CN105733990A - 一株多粘类芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一种多粘类芽孢杆菌（<i>Paenibacillus </i><i>polymyxa</i>），保藏编号为CCTCC NO：M2015004。本发明所述多粘类芽孢杆菌抑菌谱较宽，对藤仓赤霉菌、尖孢镰刀菌、单丝壳白粉病菌和小麦根腐病菌均具有较强的抑制效果。该菌株能显著提高水稻的发芽率，并且对水稻恶苗病有显著的防治效果，100倍发酵稀释液对水稻恶苗病的防治效率可达到80%以上。该菌株还能有效防治草莓白粉病，当菌液稀释至800倍时，该菌株对草莓白粉病的防治效率仍能高于92%，效果非常显著。此外，所述多粘类芽孢杆菌对由镰刀菌和根腐病菌引起的植物枯萎病和根腐病也具有明显的拮抗作用，防治效率高于90%，可广泛应用于防治植物病害，前景广阔。

Description

一株多粘类芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用
技术领域
本发明涉及微生物筛选与应用技术领域，特别是涉及一株多粘类芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用。
背景技术
植物在生长发育过程中，由于遭受其他生物的侵染或不利非生物因素的影响，使其生长发育受到阻碍，导致产量降低、品质变劣、甚至死亡的现象称为植物病害。长期以来，使用化学杀菌剂是防治植物病害的主要手段，但频繁的使用化学杀菌剂使植物病原菌产生了抗药性,不仅不能有效地控制病害,还增加了环境污染。植物病害的防治措施由单纯依赖于化学防治逐渐向环境友好、经济效益较高的生物防治转变成为大势所趋。
植物病原物在生长发育以及致病过程中均受到来自于寄主植物、环境条件的影响，利用有益微生物来控制病害发生发展的方法称之为植物病害生物防治，而这些有益微生物则称为植物病害生防菌。生物防治与化学防治不同，其不仅对人畜安全，而且对环境友好。同时，植物病害生防菌具有改善环境、获得长期效益作用，符合现阶段植物病害控制的发展方向。
生防菌的种类繁多，生产上广泛应用的主要是真菌和细菌。生防真菌主要包括木霉菌、毛壳菌、青霉菌、厚壁孢子轮枝菌及菌根真菌、盾壳霉、粘帚霉等，已知的木霉菌至少可寄生18属29种植物病原菌，如核盘菌属、长孺孢属、镰刀菌属、蜜环菌属、炭疽菌属、丝核菌属、轮枝孢属、黑星菌属；毛壳菌具有降解纤维素、有机质特性，鉴于此，其广泛应用于植物病原菌的生物防治方面，其中，球毛壳菌、角毛壳菌均可以较好地预防甘蔗猝倒病，以及较好地防治番茄枯萎病和苹果斑点病的发生，对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌有抑制作用，此外，球毛壳菌还可以较好地保护谷物、燕麦和大麦免受由雪腐镰刀菌和禾旋孢霉引起的幼苗枯萎。生防细菌一般包括芽孢杆菌属、游动放线菌属、假单孢菌属、黄单孢菌属、链霉菌属、土壤杆菌属、产碱菌属、节杆菌属、固氮菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、小单孢菌属和根瘤菌属。其中枯草芽孢杆菌C-22对棉花炭疽病菌、枯萎病菌、立枯病菌、黄萎病菌、棉花疫霉病菌和棉花叶斑病菌均有较好的抑制作用；枯草芽孢杆菌XG-1对西瓜枯萎病菌菌丝生长具有较强的抑制作用，同时，枯草芽孢杆菌Henu11对禾谷丝核菌具有较好的抑制作用。
目前，生防菌在植物病害防治中存在自然条件下定殖能力差、抗药能力弱及防治效果不稳定等问题，因此进一步筛选性能优良、稳定性好的微生物菌种用于防治植物病害，是目前本领域内的研究重点。
发明内容
本发明的目的是提供一株多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）及其在植物病害防治中的应用。申请人从土壤中筛选出一株新型多粘类芽孢杆菌，该菌株对藤仓赤霉菌、尖孢镰刀菌、单丝壳白粉病菌和小麦根腐病菌均具有较强的抑制效果，应用前景广阔。
