 것으로 하고 향후, 선별분리된 나머지 균주인 DC-HRP01과 DC-HRP02는 좀 더 분석하여 우수할 시 성분등록 신청을 검토해 보기로 한다.

(4) 자체 보유균주

단백질과 지질 분해활성이 뛰어난 Bacillus subtillus(고초균, 청국장균) 및 Bacillus licheniformis을 첨가하였다.

그리고, 생균제로 시험할 미생물은 Sacchromyces cerevisiae KCTC 7906, Aspergillus oryae KCTC 6292, Lactobacillus acidophillus KCTC 3171, Paenibacillus polymyxa KCTC 1761, Lacdtobacillus plantarum subsp. plantarum KCTC 3103, Bacillus megaterium, Bacillus subtillus, 그리고 Bacillus licheniformis로 정하였다.

또한, 균주의 보관은 균주보관용 vial에 10% skim milk을 넣고 멸균하여, 순수분리된 균주를 세백금이를 따서 넣고 현탁한 것과 멸균한 glycerol과 액체배양한 균주액을 동량 섞어 만든 보관균주 앰플을 각각 2개씩 만들어 -70℃ deep freezer에서 보관하였다.

준비예 2 : 복합생균제( probiotics )용 균주 선별

(1) 배양배지 준비

생균제용 종균의 생육배지는 Sacchromyces cerevisiae KCTC 7906는 YM 배지(Yeast extract 3.0g, Malt extract 3.0g, peptone 5.0g, dextrose 10.0g, Distilled water 1.0L), Aspergillus oryae KCTC 6292는 Malt extract 배지(malt extract 20.0g, peptone 5.0g, distilled water 1.0L), 그리고 유산균인 Lactobacillus acidophillus KCTC 3171와 Lacdtobacillus plantarum subsp . plantarum KCTC 3103는 MRS 배지(peptone 10.0g, beef extract 10.0g, yeast extract 5.0g, glucose 20.0g, tween 80 1.0ml, K₂HPO₄ 2.0g, sodium acetate 5.0g, triammonium citrate 2.0g, MgSO₄·H₂O 0.2g, distilled water 1.0L)를 사용하였고, Paenibacillus polymyxa KCTC 1761, Bacillus megaterium , Bacillus subtillus , 그리고 Bacillus licheniformis는 Nutrient 배지(beef extract 3.0g, peptone 5.0g, distilled water 1.0L)를 사용하였다.

(2) 배양방법

생균제 종균의 배양은 상기와 같은 각 종균의 배양배지 10ml가 든 시험관에 접종하여, 세균류는 진탕배양기로 30℃에서 170rpm으로 36 시간 동안 진탕배양하였고, 효모 및 곰팡이류는 진탕배양기로 25℃에 150rpm으로 3일간 배양하였다.

(3) 생육활성조사

1) 내열성 조사

생균제의 내열성을 측정하기 위하여 액체배지에서 생육한 배양액 50ml을 원심분리(4,000rpm, 20분)하여 원심분리 상등액은 버리고, 침전된 pellet에 phosphate buffer(pH7.2)를 10ml씩 넣고 현탁하여 시료로 준비하였다.

열처리는 고압멸균기(autoclave)에서 80에서 1시간 동안 열처리한 후, 생존한 미생물 생균수를 BL agar 배지로 30에서 48시간 동안 배양시킨 다음 생균수를 계수하여 하기 표 3에 나타내었다.

균 주	멸균전 개체수 (CFU/ml)	멸균후 개체수 (CFU/ml)	생존율(%)
Sacchromyces cerevisiae KCTC 7906	2.5×10⁹	1.8×10⁷	0.7
Aspergillus oryae KCTC	3.0×10⁹	3.0×10⁶	0.1
Lactobacillus acidophillus KCTC 3171	1.5×10⁹	3.0×10⁶	0.2
Lacdtobacillus plantarum subsp. plantarum KCTC 3103	2.0×10⁹	6.0×10⁶	0.3
Paenibacillus polymyxa KCTC 1761	2.0×10⁹	1.0×10⁶	5.2
Bacillus megaterium DCP01	6.5×10⁹	4.1×10⁹	62.6
Bacillus subtillus	8.0×10⁹	7.4×10⁹	93.4
Bacillus licheniformis	6.0×10⁹	4.6×10⁹	75.5

내열성에서 Sacchromyces cerevisiae KCTC 7906, Aspergillus oryae KCTC 6292, Lactobacillus acidophillus KCTC 3171와 Lacdtobacillus plantarum subsp . plantarum KCTC 3103는 미약하였고, Paenibacillus polymyxa KCTC 1761는 내역성이 다소 있었고, 내열성 포자 형성균인 Bacillus megaterium , Bacillus subtillus , 그리고 Bacillus licheniformis 균은 높은 내열성을 나타내었다.

