CN110904003A - 一种水产用复合发酵菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水产用复合发酵菌剂及其应用，复合发酵菌剂由复合菌体和载体组成，由复合菌体和载体按2～4:6～8比例混合低温干燥制得；本发明还公开了一种水产用湿性颗粒发酵饲料，投入水体后能保持长时间内形状不变，容易被水产养殖动物及时采食，不污染水体；小分子蛋白含量高，水产动物更容易消化吸收；用于养殖，可以对水产动物的生长起到良好的促进作用。

Description

一种水产用复合发酵菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种水产用复合发酵菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，我国的水产养殖得到了快速发展，但由于高密度养殖和过量投饵等带来的水质污染所导致的高发病率正重创水产养殖业。目前最常见的是采用抗生素和消毒剂等来防控鱼虾疾病以及使用微生态制剂改良水产养殖环境，但随着病原菌抗药性的增强和药物残留等问题的日趋严重，改变固有的疾病预防与治疗方法已成为当务之急。
饲料原料发酵后会产生乳酸、醋酸、乙醇等，使发酵饲料具有独特酸香味，具有很强的诱食性，适口性好。此外，发酵饲料中的益生菌有稳定养殖生态环境的作用，它可以直接吸收或降解水中的有机物，改善养殖水体的水环境。因此发酵饲料是一种新型的功能饲料，物料经过发酵后抗营养因子得以消除，营养物质也更易于消化吸收，在生产中推广应用后有利于降低生产成本，提高养殖产量和效益。
目前在水产养殖过程中添加的粉状发酵饲料，通常仅仅只是作为一个调水、改水产品来调节池塘养殖水体，并没有真正的被鱼、虾、蟹等水产动物吃进去，改善肠道，达到内外兼顾的效果；反而给养殖水体造成了更大的负担，从而给水产养殖后期的水环境造成氨氮、亚硝酸盐含量高的问题。让水质调节工作在养殖后期变得很难，所以目前大部分养殖者已经认识到粉状发酵饲料存在的弊端，只是在养殖前期少量的使用一些；而在中后期的养殖过程中为了调节水质，而大部分的养殖者会使用单一的或复配的有益菌，如：枯草芽孢杆菌、粪链球菌等。而对于粉状发酵饲料基本不用，这就形成了发酵饲料在水产养殖过程中不能够被大面积使用的尴尬局面。
作为进行生命活动所必须的结构物质，蛋白质是水产动物生长过程中所需营养素中最核心的要素。尤其是虾蟹类和肉食性鱼类等水产动物对饲料中的粗蛋白含量需求量超过30％。发酵饲料可以通过一种或多种有益复合微生物的发酵作用，降解部分蛋白质、多糖等大分子物质，生成有机酸和可溶性多肽等小分子物质，积累有益的代谢产物，消除抗营养因子，形成营养丰富、适口性好和活菌含量高的生物饲料。目前对虾养殖前期为保证营养，投喂的开口饵料粗蛋白含量一般超过了45％，这不仅加重了虾苗肝脏负担，残饵及粪便也会恶化水质，最终导致疾病暴发。而发酵饲料富含微生物菌体蛋白、小肽类氨基酸、活性益生菌等物质，用其取代水产动物苗种的部分饵料，更容易被吸收，提高能蛋比，减轻肝脏负担，促进消化吸收，防控肠炎。发酵饲料在发酵过程中，不同微生物相互作用，产生的酶系更丰富，发酵效果得到了更好地提升。
为了克服现有技术中存在的缺陷，提供一种新的水产专用的复合发酵菌剂，可以不污染水体，所制备饲料小分子蛋白含量高，容易消化吸收显得十分重要，且具有极大的市场价值和应用前景。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种水产用复合发酵菌剂及其制备方法，以及一种利用上述发酵菌剂制备得到的水产用湿性颗粒发酵饲料及其制备方法。
为达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种水产用复合发酵菌剂，所述复合发酵菌剂由复合菌体和载体按2～4:6～8质量配比混合低温干燥制得。
所述复合菌体包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌。
所述载体为稻壳粉、石粉、玉米芯粉或淀粉中的一种或多种。
所述复合菌体各菌以CFU计地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌的比例为3～6：3：5～9：1～3。
所述复合菌体各菌以CFU计地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌的比例为5：3：7：2。
