CN113862190A

CN113862190A - 一种复合生物发酵菌剂及其应用

Info

Publication number: CN113862190A
Application number: CN202111225468.7A
Authority: CN
Inventors: 黄贞胜; 庄淑芳; 谢晓露; 林斌
Original assignee: Xiamen Haijiacheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xiamen Haijiacheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-10-21
Filing date: 2021-10-21
Publication date: 2021-12-31

Abstract

本发明涉及复合微生物菌技术领域，公开了一种复合生物发酵菌剂及其应用，复合生物发酵菌剂由芽孢杆菌、粪肠球菌和载体混合制备而成，芽孢杆菌保藏号为GDMCC No.61925，通过复合生物发酵菌剂制备发酵水产颗粒饲料，提高水产颗粒饲料中的酶和菌的含量，从而使得水产动物能够充分吸收饲料的营养组分，保证养殖动物的顺利生长。

Description

一种复合生物发酵菌剂及其应用

技术领域

本发明涉及复合微生物菌技术领域，特别是一种复合生物发酵菌剂及其应用。

背景技术

在现代饲养业中，饲料中添加抗生素始于五十年代，对防治疾病，促进生长，增加饲料利用率，提高养殖经济效益起到重要作用。但是，随着饲料中长期大量地添加抗生素及化学合成药物，在养殖生产中出现了动物体内病原微生物产生耐药性，应用效果降低，生产成本加大；动物体内产生药物依赖，自身的免疫机能抑制，免疫力和抗病力降低；动物体内有益菌被抑制，菌群失调，形成内源性感染；动物产品及排泄物药物残留，危及人体健康；动物体内耐药菌的扩散，引起公共安全等重大问题，亟待解决。

因此，从八十年代始，有关益生菌在养殖业的应用研究快速发展。目前，国内外益生菌研究涉及的有益菌80余个品种。我国颁布的《饲料添加剂品种目录(2006)》准予使用菌共有16个。国内市场推广的芽孢杆菌制剂有促菌生、整肠生、抑菌生、乳康生等；乳酸菌制剂以乳酸菌属和双歧杆菌属为主。益生菌作为一种新型天然的生物活性添加剂，无毒，无抗药性，无残留，并具有增强免疫力，促进生长，提高饲料利用率的功效，可以替代抗生素应用于养殖生产中。

现有的，在水产养殖用饲料中，常见将豆粕、饼粕、麦麸等农副产品作为饲料的主要营养源，豆粕、饼粕、麦麸含量较高，容易对动物体内某些消化酶起抑制作用或与营养物质络合成不易消化的成份，使得吸收困难，另一方面对动物体内的某些器官起到破坏作用，对动物的生理、生长、健康造成不良影响。

发明内容

为此，需要提供一种复合生物发酵菌剂及其应用，解决水产饲料容易引起养殖动物不良影响，营养难以被水产动物有效吸收的问题。

为实现上述目的，本发明提供了一种复合生物发酵菌剂，由芽孢杆菌、粪肠球菌和载体混合制备而成，枯草芽孢杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期是2021年9月9日，保藏号为GDMCC No.61925。

枯草芽孢杆菌能迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长；枯草芽孢杆菌刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力；枯草芽孢杆菌菌体自身合成多种酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，从而加强消化吸收功能，促进动物加速生长发育。

粪肠球菌是目前微生物青贮接种剂主要菌种之一，它经过系列工艺制成的微生物制剂直接投喂养殖动物后，有利于改善肠道内微生态平衡，防治动物肠道菌丛区系紊乱，还能分解蛋白质为小肽、合成B族维生素等功效。它也能增强巨嗜细胞的活性，促进动物的免疫反应，提高抗体水平。粪链球菌作用于豆粕、麦麸等植酸磷含量较高的饲料成分中，通过催化、水解等反应分泌出的L-乳酸，它可以对钙质合成L-乳酸钙，促进养殖动物对钙质的吸收。所以饲料中添加粪链球菌可减少养殖中有机物和矿物质排泄量有效地减少水质污染。

进一步，所述芽孢杆菌的活菌数≥1×10⁸CFU/g，所述粪肠球菌的活菌数≥1×10⁸CFU/g，所述芽孢杆菌和粪肠球菌的质量比为(3-5):1。

进一步，所述复合生物发酵菌剂中含菌量为100-400mg/g。

进一步，所述载体为玉米粉、小麦粉、麦芽糊精、葡萄糖中的一种或多种。

上述的复合生物发酵菌剂的应用，应用于发酵水产颗粒饲料。

进一步，包括如下步骤：

(1)将上述的复合生物发酵菌剂加入到水中，搅拌混合均匀，静置发酵40-80分钟，发酵温度为30-37℃，使菌株活化，得到发酵液；

(2)将水产颗粒饲料加入到真空搅拌机内，边搅拌边将发酵液通过真空喷雾机喷淋到水产颗粒饲料上；

(3)喷淋完成后，水产颗粒饲料继续在真空搅拌机内停留5-10min，之后出料装入容器，进行半发酵，发酵时间为4～10天，发酵温度为20～45℃，发酵完成得到发酵水产颗粒饲料。