2) 내산성 조사

내산성을 조사하기 위해 NaCl 0.4g과 conc. HCl 1.4ml을 200ml 볼루메트릭 플라스크(volumetric flask)에 넣고 증류수로 표선을 맞춘 인공위액에 배양액을 2ml을 넣고, 4시간 교반 반응전과 반응 후의 미생물 생균수를 BL agar 배지를 사용하여 계수하여 하기 표 4에 나타내었다.

균 주	반응전 개체수 (CFU/ml)	반응후 개체수 (CFU/ml)	생존율(%)
Sacchromyces cerevisiae KCTC 7906	1.1×10⁸	2.8×10⁷	25.2
Aspergillus oryae KCTC	1.5×10⁸	3.4×10⁷	22.5
Lactobacillus acidophillus KCTC 3171	7.5×10⁷	6.7×10⁷	89.5
Lacdtobacillus plantarum subsp. plantarum KCTC 3103	1.0×10⁸	8.2×10⁷	82.1
Paenibacillus polymyxa KCTC 1761	1.0×10⁸	8.3×10⁷	83.2
Bacillus megaterium DCP01	3.3×10⁸	2.3×10⁷	68.2
Bacillus subtillus	4.0×10⁸	1.6×10⁸	41.2
Bacillus licheniformis	3.0×10⁸	2.7×10⁸	75.5

내산성 시험에서는 유산균류가 80%이상의 높은 내산성을 나타내었다.

(3) 병원성 미생물 억제 활성

생균제용 종균의 장관 내 병원성 미생물에 대한 항균효과를 검증하기 위하여 Agar diffusion assay(Agar Paper Disc Diffusion Method)방법을 이용하여 항균효과를 검증하였다.

Bottom agar(MRSa)를 먼저 분주하여 굳힌 후 Top agar(TSB + 0.7% Agarose)를 제조하여 병원균 희석액 (Escherichia coli K99-소 설사 대장균, Escherichia coli K88-돼지 설사 대장균와 Salmonella enteritidis -닭 설사 장염균 각 희석액 1×10^-2)을 각각 플레이트(plate)의 bottom agar 위에 분주하여 굳힌다. 굳힌 plate에 각 각 종균을 묻힌 페이퍼 디스크(paper disc)를 놓고, 37℃에서 12시간 배양하였다. 배양 후 투명대환(clear zone)이 형성되었으면, 플레이트(plate)에서 형성된 클리어존(clear zone)을 측정하여 수치화한다. 수치는 투명대환이 측정불가이면 -(효과 없음), 15mm보다 작으면 +(효과 약함), 15~25mm이면 ++(효과 양호), 26~35mm이면 +++(효과 우수), 35mm보다 크면 ++++(효과 매우 큼)으로 표현하였고 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

균 주	장관내 병원성 미생물
균 주	Escherichia coli K99	Escherichia coli K88	Salmonella enteritidis
Sacchromyces cerevisiae KCTC 7906	+	+	+
Aspergillus oryae KCTC	+	+	+
Lactobacillus acidophillus KCTC 3171	+++	++	++
Lacdtobacillus plantarum subsp. plantarum KCTC 3103	+++	++	+++
Paenibacillus polymyxa KCTC 1761	++	+++	+++
Bacillus megaterium DCP01	+	+	+
Bacillus subtillus	++	++	+
Bacillus licheniformis	++	++	++

각 균주들은 전부 장관내 병원성 미생물에 대한 항균활성을 나타내었고, 그 중 유산균류가 항균 활성이 우수하였다.