所述复合发酵菌剂中地衣芽孢杆菌活菌数≥8.0×109CFU/g，枯草芽孢杆菌活菌数≥2.0×109CFU/g，植物乳杆菌活菌数≥1.0×1010CFU/g，干酪乳杆菌活菌数≥1.0×109CFU/g。
第二方面，本发明还提供一种复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水或磷酸缓冲液重悬菌体，将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌按照菌落形成单位配比进行混合，得到复合菌体，将复合菌体与载体按照质量配比混合，低温干燥即得复合发酵菌剂。
第三方面，本发明还提供一种水产用湿性颗粒发酵饲料，所述发酵饲料由下述原料经第一方面所述复合发酵菌剂发酵得到：鱼粉10％～15％，豆粕15％～20％，菜籽粕7％～15％，棉粕7％～15％，虾粉5％～10％，玉米5％～10％，乌贼膏2％～4％，氯化胆碱0.1％～0.3％，海藻酸钠0.3％～0.6％，糖蜜1％～3％及洁净水25％～30％；其中，发酵剂添加量为原料总量0.1％～0.5％；接种发酵时水分控制在30％～40％，投入制粒机中制粒，制粒后的湿性颗粒采用带单向呼吸阀呼吸袋进行包装，室温发酵3～7d。
所述发酵饲料由下述原料经第一方面所述复合发酵菌剂发酵得到：鱼粉10％，豆粕17％，菜籽粕15％，棉粕15％，虾粉5％，玉米7％，乌贼膏2.50％，氯化胆碱0.10％，海藻酸钠0.40％，糖蜜3％，洁净水25％。
第四方面，本发明还提供第三方面所述发酵饲料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)按照原料配方称取除糖蜜和洁净水之外的其他原料，粉碎过筛，预混合2～5min，得到原料粉末备用；
(2)称取复合发酵菌剂，按照1:50的重量比溶解于洁净水中，在35～37℃条件下活化12～24h，作为种子液备用；
(3)按照原料配方称取糖蜜和洁净水，将糖蜜、洁净水和步骤(2)得到的种子液混合，搅拌0.5～2min，作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(1)得到的原料粉末中，搅拌2～5min，控制水分含量在30％～40％；
(5)将步骤(4)得到发酵饲料半成品投入制粒机中进行冷制粒；压缩比为18～24；
(6)制粒后发酵饲料水分控制在25％～35％；室温发酵3～7d即得。
上述步骤5中，制粒设备采用不锈钢环模制粒设备，压辊为细齿，增大环模宽度提高产量；电极功率主电机为六级，降级颗粒机齿轮箱内的齿数比；降低喂料速度慢，保证湿制粒后的产品成型率。
上述步骤6中，将制粒后得到湿性颗粒采用带单向阀的呼吸袋进行包装，保证复合发酵菌剂后续发酵产生的气体通过单向呼吸阀及时排出。
第五方面，本发明还提供第一方面所述复合发酵菌剂在制备水产用发酵饲料中的应用。
第六方面，本发明还提供第三方面所述发酵饲料在水产养殖中的应用。
有益之处：
本发明所提供的的水产用湿性颗粒发酵饲料，投入水体后能保持长时间内形状不变，容易被水产养殖动物及时采食，不污染水体；小分子蛋白含量高，水产动物更容易消化吸收；用于养殖，可以对水产动物的生长起到良好的促进作用。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
以下实施例所用菌株如下：
枯草芽孢杆菌BFC1601，已于2016年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13131。
植物乳杆菌BFC1602，已于2016年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13132。
干酪乳杆菌F-08，已于2012年10月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.6735。
地衣芽孢杆菌购买自天津博菲德科技有限公司。
实施例1复合发酵菌剂的制备
配方1：将地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水重悬菌体，将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌按照菌落形成单位配比(地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝5：3：7：2)进行混合，得到复合菌体，将复合菌体与玉米芯粉按照质量配比3：7混合，65℃低温干燥即得复合发酵菌剂。