进一步，所述步骤(1)中，水中复合生物发酵菌剂的添加量为0.2-2.0g/kg。

进一步，所述发酵液为间断式喷淋，间断式喷淋的频率为喷10s，停10s。

进一步，所述发酵液的喷淋量为每吨水产颗粒饲料喷淋200-400kg发酵液。

进一步，步骤(2)中，与发酵液喷淋的同时或者在其之后，对水产颗粒饲料喷淋洁净水量，控制水产颗粒饲料水分为33％-40％。

上述技术方案具有以下有益效果：

本发明中，枯草芽孢杆菌为经过诱变筛选得到的能够产生活性肽的菌株，粪肠球菌为常规的可得到的菌种，枯草芽孢杆菌产生的活性肽与粪肠球菌相结合具有较强的生物活性，对水产颗粒饲料有充分的分解发酵能力，通过本发明复合生物发酵菌剂发酵制备的发酵水产颗粒饲料能够提高诱食性，提高水产颗粒饲料中的酶和菌的含量，从而使得水产动物能够充分吸收饲料的营养组分，保证养殖动物的健康生长。

附图说明

图1为副溶血弧菌拮抗菌株筛选的菌株的生长曲线。

图2为筛选的菌株活性肽进行拮抗副溶血弧菌的抑菌圈图。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1

产生活性肽的枯草芽孢杆菌的诱变和筛选方法包括如下步骤：

1.菌株筛选用采集到的土壤制备菌悬液，于无菌环境中，将200ul菌悬液均匀涂布于LB固体培养基平板上，于37℃恒温培养箱中培育24h。

LB固体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，15g琼脂粉，1L蒸馏水，调节pH为7.3±0.2，121℃高压灭菌20min。

2.菌株纯化鉴定培养基表面长满单菌落后，根据菌株外观性状，挑取疑似枯草芽孢杆菌单菌落，分别接种于LB液体培养基中，摇床37℃，200r/min培养18h。

取培育后的菌液稀释成10^-2，10^-3浓度梯度，分别吸取100ul菌悬液涂布于LB固体培养基平板中，于37℃恒温培养箱中培育24h。得纯化后的单菌落，对单菌落进行PCR扩增后送测序鉴定，选取确定为枯草芽孢杆菌的菌落菌液于-20℃冰箱中保藏备用。

LB液体培养基：5g酵母提取物，10g胰蛋白胨，10g氯化钠，1L蒸馏水，调节pH为7.3±0.2，121℃高压灭菌20min。

3.副溶血弧菌拮抗菌株筛选挑取枯草芽孢杆菌单菌落，分别接种于LB液体培养基中，摇床37℃，200r/min培养18h。取枯草芽孢杆菌菌体和发酵上清液接种于涂有副溶血弧菌的LB固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培育24h。根据菌株生长状况及抑菌圈的形成情况，选取与副溶血弧菌有拮抗作用的菌株。

4.菌株生长曲线测定分别取与副溶血弧菌有拮抗作用的菌株，接种于100ml LB液体培养基中，37℃、230r/min摇床培养。采用吸光光度法绘制各个枯草芽孢杆菌菌株的生长曲线，每隔2h用移液器取样，测定波长600nm的OD值，并作记录，连续测定24h，绘制菌株生长曲线(如图1所示)。

5.诱变菌株悬液制备根据菌株的生长曲线，在菌株的对数生长期，取2ml菌液，4000r/min，离心5min，无菌水冲洗2次弃上清，再次加入无菌水制成菌悬液，用血球计数板测定细菌个数，后用无菌水梯度稀释，制成菌种个数在10⁸左右的菌悬液供后续使用。

6.EMS诱变及乙硫氨酸抗性平板筛选在第5步骤中10⁸菌悬液内加入0.5mol/L的EMS，摇床25℃,200r/min振荡处理50min，加入终体积6％硫代硫酸钠溶液终止反应。4000r/min，离心5min，弃上清，无菌水冲洗2次，稀释后涂布于3.0g/L乙硫氨酸抗性平板上，于37℃恒温培养箱中培育24h。