이상의 결과에서 보면, 내산성과 항균활성은 유산균이 높았고, 내열성은 내열성포자를 생성하는 바실러스류가 우수함을 알 수 있었고, 이처럼 바실러스 균들은 생균제를 이용한 사료의 제조시 열치사에 대한 잔류생존효과가 높아 생균제로서의 생명활동효과를 기대할 수 있을 것이고, 유산균류와 효모 및 균류는 열에 대한 생존 잔류 효과가 낮아 사료제조공정을 거치면 이 미생물 자체에 의한 장관내 역할은 다소 낮을 것으로 판단된다. 그러므로 프리바이오틱(prebiotic)적 개념을 도입해서 영양학적으로 동물 장관 내 정장기능을 도울 수 있도록 양적인 개체수 조절이 필요할 것으로 판단되었다.

따라서, 생균제용 미생물 종균으로서, Sacchromyces cerevisiae KCTC 7906, Aspergillus oryae KCTC 6292, Lactobacillus acidophillus KCTC 3171와 Lacdtobacillus plantarum subsp . plantarum KCTC 3103, Paenibacillus polymyxa KCTC 1761와 자체 보유균인 Bacillus subtillus 및 Bacillus licheniformis 그리고 토양분리균인 Bacillus megaterium DCP01가 생균제로서의 필요한 기능성을 나타내어, 생균제용 종균으로 선정하였다.

준비예 3 : 복합 생균제 제조

상기 미생물 종균 중 바실러스 라이케니포미스균(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스균(Bacillus subtilis), 페니바실러스 폴리믹사균(Paenibacillus polymyxa), 아스퍼질러스 오리자에균(Aspergillus oryzae) 및 사카로미세스 세레비시아균(Sacchromyces cerevisiae)을 1:1:1:1:1 중량비로 혼합하여 복합 생균제를 제조하였으며, 제조한 복합생균제에 균수는 하기 표 6과 같았다.

구분	균수(cfu/kg)
바실러스 서브틸리스균 (Bacillus subtilis)	2.8×10⁸
바실러스 라이케니포미스균 (Bacillus lichemifomis)	3.4×10⁸
페니바실러스 폴리믹사균 (Paenibacillus polymyxa)	3.5×10⁸
아스퍼질러스 오리자에균 (Aspergillus oryzae)	1.6×10⁹
사카로미세스 세레비시아균 (Sacchromyces cerevisiae)	1.1×10⁹

실시예 1 : 양식어류용 사료의 제조

하기 표 7과 같은 조성을 갖는 기초사료 100 중량부에 대하여, 상기 준비예 3에서 제조한 복합생균제 0.5 중량부를 혼합하여 양식어류용 사료(이하, MP₂로 칭함)를 제조하였다. 그리고, 이를 펠렛제조기로 압출 성형하였으며, 환풍이 잘되는 곳에서 자연건조(48시간)시킨 다음 실험어의 크기에 맞도록 입자크기를 1,500 ㎛ 및 2,000 ㎛ 표준체(sieve)를 이용하여 고르게 친 후, 밀봉하여 -20℃에 냉장 보관하면서 사용하였다.

성분(Ingredients)	함량(중량%)
어분(Fish meal, herring)⁽¹⁾	29.6
대두박(Soybean meal)⁽²⁾	11.0
밀글루텐(Wheat gluten meal)⁽¹⁾	7.3
혈분(Blood meal)⁽¹⁾	6.0
오징어간 분말(Squid liver powder)⁽¹⁾	5.5
밀가루(Wheat flour)⁽¹⁾	24.3
어유(Fish oil, menhaden)⁽³⁾	11.8
비타민 프리믹스(Vitamin premix)⁽⁴⁾	2.0
미네랄 프리믹스(Mineral premix)⁽⁵⁾	2.0
셀룰로오스(Cellulose)⁽⁶⁾	0.5
(1):Suhyup feed C. Uiryeong, Korea (2):The feed Co. Goyang, Korea (3):Jeil feed Co. Hamman, Korea (4):Contains (as mg/kg in diets) : Ascorbic acid, 300; dl-Calcium pantothenate, 150; Choline bitate, 3000; Inositol, 150; Menadion, 6; Niacin, 150; Pyridoxine·HCl, 15; Rivoflavin, 30; Thiamine mononitrate, 15; dl-β-Tocopherol acetate, 201; Retinyl acetate, 6; Biotin, 1.5; Folic acid, 5.4; Cobalamin, 0.06 (5):Contains (as mg/kg in diets) : NaCl, 437.4; MgSO₄·H₂O, 1379.8; ZnSO₄·H₂O, 226.4; Fe-Citrate, 299; MnSO₄, 0.016; FeSO₄, 0.0378; CuSO₄, 0.00033; Calciumiodate, 0.0006; MgO, 0.00135; NaSeO₃, 0.00025 (6):Sigma-Aldrich Korea Yongin, Korea