配方2：将地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水重悬菌体，将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌按照菌落形成单位配比(地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝3：3：9：3)进行混合，得到复合菌体，将复合菌体与玉米芯粉按照质量配比2：8混合，65℃低温干燥即得复合发酵菌剂。
配方3：将地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水重悬菌体，将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌按照菌落形成单位配比(地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌＝6：3：5：1)进行混合，得到复合菌体，将复合菌体与石粉按照质量配比4：6混合，65℃低温干燥即得复合发酵菌剂。
经试验三种配方所得的复合发酵菌剂均有相似效果。
对比例1
将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌按照菌落形成单位配比(地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：植物乳杆菌＝5：3：7)进行混合，得到复合菌体，将复合菌体与玉米芯粉按照质量配比3：7混合，65℃低温干燥即得复合发酵菌剂。
对比例2
将干酪乳杆菌与玉米芯粉按照质量配比3：7混合，65℃低温干燥即得发酵菌剂。
对比例3
将配方1中地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌的配比调整为：2：4：4：2，以菌落形成单位计。其他步骤同配方，制备复合发酵菌剂。
实施例2发酵饲料的制备
实施例1制备的复合发酵菌剂配方1-3分别按照如下步骤制备发酵饲料：
(1)按照如下重量比配方准备原料：
原料组合1：鱼粉10％，豆粕17％，菜籽粕15％，棉粕15％，虾粉5％，玉米7％，乌贼膏2.5％，氯化胆碱0.1％，海藻酸钠0.4％，糖蜜3％，洁净水25％；
原料组合2：鱼粉15％，豆粕20％，菜籽粕11％，棉粕7％，虾粉10％，玉米5％，乌贼膏4％，氯化胆碱0.3％，海藻酸钠0.6％，糖蜜1.1％，洁净水30％；
原料组合3：鱼粉15％，豆粕15％，菜籽粕7％，棉粕15％，虾粉10％，玉米9％，乌贼膏2％，氯化胆碱0.3％，海藻酸钠0.3％，糖蜜1.4％，洁净水25％；
经试验上述原料组合所制得发酵饲料均有相似效果，下述实施例仅选其一为例，即所用发酵饲料如未特别说明即为按原料组合1发酵而得的发酵饲料。
(2)按照原料配方称取除糖蜜和洁净水之外的其他原料，粉碎过0.45mm孔径筛，预混合5min，得到原料粉末备用；
(3)按原料总量0.3％称取复合发酵菌剂，按照1:50的比例溶解于洁净水中，在35～37℃条件下活化24h，作为种子液备用；
(4)按照原料配方称取糖蜜和洁净水，将糖蜜、洁净水和步骤(3)得到的种子液混合，搅拌2min，作为菌液备用；
(5)将步骤(4)得到的菌液喷入步骤(2)得到的原料粉末中，搅拌5min，控制水分含量在30％～40％。
(6)将步骤(5)得到发酵饲料半成品投入制粒机中进行冷制粒；压缩比为18～24；制粒设备采用不锈钢环模制粒设备，压辊为细齿，增大环模宽度提高产量；电极功率主电机为六级，降级颗粒机齿轮箱内的齿数比；降低喂料速度慢，保证湿制粒后的产品成型率。
(7)将步骤(6)得到湿性颗粒采用带单向阀的呼吸袋进行包装，保证复合发酵菌剂后续发酵产生的气体通过单向呼吸阀及时排出；制粒后发酵饲料水分控制在25％～35％；室温发酵7d即得发酵饲料。
按照实施例1配方1-3所得复合发酵菌剂制备得到的发酵饲料在下述测定中分别称之为实验组1-3。
对比例4
发酵饲料制备步骤(3)中按原料总量0.3％称取对比例1中所得复合发酵菌剂，其余步骤及原料与实施2相同。
对比例5
发酵饲料制备步骤(3)按原料总量0.3％称取对比例2中所得发酵菌剂，其余步骤及原料与实施2相同。
对比例6
发酵饲料制备步骤(3)按原料总量0.3％称取对比例3中所得复合发酵菌剂，其余步骤及原料与实施2相同。