乙硫氨酸抗性平板：将过滤除菌的乙硫氨酸溶液加入灭菌后的LB固体培养基中。

7.副溶血弧菌拮抗筛选挑取乙硫氨酸平板上长出的菌落，进行液体培养后，将菌体及发酵上清液接种于涂有副溶血弧菌的固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培育24h。

8.UV诱变和乙硫氨酸抗性平板筛选将步骤(7)下与副溶血弧菌有拮抗作用的菌株平板，置于8wUV光源20cm处诱变90s。将诱变后平板继续培养，挑取菌株，接种于LB液体培养基中摇床培养。

9.副溶血弧菌拮抗筛选将步骤(8)下培养的菌液，离心后，将菌体及发酵上清液接种于涂有副溶血弧菌的固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培育24h。挑选拮抗作用大的菌株，用LB液体培养基扩大培养，于-20℃保藏。

10.枯草芽孢杆菌传代稳定性筛选将选取的枯草芽孢杆菌摇床培育，菌体及发酵上清液接种于涂有副溶血弧菌的固体培养基上，连续数代，检测其拮抗副溶血弧菌的稳定性，选择具有抑菌圈的菌株，如图2所示。

选择的枯草芽孢杆菌菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期是2021年9月9日，保藏号为GDMCC No.61925。

实施例2

一种复合生物发酵菌剂，由实施例1的芽孢杆菌、粪肠球菌和载体混合制备而成。

载体制备过程如下：

以重量份数计，准确称取玉米粉50份，小麦粉15份，麦芽糊精5份，葡萄糖5份，充分混合均匀。

复合生物发酵菌剂的制备过程：芽孢杆菌、粪肠球菌和载体按照质量比为(3-5):1：X(X为载体根据需要进行添加以制得复合生物发酵菌剂中菌含量为100-400mg/g)的比例置于搅拌罐中，加水搅拌混合均匀，经喷雾干燥得复合物生物发酵菌剂，喷雾干燥进风温度为130-150℃，出风温度为80-85℃。

本实施例中，芽孢杆菌、粪肠球菌和载体按照质量比为4：1：45，进行混合制粒，得到的复合生物发酵菌剂的含菌量为100mg/g。

实施例3

与实施例2不同的是，芽孢杆菌、粪肠球菌和载体按照质量比为4：1：20，进行混合制粒，得到的复合生物发酵菌剂的含菌量为200mg/g。

实施例4

与实施例2不同的是，芽孢杆菌、粪肠球菌和载体按照质量比为5：1：14，进行混合制粒，得到的复合生物发酵菌剂的含菌量为300mg/g。

实施例5

与实施例2不同的是，芽孢杆菌、粪肠球菌和载体按照质量比为3：1：16，进行混合制粒，得到的复合生物发酵菌剂的含菌量为200mg/g。

实施例6

与实施例2不同的是，芽孢杆菌、粪肠球菌和载体按照质量比为6：2：12，进行混合制粒，得到的复合生物发酵菌剂的含菌量为400mg/g。

实施例7

实施例2制备的复合生物发酵菌剂在发酵水产颗粒饲料的应用，包括如下步骤：

(1)将实施例2得到的复合生物发酵菌剂加入到水中，水中复合生物发酵菌剂的添加量为0.5g/kg，搅拌混合均匀，静置发酵60分钟，发酵温度为30-37℃，使菌株活化，得到发酵母液；

(2)将水产颗粒饲料加入到真空搅拌机内，调节转速，边搅拌边将发酵母液和洁净水通过真空喷雾机喷淋到水产颗粒饲料上，真空搅拌机真空负压为-0.08Mpa。所述发酵液为间断式喷淋，间断式喷淋的频率为喷10s，停10s，所述发酵母液的喷淋量为每吨水产颗粒饲料喷淋300kg发酵母液，所加洁净水量控制最终水分为33％的范围内；

(3)喷淋完成后，水产颗粒饲料在真空搅拌机内停留5min，之后出料装入容器，进行半发酵，发酵时间为8天，发酵温度为20～45℃，半发酵完成后得到发酵水产颗粒饲料。