비교예 1 ~ 비교예 3

비교예 1(대조구, cont)로서, 상기 표 7의 기초사료로 준비하였으며, 비교예 2로서, 항생제(Oxytetracycline; OTC, 0.5 중량부)와 상기 표 7의 기초사료 100 중량부를 혼합한 사료(이하, OTC로 칭함)를 준비하였고, 비교예 3으로서, 상기 기초사료 100 중량부와 타사복합균(Clostridium butyricum , Bacillus licheniformis , Bacillus subtilis을 동일 중량비로 혼합) 0.5 중량부를 혼합하여 사료(MP₁)를 준비하였다. 그리고, 모든 사료원을 골고루 섞은 뒤, 펠렛제조기로 압출 성형하였으며, 환풍이 잘되는 곳에서 자연건조(48시간)시킨 다음 실험어의 크기에 맞도록 입자크기를 1,500 ㎛ 및 2,000 ㎛ 표준체(sieve)를 이용하여 고르게 친 후, 밀봉하여 -20℃에 냉장 보관하면서 사용하였다.

제조예 : 무지개송어의 사육

무지개송어는 경북 상주에 위치한 양어장으로부터 구입하여 부경대학교 사료영양연구소로 운반한 후, 250L 수조에 2주간 기초사료를 주면서 예비사육하였다. 예비사육 후, 평균 어체중 5.98 ± 0.12g (mean ± SD)인 무지개 송어를 도 3에 나타낸 50L 사각수조에 20마리씩 수용하여 각 실험구당 무작위 배치하였다. 충분한 산소공급을 위해 에어스톤을 설치하였으며, 평균수온은 15±0.5℃를 유지하였다. 1일 사료공급량은 전 실험기간 동안 1일 2회, 어체중의 3~3.5%로 공급하였으며, 사육실험은 총 8주간 실시하였다.

이하 모든 실험 결과는 SAS Program으로 ANOVA(analysis of variance) test를 실시하여 최소유의차검정(LSD : Least Significant Difference)으로 평균간의 유의차(P〈 0.05)를 검정하였다.

실험예 1 : 생체 측정

모든 실험에 있어 매 2주마다 개체수와 체중을 측정하여 증체율(weight gain, %), 사료효율(feed efficiency, %), 일간 성장률(specific growth rate, %/day), 단백질 전환 효율(protein efficiency ratio, %), 생존율(survival rate, %)을 측정 실험하였다. 상기 측정 항목들의 계산식은 각각 하기 수학식 1 ~ 수학식 5와 같다.

[수학식 1]

증체율(WG, %) = (최종 중량 - 최초 중량)×100% / (최초 중량)

[수학식 2]

사료효율(FE, %) = (wet weight gain / dry feed intake)×100%

[수학식 3]

일간 성장률(SGR, %) = (log_e 최종 중량. - log_e 최초 중량)×100% / (실험수행기간일)

[수학식 4]

단백질 전환 효율(PER) = (wet weight gain / protein intake)

[수학식 5]

생존율(%) = (전체 물고기수 - 죽은 물고기 수)×100% / (전체 물고기 수)

최종 8주간 사육 후, 증체율, 사료효율, 일간 성장률, 단백질 전환 효율 및 생존율을 측정한 결과를 하기 표 8 및 도 4 ~ 도 8에 각각 나타내었다.