本发明一方面提供了一种多粘类芽孢杆菌VP-3（PaenibacilluspolymyxaVP-3），并于2016年3月23日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016138。
本发明另一方面提供了一种包含上述多粘类芽孢杆菌的微生物制剂。
本发明还涉及上述微生物制剂在植物病害防治中的应用。
所述植物病害为赤霉病、白粉病、枯萎病和根腐病中的任意一种。
所述微生物制剂在植物病害防治中的应用，具体方法为将微生物制剂稀释0-800倍，优选400倍，喷洒于植物叶片、茎或根部。
本发明所述多粘类芽孢杆菌抑菌谱较宽，对藤仓赤霉菌、尖孢镰刀菌、单丝壳白粉病菌和小麦根腐病菌均具有较强的抑制效果。该菌株能显著提高水稻的发芽率，并且对水稻恶苗病有显著的防治效果，100倍发酵稀释液对水稻恶苗病的防治效率可达到80%以上。该菌株还能有效防治草莓白粉病，当菌液稀释至800倍时，该菌株对草莓白粉病的防治效率仍能高于92%，效果非常显著。此外，所述多粘类芽孢杆菌对由镰刀菌和根腐病菌引起的植物枯萎病和根腐病也具有明显的拮抗作用，防治效率高于90%，可广泛应用于防治植物病害，前景广阔。
具体实施方式
实施例1菌株的筛选及鉴定
1、菌株初筛
采集山东济宁滨湖稻区滕州市水稻田5-15cm处土壤10g，加入盛有90mL无菌水的三角瓶中，摇床震荡30min摇匀，将摇匀的三角瓶置80℃水浴处理30min杀死营养体。将处理液依次10倍递增稀释，取不同稀释倍数的液体各100μL，均匀涂布于营养琼脂平板上，37℃培养48h。分别挑取不同形态的单菌落重新划线平板进行分离纯化，共获得21株菌，依次命名为VP-1，VP-2，……，VP-21。
2、抑菌实验复筛
（1）对藤仓赤霉菌的抑菌效果复筛
采用平板对峙法，在PDA平板中央接种藤仓赤霉菌（Gibberellafujikuroi）（青岛农业大学赠送），在距培养皿中央30mm处均匀地点种上述筛选得到的菌株（VP-1，VP-2，……，VP-21），每个平板点种3个菌落，每株菌做3个平行。将接种藤仓赤霉菌和上述菌株的平板置于30℃培养箱培养5d，测量抑菌圈大小。结果显示，菌株VP-2、VP-3和VP-19对藤仓赤霉菌的抑菌效果最明显。
（2）对其它致病菌抑菌效果复筛
采用平板对峙法，在PDA平板中央分别接种致病菌尖孢镰刀菌（青岛农业大学赠送）、单丝壳白粉病菌（分离自惜福镇黄瓜种植大棚）和小麦根腐病菌（分离自平度种植地小麦病株），在距培养皿中央30mm处均匀地点种上述筛选的菌株VP-2、VP-3和VP-19，每个平板点种3个菌落，每株菌做3个平行。将接菌后的平板置于30℃培养箱培养5d，观察抑菌圈大小。结果显示，只有菌株VP-3对尖孢镰刀菌、单丝壳白粉病菌和小麦根腐病菌均有显著的抑制效果。
上述结果表明，本发明筛选到的菌株VP-3抑菌谱较宽，对藤仓赤霉菌、尖孢镰刀菌、单丝壳白粉病菌和小麦根腐病菌均具有较强的抑制效果。
3、菌株鉴定
采用分子生物学的方法对筛选得到的菌株VP-3进行鉴定，测得其16srDNA序列，在GenBank核酸数据库中进行Blast比对，通过比对确认其为多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa），命名为多粘类芽孢杆菌VP-3（PaenibacilluspolymyxaVP-3），并于2016年3月23日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016138。
实施例2多粘类芽孢杆菌VP-3对水稻恶苗病的防治效果
供试品种为武运粳24号，2013年济宁滨湖稻区滕州市重病田间收集的种子。将多粘类芽孢杆菌VP-3接种于营养肉汤液体培养基中，200rpm，30℃摇床培养48h，发酵液浓度达到109cfu/mL左右。将发酵液分别稀释10倍、100倍和1000倍，待用。