实施例8

复合生物发酵菌剂在发酵水产颗粒饲料的应用，与实施例7不同的点是：

(1)水中复合生物发酵菌剂的添加量为0.2g/kg，静置发酵80分钟；

(2)发酵母液的喷淋量为每吨水产颗粒饲料喷淋350kg发酵母液喷淋完后，再喷淋洁净水，水产颗粒饲料水分控制在40％；

(3)喷淋完成后，水产颗粒饲料继续在真空搅拌机内停留10min，进行半发酵，发酵时间为10天，半发酵后得到发酵水产颗粒饲料。

实施例9

(1)水中复合生物发酵菌剂的添加量为2.0g/kg，静置发酵40分钟；

(2)发酵母液的喷淋量为每吨水产颗粒饲料喷淋100kg，发酵母液喷淋完后，再喷淋洁净水，水产颗粒饲料水分控制在35％；

(3)喷淋完成后，水产颗粒饲料继续在真空搅拌机内停留10min，进行半发酵，发酵时间为4天。

实施例10

复合生物发酵菌剂在发酵水产颗粒饲料的应用，与实施例7不同的点是：步骤(2)中发酵母液的喷淋量为每吨水产颗粒饲料喷淋200kg。

实施例11

复合生物发酵菌剂在发酵水产颗粒饲料的应用，与实施例7不同的点是：步骤(2)中发酵液的喷淋量为每吨水产颗粒饲料喷淋400kg发酵液。

实施例7、实施例10、实施例11制备的发酵水产颗粒饲料进行喂养草鱼实验。

1.试验用健康草鱼800尾，体态均匀，体长为13±1cm，平均体重约25±2g，分成4组，每组200尾，设4个平行，每个试验平行组50尾，试验组饲喂发酵饲料，对照组饲喂普通水产颗粒饲料，分组详情如下：

试验组1：喂养实施例7制备的发酵水产颗粒饲料。

试验组2：喂养实施例10制备的发酵水产颗粒饲料。

试验组3：喂养实施例11制备的发酵水产颗粒饲料。

对照组：喂养普通水产颗粒饲料。

2.饲养管理

试验初始详细记录每组草鱼体重，试验过程中，每日投喂2次，详细记录每日投料重量(以半小时饲料基本吃完为准)，试验期60天。试验期间保持水体pH为7.5左右，水温26℃左右，水体溶解氧大于8mg/L^-1。

最后一次投喂后空腹12h，计算存活数，测量最终鱼体体长(精确至1mm)和体重(精确至0.01g)，计算增重率＝总鱼体净增重/初始体重×100％；饲料系数＝饲料投喂量/鱼体净增重。

3.试验结果

试验结果如表1所示。

由表1可知，通过本发明方法制备的发酵水产饲料，能够提高草鱼生长的增重率，且在试验2组的增重率最高，从饲料系数上看，能够提高草鱼对饲料的营养吸收，试验组的饲料系数均低于对照组，且在试验2组有显著的降低。

表1发酵水产颗粒饲料对草鱼生长的影响

本发明中的复合生物发酵菌剂能够用于各类水产颗粒饲料，包括不限于鱼类、虾类、蟹类和贝类等水产动物的饲料。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims

1.一种复合生物发酵菌剂，其特征在于，由芽孢杆菌、粪肠球菌和载体混合制备而成，枯草芽孢杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏日期是2021年9月9日，保藏号为GDMCC No.61925。

2.如权利要求1所述的复合生物发酵菌剂，其特征在于，所述芽孢杆菌的活菌数≥1×10⁸CFU/g，所述粪肠球菌的活菌数≥1×10⁸CFU/g，所述芽孢杆菌和粪肠球菌的质量比为(3-5):1。

3.如权利要求1所述的复合生物发酵菌剂，其特征在于，所述复合生物发酵菌剂中含菌量为100-400mg/g。

4.如权利要求1所述的复合生物发酵菌剂，其特征在于，所述载体为玉米粉、小麦粉、麦芽糊精、葡萄糖中的一种或多种。

5.如权利要求1-4任一所述的复合生物发酵菌剂的应用，其特征在于，应用于发酵水产颗粒饲料。

6.如权利要求5述的复合生物发酵菌剂的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将权利要求1-4任一所述的复合生物发酵菌剂加入到水中，搅拌混合均匀，静置发酵40-80分钟，发酵温度为30-37℃，使菌株活化，得到发酵液；

7.如权利要求6述的复合生物发酵菌剂的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，水中复合生物发酵菌剂的添加量为0.2-2.0g/kg。

8.如权利要求6述的复合生物发酵菌剂的应用，其特征在于，所述发酵液为间断式喷淋，间断式喷淋的频率为喷10s，停10s。

9.如权利要求6述的复合生物发酵菌剂的应用，其特征在于，所述发酵液的喷淋量为每吨水产颗粒饲料喷淋200-400kg发酵液。

10.如权利要求6述的复合生物发酵菌剂的应用，其特征在于，步骤(2)中，与发酵液喷淋的同时或者在其之后，对水产颗粒饲料喷淋洁净水，控制水产颗粒饲料水分为33％-40％。