구분	Diets				Pooled SEM⁽¹⁾
구분	비교예 1 (Cont)	비교예 2 (OTC)	비교예 3 (MP₁)	실시예 1 (MP₂)	Pooled SEM⁽¹⁾
증체율(%)	210.89^b	224.56^ab	227.26^ab	238.41^a	3.79
사료효율(%)	95.12	97.89	99.46	98.35	0.79
일간성장률(%)	2.52^b	2.61^ab	2.63^ab	2.71^a	0.02
단백질 전환효율	0.43	0.44	0.45	0.44	0.01
생존율(%)	91.7	91.7	95.0	91.7	1.44
(1) :Pooled standard error of mean : SD/√n

증체율, 일간성장률에 있어서, MP₂를 공급한 실험구가 대조구(Control)에 비하여 유의적으로 높게 나타났지만(P<0.05), OTC, MP₁ 및MP₂를 공급한 실험구간에는 유의한 차이가 나타나지 않았다(P>0.05).

실험예 2 : 전어체 일반 성분 분석

각 수조별로 무작위로 추출하여 분쇄한 전어체를 사용하여, AOAC(Association of Official Analytical Chemists, 2000) 방법에 따라 수분은 상압가열건조법(135°C, 2시간). 조단백질은 Kjeldahl 질소정량법(N×6.25), 조회분은 직접회화법으로 분석하였다. 조지방은 샘플을 12시간 동결 건조한 후, soxtec system 1046(Tacator AB, Sweden)을 사용하여 Soxhlet 추출법으로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

구분	Diets				Pooled SEM⁽¹⁾
구분	비교예 1 (Cont)	비교예 2 (OTC)	비교예 3 (MP₁)	실시예 1 (MP₂)	Pooled SEM⁽¹⁾
수분 (Moisture, 중량%)	73.65	74.01	71.05	73.08	0.44
단백질 (Protein, 중량%)	18.04	18.51	18.85	18.31	0.16
지질 (Lipid, 중량%)	7.85	7.42	7.77	7.58	0.16
Ash(중량%)	1.73	1.75	1.71	1.78	0.01
(1) : Pooled standard error of mean : SD/√n

상기 표 9의 결과를 보면, 실험결과 영양소가 거의 유사한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3 : 혈액 측정 실험

어류의 혈액성분은 영양, 건강상태 및 스트레스 해석의 차원으로 사용이 가능하고, 사료의 필수영양소의 결핍이나 그 어종이 처해 있는 서식환경 및 성장에 따라서도 변화되는데, 사료 내 생균제 첨가가 실험어의 생리상태에 미치는 영향을 평가하기 위해 혈액성분을 조사하였다.

8주간의 사육실험 종료 후 혈액성분 분석을 위하여 실험어를 채혈하기 전까지 약 24시간 동안 절식시킨 후 각 수조별로 4마리씩 무작위로 선별하여 혈액 주사기(1 mL)를 사용하여 미부 혈관에서 30초 이내에 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액의 일부를 원심분리 (3,000 RPM 10분) 하여 혈청을 분리하였고, Glutamic oxaloacetic transaminase(GOT), glutamic pyruvic transaminase(GPT), 글루코스(glucose)와 총 콜레스테롤(total cholesterol)을 상업용 키트(Kit)를 이용해 DRI-CHEM 4000i- Fuji Dri-Chem Slide- 3150(Minato-ku, Tokyo, Japan)으로 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 10 및 도 9 ~ 도 12에 각각 나타내었다.

구분	Diets				Pooled SEM⁽³⁾
구분	비교예 1 (Cont)	비교예2 (OTC)	비교예 3 (MP₁)	실시예 1 (MP₂)	Pooled SEM⁽³⁾
GOT(U/L)⁽¹⁾	20.3	21.3	19.0	21.0	0.46
GPT(U/L)⁽²⁾	20.0	22.0	19.3	21.3	0.55
Glucose(mg/dL)	37.3^a	33.3^ab	34.6^ab	32.3^b	0.79
T-Cholesterol(mg/dL)	123.3	118.6	116.0	121.3	1.51
(1) :Glutamic oxaloacetic transaminase. One unit is defined as the amount of enzyme causing the transamination of 1.0 μmol of L-aspartate per minute at 25℃ and pH 7.4 (2) :Glutamic pyruvic transaminase. One unit is defined as the amount of enzyme causing the transamination of 1.0 μmol of L-alanine per minute at 25℃ and pH 7.4 (3) :Pooled standard error of mean : SD/√n

상기 표 10 및 도 9 ~ 도 12의 실험결과를 살펴보면, 혈장의 GOT, GPT 및 Total cholesterol은 모든 실험구간에 유의한 차이가 없었다(P>0.05). 그러나 글루코스의 함량은 실시예 1이 비교예 1에 비해 유의적으로 낮게 나타났으며(P<0.05), 비교예 2, 비교예 3 및 실시예 1간에는 유의한 차이가 나타나지 않은 결과를 보였다(P>0.05).