按质量比为1：1.5的比例将稻种分别加入到不同稀释倍数的发酵液中，20℃浸种处理72h，同时以清水浸种作为对照处理（CK）。
1、浸种处理结束后，从各处理组中随机抽取100粒种子统计发芽种子数，计算发芽率。每个处理组重复3次。
2、将浸后的种子保温催芽，炼芽后播种。从各处理组中随机取100粒种子，单独播种于育秧盘中，每个处理组重复3次。分别在4叶期和7叶期调查每个育秧盘中的病株率和防治效率，结果如表1所示。
防治效率的计算公式＝[1-(处理的病株率/对照的病株率)]×100%。
表1多粘类芽孢杆菌VP-3对水稻恶苗病的防治效果
从表1的数据可以看出，本发明筛选到的多粘类芽孢杆菌VP-3能显著提高水稻的发芽率，并且对水稻恶苗病有显著的防治效果，100倍发酵稀释液对水稻恶苗病的防治效率可达到80%以上，取得了意料不到的效果。
实施例3多粘类芽孢杆菌VP-3对草莓白粉病的防治效果
1、菌液制备
将多粘类芽孢杆菌VP-3接种于营养肉汤液体培养基中，200rpm，30℃摇床培养48h，发酵液浓度达到109cfu/mL左右。
2、使用方法
1）实验组：三个处理组，每个处理组10垄草莓，共1200棵，每个处理组之间设立保护行；
在草莓开花初期，将多粘类芽孢杆菌VP-3加水稀释200、400、800倍后，分别均匀喷洒在草莓叶片反正面及瓜茎上；每次喷洒间隔7天，连用三次；最后一次喷洒完菌液10天后，检查草莓白粉病的发病情况。
2）对照组：使用不含菌的营养肉汤培养基，其他操作与实验组均相同。
3、结果分析
病害分级标准：0级无病斑；1级：病斑面积占叶面积的1/4以下；2级：病斑面积占叶面积的1/4-2/4；3：病斑面积占叶面积的2/4-3/4；4级：病斑面积占叶面积的3/4以上。
病情指数＝[∑(病级值×该级发病叶数)/(调查总叶数×最高病级值)]×100%
防治效率的计算公式＝[1-(处理的病情指数/对照的病情指数)]×100%。
以SPSS统计软件对实验数据进行分析，结果如表2所示：
表2多粘类芽孢杆菌VP-3对草莓白粉病的防治效果
从表2的数据可以看出，本发明筛选到的多粘类芽孢杆菌VP-3能有效防治草莓白粉病，当菌液稀释至800倍时，该菌株对草莓白粉病的防治效率仍能高于92%，效果非常显著。
进一步地，申请人通过大量实验发现，除了水稻恶苗病和草莓白粉病之外，本发明筛选到的多粘类芽孢杆菌VP-3对由镰刀菌和根腐病菌引起的植物枯萎病和根腐病也具有明显的拮抗作用，防治效率高于90%，可广泛应用于防治植物病害，前景广阔。

Claims (7)

1.一种多粘类芽孢杆菌，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌的保藏编号为CCTCCNO：M2016138。
2.权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌在植物病害防治中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的植物病害为赤霉病、白粉病、枯萎病和根腐病中的任意一种。
4.一种微生物制剂，其特征在于，所述的微生物制剂包含权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌。
5.权利要求4所述的微生物制剂在植物病害防治中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，具体方法为将微生物制剂稀释200-800倍，喷洒于植物叶片、茎或根部。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，具体方法为将微生物制剂稀释400倍，喷洒于植物叶片、茎或根部。
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