CN110938570B

CN110938570B - 一种多粘类芽孢杆菌Lla-02及其应用

Info

Publication number: CN110938570B
Application number: CN201911281263.3A
Authority: CN
Inventors: 薛静; 张秀海; 车云林; 陈绪清; 刘敬振; 杨凤萍; 张国宁; 张铭芳; 杜运鹏; 高俊莲
Original assignee: BEIJING AGRO-BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Current assignee: BEIJING AGRO-BIOTECHNOLOGY RESEARCH CENTER
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2021-03-05
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: CN110938570A

Abstract

本发明公开了一种多粘类芽孢杆菌Lla‑02(Paenibacillus polymyxa)，保藏号CGMCC NO.18753，保藏日期：2019年10月28日。所述多粘类芽孢杆菌Lla‑02对尖孢镰刀菌、灰霉葡孢、百合枯萎病菌、葡萄座腔菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均具有抑菌活性。所述多粘类芽孢杆菌Lla‑02能够使‘穿梭’的株高、叶片长度和根长得到显著提高，使‘白天堂’的株高、鳞茎重和根长得到显著提高。

Description

一种多粘类芽孢杆菌Lla-02及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，特别是涉及一种多粘类芽孢杆菌Lla-02及其应用。

背景技术

多粘类芽孢杆菌在分类学上的地位是：厚壁菌门，芽孢杆菌科，类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。类芽孢杆菌属的细菌在自然界中分布较广，它们是一类生理特性多样的杆状细菌，也是土壤与植物微生态的优势种群之一。在农业中的应用主要体现在两个方面：一是作为微生物肥料促进植物的生长和增产；二是作为生物农药防治植物多种病害。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种多粘类芽孢杆菌Lla-02及其应用。

多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)对人畜无致病性，可产生多种抗菌蛋白、多粘菌素、核苷类、酚类以及吡嗪类化合物等抗菌物质以及IAA等植物生长调节剂，有很好的应用前景。本发明从百合鳞片中分离到一株内生多粘类芽孢杆菌，命名为Lla-02。以尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、灰霉葡孢(Botrytis cinerea)、百合枯萎病菌(Fusariumproliferatum)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌为指示菌，进行抑菌活性测定，Lla-02对所有测定的菌株都具有抑菌活性。

一种多粘类芽孢杆菌Lla-02(Paenibacillus polymyxa)，保藏号CGMCCNO.18753，保藏日期：2019年10月28日。

本发明所述的多粘类芽孢杆菌Lla-02，其具有如下微生物学特性：菌落突出、呈水滴样、表面湿润、有光泽、半透明，菌落边缘整齐，菌体直径0.7μm，长2-4μm。

本发明所述的多粘类芽孢杆菌Lla-02，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

本发明所述的多粘类芽孢杆菌Lla-02对尖孢镰刀菌、灰霉葡孢、百合枯萎病菌、葡萄座腔菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均具有抑菌活性。

本发明所述的多粘类芽孢杆菌Lla-02在促进‘穿梭’和‘白天堂’两个百合品种生长发育中以及在提高植物抗旱性能中的应用。

本发明所述的应用，其中，所述多粘类芽孢杆菌Lla-02能够使‘穿梭’的株高、叶片长度和根长得到显著提高，所述多粘类芽孢杆菌Lla-02能够使‘白天堂’的株高、鳞茎重和根长得到显著提高。

本发明多粘类芽孢杆菌Lla-02与现有技术不同之处在于：

本发明通过研究发现多粘类芽孢杆菌Lla-02对对尖孢镰刀菌、灰霉葡孢、百合枯萎病菌、葡萄座腔菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均具有抑菌活性。

‘穿梭’、‘白天堂’两种商业百合都表现出生长促进作用，能够使‘穿梭’的株高、叶片长度和根长得到显著提高，能够使‘白天堂’的株高、鳞茎重和根长得到显著提高。植物的根长与植物的抗旱性能有密切关系，增加根长同时对于植物抗旱性能也有一定的作用。更重要的是，多粘类芽孢杆菌Lla-02处理显著增加了白天堂的球茎重量，因此，对于百合种球的生产具有增产的作用。

下面结合附图对本发明的多粘类芽孢杆菌Lla-02及其应用作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中多粘类芽孢杆菌Lla-02的菌落形态；

图2为本发明中多粘类芽孢杆菌Lla-02电镜图片；

图3为本发明中多粘类芽孢杆菌Lla-02的抑菌活性试验图；其中，A，尖孢镰刀菌；B，灰霉葡孢；C，百合枯萎病菌；D，葡萄座腔菌；E，大肠杆菌；F，金黄色葡萄球菌；G，沙门氏菌。

具体实施方式

1材料与方法

1.1供试菌株

指示菌株：尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、灰霉葡孢(Botrytis cinerea)、百合枯萎病菌(Fusarium proliferatum)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，ATCC29213)、沙门氏菌(Salmonella)。