실험예 4 : 비특이적 면역반응 실험

(1) SOD 활성 측정 실험

각각의 실험구별 어류에서 분리한 혈청으로 SOD Assay Kit(Sigma-Aldrich, 191600)을 사용하여 제조사의 지시를 따라 WST-1(Water Soluble Tetrazolium dye) 와 xanthine oxidase으로 효소의 저해율을 백분위로 계산하였다. 그리고, 각각의 샘플이 인큐베이터(Incubator)에 37℃로 20분간 반응시켜 평행시간에 도달하였을 때, 450nm파장(WST-1과 활성산소가 반응하여 나타난 유색을 측정하기 위한 파장의 흡광도)에서 흡광도를 측정한다. 저해율은 mg 단백질(protein)당 SOD 활성 단위로 나타냈으며, 그 결과를 하기 냈으며, 그 결과를 하기 표 1 및 도 13에 나타내었다.

(2) 리소자임 ( Lysozyme ) 활성 측정 실험

각각의 실험구별 어류에서 분리한 혈청 0.1 ml과 0.05M sodium phosphate buffer(pH 6.2)에 Micrococcus lysodeikticus(0.2 mg/ml)를 부유시킨 suspension 2 ml과 혼합했다. 그리고, 반응은 20℃ 조건에서 분광 흡광도계의 흡광도 530 nm에서 0.5분과 4.5분에 측정했다. 리소자임의 활성 단위는 분당 0.001의 흡광도 감소를 나타내는 효소양으로 정의했다. 측정 결과는 냈으며, 그 결과를 하기 표 1 및 도 13에 나타내었다.

구분	Diets				Pooled SEM⁽¹⁾
구분	비교예 1 (Cont)	비교예 2 (OTC)	비교예 3 (MP₁)	실시예 1 (MP₂)	Pooled SEM⁽¹⁾
SOD (% inhibition)	37.70^b	44.49^ab	50.47^a	48.58^a	1.97
Lysozyme (U/ml)	0.83^b	1.17^a	1.13^a	1.13^a	0.05
(1) : Pooled standard error of mean : SD/√n

대식세포는 체내에 침입한 세균, 바이러스 등을 가수분해함으로 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 증가시키게 되는데, SOD 활성은 과산화이온을 산소와 과산화수소로 바꿔주는 반응을 촉매하는 대표적인 항산화 효소로써, 체내에 침입한 병원체를 제거하는 역할을 하고(Fattman et al., 2003), 리소자임(Lysozyme)은 항생물질과 같은 성상을 나타내는 임파구 유래의 점액 용균성 효소로 내인성 방어기구의 일부가 된다(Ingram, 1980). 상기 표 11의 SOD 활성 실험에 있어서 비교예 3 및 실시예 1이 대조구인 비교예 1 및 비교예 2에 비해 유의하게 높게 나타났다(P<0.05). 하지만 비교예 3 및 실시예 1₂를 공급한 실험구간에는 유의한 차이가 나타나지 않았다(P>0.05).

또한, 리소자임 활성 결과를 살펴보면, 비교예 2, 비교예 3 및 실시예 1이 대조구인 비교예 1에 비해 유의하게 높게 나타났다(P<0.05). 하지만 비교예 2, 비교예 3 및 실시예 1 간에는 유의한 차이가 나타나지 않았다(P>0.05).

상기 실시예 및 실험결과를 통하여, 본 발명의 복합생균제를 포함하는 양식사료는 양식어류의 성장과 면역을 증강시키며, 항생제 대체물질로 효과를 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