测定发酵饲料发酵前后营养物质变化情况见表1。由表可见，经本发明制备的复合发酵菌剂发酵后产品酸溶蛋白提高144.12％，蛋白质体外消化率提高3.58％。而对比例4、5和对比例6制备的复合发酵菌剂发酵后产品酸溶蛋白含量分别提高了64.57％、43.63％和51.85％。显然，本发明复合发酵菌剂中的各种菌之间产生了协同作用。经发酵后的饲料营养价值和消化率均有提高。
表1营养物质情况
Figure BDA0002296407620000081
实施例3发酵饲料的稳定性试验
将实施例2实验组1所得水产用湿性颗粒发酵饲料进行水中浸泡试验，同时设置市售普通颗粒型饲料进行对照试验；
测试方法具体为，将水产用湿性颗粒发酵饲料与市售普通颗粒型饲料同时分别投入相应的水盆内，记录初始投入量为500g，投入水后浸湿后捞出，沥干水分，称量重量A0，并记录初始重量，再投回水中，分别于2h、4h、6h、8h及10h取出沥干水分，称量重量得A2、A4、A6、A8、A10；以A2/A0、A4/A0、A6/A0、A8/A0、A10/A0来计算经过相应时间的饲料保持百分比，具体数据见表2所示。经测试，水产用湿性颗粒发酵饲料在水中的稳定性达到10h以上，而市售普通颗粒型饲料的稳定性明显处于劣势，在8h以上稳定性较差。
表2水产用湿性颗粒发酵饲料和市售普通颗粒型饲料浸泡试验结果
Figure BDA0002296407620000091
实施例4发酵饲料的应用
试验凡纳滨对虾共1500尾，初始体重为(0.55±0.03)g，平均分成5个处理组，每组50尾虾，各组设6个重复。对虾养殖试验在生物饲料开发国家工程研究中心试验基地进行，对照组饲喂市售凡纳滨对虾颗粒饲料，试验1-4组分别饲喂使用实施例2实验组1和对比例4-6制备的发酵饲料替代5％的市售凡纳滨对虾颗粒饲料，饲喂过程中每日定时、定量饲喂4次，并记录摄食量，其它养殖管理按常规方式进行，共饲喂49d。实验期间24h充气，溶解氧≥6mg/L，不定期吸污换水，进水均用200目筛网过滤，水温为26～30℃，氨氮≤0.3mg/L，pH7.8～8.3。养殖试验结束后，停食24h，逐个网箱称重、计数。
生长性能测定：
成活率(％)＝(试验结束时尾数/试验初始时尾数)×100
增重率(％)＝[(终末平均体重–初始平均体重)/初始平均体重]×100
特定生长率(％/d)＝(ln终末平均体重–ln初始平均体重)×100/试验周期
饲料系数＝平均摄食量/(终末平均体重–初始平均体重)
表3发酵饲料对凡纳滨对虾的生长性能影响
注：同列数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)；下表同。
试验1组虾体颜色透明，肝胰脏轮廓清晰，颜色红褐色，肠道饱满且粪便长度基本一致，对照组虾体颜色较深，部分微红，黑色斑点较多，肝胰脏轮廓清晰，体积偏大，颜色偏红，肠道较细且粪便长度不一致颜色较深。
试验数据如表3所示，与对照组相比，试验1组对虾生长速度明显高于对照组，增重率显著提高21.78％，饲料系数显著降低17.12％；特定增长率和成活率有提高趋势但差异不显著。而试验2-3组与对照组相比有改善趋势，但差异并不显著。表明，本发明技术方案制备的复合发酵菌剂发酵制备的发酵饲料对凡纳滨对虾生产性能的改善作用明显比对比例效果好，技术方案中复合发酵菌剂中各种菌之间产生了良好的协同作用。
实施例5发酵饲料的应用
选用罗氏沼虾虾苗规格(0.17±0.02)g，挑选规格整齐、健康无病的试验虾共计400尾，共分2组，每组设置4个重复，每个重复放养50尾虾。养殖试验在生物饲料开发国家工程研究中心试验基地进行，对照组饲喂市售罗氏沼虾颗粒饲料，试验组饲喂使用实施例2制备的发酵饲料替换5％的市售罗氏沼虾颗粒饲料，试验开始前用对照组饲料驯养5-7d，待虾能正常摄食且无死亡后开始试验。每天投喂4次(6:00、10:00、16:00、21:30)，以早晚投喂为主，日投喂量为罗氏沼虾体重的3％～5％，达表观饱食。实验为期64d，实验期间24h充气，溶解氧≥6mg/L，不定期吸污换水，进水均用200目筛网过滤，水温为26～30℃，氨氮≤0.3mg/L，pH 7.8～8.3。养殖试验结束后，停食24h，逐个网箱称重、计数。
试验结果如表4所示，结果表明，使用水产用湿性颗粒生物饲料后，对罗氏沼虾的生长起到了较好的促进作用，与对照组相比增重率和特定生长率有明显增加，分别增加13.57％和0.08，饲料系数降低0.21，成活率提高6.66个百分点。
表4发酵饲料对罗氏沼虾的生长性能影响
Figure BDA0002296407620000111