1.2供试培养基

LB培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。

PDA培养基：马铃薯提取物4g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，pH5.6。

优化培养基：蔗糖，15％，硫酸镁，5％，蛋白胨，10％。

1.3PCR引物

采用细菌16S rDNA的通用引物：上游引物F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物R：5'-CGGTGTGTACSSGGCCCGGGAACG-3'，由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.4方法

1.4.1百合内生菌的分离筛选

百合鳞片(百合为卷丹Lilium lancifolium)用流水冲洗干净，之后用75％乙醇处理1min，水洗1次，3％二氯异氰尿酸钠处理20min，水洗3-5次。最后一次洗涤的水作为阴性对照。百合鳞片表面切除，之后切成小块，放于LB培养基上，28℃培养两天，挑取单菌落进行纯化培养。

1.4.2抗真菌菌活性的测定

将指示菌在PDA培养基上活化4天，用微量移液器枪头尾部圆孔将该培养基戳下若干个“小圆片”；用枪尖将其挑起，将菌圆片接种在新鲜的PDA培养基中间，置于28℃恒温培养箱中培养2-3天，在培养皿底部画“十字”形分割线分为四个平均大小相同的区域，接着在距离菌圆片2-3cm的等距离的4个区域，接上25uL待测菌菌悬液。实验组和对照组各做三个重复，在28℃培养箱培养4～5天后观察拮抗效果。

1.4.2抗细菌活性测定

采用牛津杯法测定抗细菌活性：将指示菌涂布于LB固体培养基平板上，每个平板上打两个孔，一个点样30μL发酵液，一个点样30μL空白培养基。28℃培养24h后，测量抑菌圈直径，每组试验重复测3次。

1.4.3 16S r DNA序列比对及系统发育分析

提取细菌基因组DNA，采用细菌16S rDNA的通用引物进行扩增。扩增体系为rTaq酶(5U/μL)12.5μL，上游引物和下游引物(2.5μmol/L)各1μL，模板DNA2μL，最后加双蒸水至50μL，PCR反应条件：94℃变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸10min反应结束。PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

将16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行同源性分析(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)，利用Mega软件进行比对及建树，重复次数为1000次。

1.4.4发酵条件的优化及发酵液的制备

将多粘类芽孢杆菌菌株Lla-02在LB培养基中30℃，180rpm，振荡培养18-24小时。1％转接到不同培养基中进行培养基的筛选优化，培养条件为30℃，180rpm，48小时。测定600nm的OD值，根据OD值选择最佳培养基。以优化培养基进行菌株的扩大培养。

多粘类芽孢杆菌Lla-02(Paenibacillus polymyxa)，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏号CGMCC NO.18753，保藏日期：2019年10月28日。

1.4.5温室盆栽实验

将的菌株Lla-02在5ml LB中培养10-15小时，然后接种于50ml LB，220rpm、30℃继续培养24小时。稀释10倍浸泡百合种球40分钟。将草炭土、珍珠岩、蛭石按2:1:1的比例混合后装盆。在每个盆中播种3个百合球。盆栽采用完全随机设计(CRD)。每个处理5盆。花盆放在底部有洞的塑料托盘里。在塑料托盘中加入等量的自来水，每隔一段时间浇一次水。在营养和生殖的高峰期，统计株高、叶长、叶宽、球茎重量、根长等形态指标。

2结果与分析

2.1菌株的筛选

从百合鳞片中分离出多个内生菌，根据16s r DNA序列比对分析，其中1株为多粘类芽孢杆菌。序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，具体如下：

GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGGGTTAATTAGAAGCTTGCTTCTAATTAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGCTTGATAGAGTAACTGCTCTTGAAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCCGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGACCTTTCCCTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGGAGCGATCTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGTAGATGATTGGGGTG2.2菌株形态及电镜观察

菌落突出、呈水滴样、表面湿润、有光泽、半透明，菌落边缘整齐(图1)。菌体直径0.7μm，长2-4μm(图2)。

2.4培养基及培养条件

菌株首先在LB培养基中30℃，180rpm，振荡培养24小时。1％转接到不同培养基中进行培养基的筛选。其中以LB为基础培养基，分别替换C源、N源和盐，培养两天后测定600nm下的OD值，根据OD值确定最佳培养基为：蔗糖，15％，硫酸镁，5％，蛋白胨，10％，pH7.0。进而对转接量进行优化，分别转接1％、3％、5％、7％和10％，最终确定最佳转接量为7％，在优化的培养基中220rpm、30℃培养两天后OD600为6.947。