기초사료; 및
바실러스 라이케니포미스균(Bacillus licheniformis), 바실러스 서브틸리스균(Bacillus subtilis), 페니바실러스 폴리믹사균(Paenibacillus polymyxa), 아스퍼질러스 오리자에균(Aspergillus oryzae) 및 사카로미세스 세레비시아균(Sacchromyces cerevisiae)을 함유한 복합생균제;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 양식어류용 사료.
제1항에 있어서, 상기 기초사료 100 중량부에 대하여, 상기 복합생균제를 0.1 ~ 5 중량부로 포함하는 것을 특징으로 하는 양식어류용 사료.
제1항에 있어서, 상기 복합생균제는 바실러스 라이케니포미스균 1×10⁷ ~ 8×10⁸cfu/㎏, 바실러스 서브틸리스균 5×10⁷ ~ 1×10⁹cfu/㎏, 페니바실러스 폴리믹사균 5×10⁷ ~ 1×10⁹cfu/㎏, 아스퍼질러스 오리자에균 1×10⁸ ~ 5×10⁹cfu/㎏ 및 사카로미세스 세레비시아균 1×10⁸ ~ 5×10⁹cfu/㎏로 포함하는 것을 특징으로 하는 양식어류용 사료.
제1항에 있어서, 상기 기초사료는
어분, 대두박, 밀글루텐(wheat gluten meal), 혈분(blood meal), 오징어간 분말(Squid liver powder), 밀가루(wheat flour), 어유(fish oil), 비타민 프리믹스(vitamin premix) 및 미네랄 프리믹스(mineral premix) 및 셀룰로오스를 포함하는 것을 특징으로 하는 양식어류용 사료.
제4항에 있어서, 상기 기초사료는
어분 25 ~ 35 중량%, 대두박 8 ~ 15 중량%, 밀글루텐 5 ~ 10 중량%, 혈분 4 ~ 8 중량%, 오징어간 분말 3 ~ 7 중량%, 밀가루 20 ~ 30 중량%, 어유 8 ~ 14 중량%, 비타민 프리믹스 1 ~ 3 중량% 및 미네랄 프리믹스 1 ~ 3 중량% 및 셀룰로오스 0.1 ~ 1 중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 양식어류용 사료.
제4항에 있어서, 상기 비타민 프리믹스는 비타민 프리믹스 1kg 당
아스코르빈산(Ascorbic acid) 250 ~ 350 mg/kg, dl-판토텐산칼슘(dl-Calcium pantothenate) 120 ~ 180 mg/kg, 콜린 바이테이트(choline bitate) 2,800 ~ 3,300 mg/kg, 이노시톨(Inositol) 120 ~ 180 mg/kg, 메나디온 3 ~ 10 mg/kg, 나이아신(Niacin) 100 ~ 200 mg/kg, 피리독신하이드로클로라이드(Pyridoxine·HCl) 10 ~ 30 mg/kg, 리보플라빈(Rivoflavin) 20 ~ 50 mg/kg, 티아민모노나이트레이트(Thiamine mononitrate) 5 ~ 30 mg/kg, dl-α-토코페롤아세테이트(dl-α-Tocopherol acetate) 100 ~ 300 mg/kg, 레티닐 아세테이트(Retinyl acetate) 2 ~ 10 mg/kg, 바이오틴(Biotin) 0.5 ~ 5 mg/kg, 엽산(Folic acid) 2 ~ 10 mg/kg 및 코발아민(Cobalamin) 0.01 ~ 0.5 mg/kg의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 양식어류용 사료.
제4항에 있어서, 상기 미네랄 프리믹스는 미네랄 프리믹스 1kg 당
NaCl 400 ~ 500 mg/kg, MgSO₄·H₂O 1200 ~ 1500 mg/kg, ZnSO₄·H₂O 200 ~ 250 mg/kg, Fe-시트레이트(Fe-Citrate) 250 ~ 350 mg/kg, MnSO₄ 0.005 ~ 0.050 mg/kg, FeSO₄ 0.0100 ~ 0.1000 mg/kg, CuSO₄ 0.00010 ~ 0.00100 mg/kg, 칼슘이오데이트(Calciumiodate) 0.0001 ~ 0.0050 mg/kg, MgO 0.00050 ~ 0.00500 mg/kg 및 NaSeO₃ 0.00005 ~ 0.00100 mg/kg의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 양식어류용 사료.
제1항 내지 제7항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 양식어류는 송어 또는 넙치인 것을 특징으로 하는 양식어류용 사료.
제1항 내지 제7항 중에서 선택된 어느 한 항의 양식어류용 사료로 어류를 양식하는 방법.
제1항 내지 제7항 중에서 선택된 어느 한 항의 양식어류용 사료로 양식시킨 양식어류.