实施例6发酵饲料的应用
试验在生物饲料开发国家工程研究中心试验基地进行，试验鱼选用当年培育的体质健壮、规格整齐的雄性吉富罗非鱼(平均体重约为40g)300尾，随机分成2个组，每个组设5个重复，每个重复30尾。在室内淡水循环水族缸(有效体积为300L)中饲养试验鱼8周，对照组饲喂市售罗非鱼饲料，试验组饲喂使用实施例2实验组1制备的发酵饲料替换5％的市售罗非鱼饲料，日投饲率为体重的3％～5％，每天08:00、12:30、17:00各投喂1次。水源为曝气自来水，试验期间水温为(27.5±2.4)℃，pH为7.6±0.5，溶解氧浓度＞6.6mg/L。
表5发酵饲料对罗非鱼生长性能的影响
Figure BDA0002296407620000112
试验结果如表5所示，结果表明，使用水产用湿性颗粒发酵饲料后，对罗非鱼的生长起到了较好的促进作用，与对照组相比增重率和特定生长率有明显增加，分别增加0.23个百分点和0.15个百分点，饲料系数降低0.13。

Claims (10)

1.一种水产用复合发酵菌剂，其特征在于，所述复合发酵菌剂由复合菌体和载体按2～4:6～8质量配比混合低温干燥制得，所述复合菌体包括地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌。
2.如权利要求1所述复合发酵菌剂，其特征在于，所述载体为稻壳粉、石粉、玉米芯粉或淀粉中的一种或多种。
3.如权利要求1所述复合发酵菌剂，其特征在于，所述复合菌体各菌以CFU计地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌的比例为3～6：3：5～9：1～3。
4.如权利要求1所述复合发酵菌剂，其特征在于，所述复合菌体各菌以CFU计地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：植物乳杆菌：干酪乳杆菌的比例为5：3：7：2。
5.如权利要求1所述复合发酵菌剂，其特征在于，所述复合发酵菌剂中地衣芽孢杆菌活菌数≥8.0×109CFU/g，枯草芽孢杆菌活菌数≥2×109CFU/g，植物乳杆菌活菌数≥1.0×1010CFU/g，干酪乳杆菌活菌数≥1.0×109CFU/g。
6.权利要求1～5任一项所述复合发酵菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌分别进行发酵，在对数后期时结束发酵，将发酵液进行离心收集湿菌体，用生理盐水或磷酸缓冲液重悬菌体，将地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌按照菌落形成单位配比进行混合，得到复合菌体，将复合菌体与载体按照质量配比混合，低温干燥即得复合发酵菌剂。
7.一种水产用湿性颗粒发酵饲料，其特征在于，所述发酵饲料由下述原料经权利要求1～5任一项所述复合发酵菌剂发酵得到：鱼粉10％～15％，豆粕15％～20％，菜籽粕7％～15％，棉粕7％～15％，虾粉5％～10％，玉米5％～10％，乌贼膏2％～4％，氯化胆碱0.1％～0.3％，海藻酸钠0.3％～0.6％，糖蜜1％～3％及洁净水25％～30％；其中，发酵剂添加量为原料总量0.1％～0.5％；接种发酵时水分控制在30％～40％，投入制粒机中制粒，制粒后的湿性颗粒采用带单向呼吸阀呼吸袋进行包装，室温发酵3～7d。
8.权利要求7所述发酵饲料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)按照原料配方称取除糖蜜和洁净水之外的其他原料，粉碎过筛，预混合2～5min，得到原料粉末备用；
(2)称取复合发酵菌剂，按照1:50的重量比溶解于洁净水中，在35～37℃条件下活化12～24h，作为种子液备用；
(3)按照原料配方称取糖蜜和洁净水，将糖蜜、洁净水和步骤(2)得到的种子液混合，搅拌0.5～2min，作为菌液备用；
(4)将步骤(3)得到的菌液喷入步骤(1)得到的原料粉末中，搅拌2～5min，控制水分含量在30％～40％；
(5)将步骤(4)得到发酵饲料半成品投入制粒机中进行冷制粒；压缩比为18～24；
(6)制粒后发酵饲料水分控制在25％～35％；室温发酵3～7d即得。
9.权利要求1～5任一项所述复合发酵菌剂在制备水产用发酵饲料中的应用。
10.权利要求7所述的发酵饲料在水产养殖中的应用。
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