2.5植物生长促进活性

通过温室盆栽实验研究了多粘类芽孢杆菌Lla-02对穿梭、白天堂两个百合品种在温室条件下生长发育的促进作用。在盆栽前，用菌株Lla-02或培养基(作为对照)浸泡百合球茎，生长期结束后，测定对照组和接种组之间的株高、花芽数、叶长、叶宽、茎粗、鳞茎重和根长等生长参数。穿梭百合在经菌株Lla-02处理后，一些生长参数，例如株高、叶片长度和根长，都显著高于对照，且差异显著。其他生长参数如花芽数、叶宽、茎粗、鳞茎重等也高于对照，但没有显著差异(表1)。白天堂则在株高、鳞茎重和根长上都较对照有显著提高(表2)。

表1多粘类芽孢杆菌Lla-02对穿梭百合的生长促进活性

平均值是平均值±标准差(SD)，每一列的字母不同表示t检验有显著性差异(P≤0.05)。

表2多粘类芽孢杆菌Lla-02对白天堂的生长促进活性

多粘类芽孢杆菌是一种能产生芽孢的革兰氏阳性菌，该菌对人畜无致病性。多粘类芽孢杆菌可产生多种抗菌蛋白、多粘菌素、核苷类、酚类以及吡嗪类化合物等抗菌物质以及IAA等植物生长调节剂。对终极腐霉菌(Pythium ultimum)、德巴利腐霉(Pythiumdebaryanum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、番茄叶霉病菌(Cladosporium fulvum)等具有明显的抑制作用。

之前未见对百合枯萎病菌有抑菌活性的多粘芽孢杆菌的报道。APEC136菌株对葡萄座腔菌有微弱的抑菌活性。而我们所分离到的多粘芽孢杆菌对百合枯萎病菌和葡萄座腔菌均有明显的抑菌活性。可用于防治百合枯萎病和叶尖干枯病。此外，Lla-02对尖孢镰刀菌和灰霉葡孢有明显的抑菌作用，同时也可以用于防治百合根腐病和百合灰霉。

此外，实验中发现多粘类芽孢杆菌Lla-02对‘穿梭’、‘白天堂’两种商业百合都表现出生长促进作用，根长都较对照有显著增加，植物的根长与植物的抗旱性能有密切关系，增加根长同时对于植物抗旱性能也有一定的作用。更重要的是，多粘类芽孢杆菌Lla-02处理显著增加了白天堂的球茎重量，因此，对于百合种球的生产具有增产的作用。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 北京农业生物技术研究中心

<120> 一种多粘类芽孢杆菌Lla-02及其应用

<130> 191-122

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> 卷丹(Lilium longiflorum)

<400> 1

gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc ggggttaatt agaagcttgc 60

ttctaattaa cctagcggcg gacgggtgag taacacgtag gcaacctgcc cacaagacag 120

ggataactac cggaaacggt agctaatacc cgatacatcc ttttcctgca tgggagaagg 180

aggaaaggcg gagcaatctg tcacttgtgg atgggcctgc ggcgcattag ctagttggtg 240

gggtaaaggc ctaccaaggc gacgatgcgt agccgacctg agagggtgat cggccacact 300

gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg 360

gcgaaagcct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct 420

gttgccaggg aagaacgctt gatagagtaa ctgctcttga agtgacggta cctgagaaga 480

aagccccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggggcaa gcgttgtccg 540

gaattattgg gcgtaaagcg cgcgcaggcg gctctttaag tccggtgttt aatcccgagg 600

ctcaacttcg ggtcgcactg gaaactgggg agcttgagtg cagaagagga gagtggaatt 660

ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct 720

ctgggctgta actgacgctg aggcgcgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct 780

ggtagtccac gccgtaaacg atgaatgcta ggtgttaggg gtttcgatac ccttggtgcc 840

gaagttaaca cattaagcat tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg 900

aattgacggg gacccgcaca agcagtggag tatgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga 960

accttaccag gtcttgacat ccctctgacc ggtctagaga tagacctttc cctcgggaca 1020

gaggagacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1080

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actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200

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Claims

1.一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)Lla-02，保藏号：CGMCC NO.18753，保藏日期：2019年10月28日；所述多粘类芽孢杆菌Lla-02的16s rDNA核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌Lla-02，其特征在于：具有如下微生物学特性：菌落突出、呈水滴样、表面湿润、有光泽、半透明，菌落边缘整齐，菌体直径0.7μm，长2-4μm。

3.根据权利要求1或2所述的多粘类芽孢杆菌Lla-02，其特征在于：对尖孢镰刀菌、灰霉葡孢、百合枯萎病菌、葡萄座腔菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌均具有抑菌活性。

4.权利要求1或2所述的多粘类芽孢杆菌Lla-02在促进‘穿梭’和‘白天堂’两个百合品种生长发育中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述多粘类芽孢杆菌Lla-02能够使‘穿梭’的株高、叶片长度和根长得到显著提高，所述多粘类芽孢杆菌Lla-02能够使‘白天堂’的株高、鳞茎重和根长得到显著提高。