CN114717154A - 多粘类芽孢杆菌yf在防治植物枯萎病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物病害生物防治技术领域、微生物资源的开发与利用领域，具体提供了多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液的新用途，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517，实验结果显示，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液能够降解镰刀菌酸或者抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)合成镰刀菌酸，抑制率为78.90％，可以在防治植物枯萎病中应用，为有效控制植物枯萎病提供了一种安全、高效、经济、应用性强、环境友好型的方法。

Description

多粘类芽孢杆菌YF在防治植物枯萎病中的应用
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域、微生物资源的开发与利用领域，特别涉及多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在防治植物枯萎病中的应用。
背景技术
镰刀菌酸(Fusaric acid,FSA)属镰刀菌萎蔫毒素，化学名称为5-丁基吡啶-2-羧酸，是由镰刀菌属产生的一种非寄主转化性的致病毒素，可增强镰刀菌所产伏马菌素及单端孢稀霉毒素的毒性，抑制植物防御酶系统的活性、降低细胞生命力，是引起植物枯萎症状的主要物质，能引起谷物和其它许多农作物发病、萎蔫、死亡。目前，真菌毒素被降解为无毒物质已经成为了生物学研究的热点，且关于微生物降解镰刀菌酸有少量相关报道，例如洋葱伯克霍尔德氏菌、解淀粉芽孢杆菌等菌株被验证可有效降解镰刀菌酸。但目前还没有多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)降解FSA及抑制FSA生物合成的研究报道。
植物枯萎病是由镰刀菌属病原菌所引起，镰刀菌侵入植物体内，可以分泌毒素镰刀菌酸，对寄主植物产生毒害，使后者枯萎，直至死亡。常规的抗枯萎病材料筛选的方法是田间自然筛选或苗期人工接种筛选。植物枯萎病的防治目前还是以化学防治为主，但随着环保理念及病虫害抗性意识的加强，化学农药的使用也越来越小心与谨慎。生物防治由于其具环保、多作用位点、对天敌安全等优点成为病虫害综合防治中最有潜力的防治措施，也成为全球的研究热点之一。
发明人在研究了过程中意外的发现，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液能够降解镰刀菌酸或者抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)合成镰刀菌酸，为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF提供了一种新用途，为有效控制植物枯萎病提供了一种安全、高效、经济、应用性强、环境友好型的方法。
发明内容
本发明的首要目的是提供多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液在防治植物枯萎病中的应用，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话为：010-64807355。
优选的，所述的植物枯萎病的病原体为镰刀菌。
优选的，所述的镰刀菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。
本发明的第二目的是提供了多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液在降解镰刀菌酸中的应用，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话为：010-64807355。
本发明的第三目的是提供多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液在抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)合成镰刀菌酸中的应用，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话为：010-64807355。
优选的，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF发酵液的发酵培养方法为：将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF接种到已灭菌的富集培养基中，摇床震荡培养，使用无菌水稀释到1×108CFU/mL，所述的培养条件为：温度为30-37℃，转速为150-180rpm，培养时间为36-48h。
优选的，所述的富集培养基的配方为葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，硫酸镁5g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙1g/L，pH为6.5～7.5
本发明的有益效果是：本发明提供了多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液的新用途，实验结果显示，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液能够降解镰刀菌酸或者抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)合成镰刀菌酸，抑制率为78.90％，可以在防治植物枯萎病中应用，为有效控制植物枯萎病提供了一种安全、高效、经济、应用性强、环境友好型的方法。
附图说明
图1为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF基于16s rDNA序列的系统发育树和菌落照片。
A:菌落照片；B：16s rDNA序列的系统发育树
图2为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在以50μg/mL镰刀菌酸为唯一碳源的M9培养平板照片。
图3为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF对尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)中镰刀菌酸生物合成的抑制效果。
A:镰刀菌酸的标准曲线；B：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF对镰刀菌酸合成抑制效果；C：镰刀菌酸标准品的HPLC色谱图；D：镰刀菌酸粗毒素HPLC色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中所述的LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L。
以下实施例中所述的无机盐M9培养基的配方为：Na2PO4·7H2O 2.56g/L,KH2PO40.6g/L,Nacl 0.1g/L,NH4cl 0.2g,MgSO4·7H2O 0.49g/L,Cacl2·6H2O 0.02191g/L。
实施例1、菌株的分离、纯化和鉴定
2019年9月20日从甘肃省定西市临洮县玉井镇养殖户羊粪堆肥采集样品，采用稀释涂布法对微生物分离纯化，称取样品10g加入装有90mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，所得样品悬液稀释成10﹣1、10﹣2、10﹣3、10﹣4、10﹣5等不同稀释浓度，分别涂布在LB固体培养基上，每个稀释度重复次3次，于30℃培养箱倒置培养，挑取其中的单菌落进行平板划线纯化，得到纯菌株，在LB培养基上为圆形，突起，乳白色，粘稠状，不透明，表面湿润光滑边缘不整齐，具有很强的粘性，将其命名为YF。筛选拮抗效果好的菌株进行16s rDNA分子生物学鉴定，确定菌株为多粘类芽孢杆菌，其分类命名为Paenibacillus polymyxa，基于16s rDNA序列的系统发育树和菌落照片如图1所示，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF的16srDNA序列如SEQ ID No.1所示。
将筛选得到的菌株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21517，联系电话为：010-64807355。
以下实施例中，将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF，简写为多粘类芽孢杆菌YF。
实施例2、多粘类芽孢杆菌YF降解毒素镰刀菌酸能力测定
将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF划线接种到以50μg/mL镰刀菌酸为唯一碳源的M9培养平板上培养，培养温度培养条件为：28℃，培养时间为2天。2天后观察平板长出多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF的单菌落。
实验结果如图2所示，以50μg/mL镰刀菌酸为唯一碳源的M9培养平板上长出白色菌落，菌落形态与多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF相同。因此，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF可以以镰刀菌酸为唯一碳源生长，具有降解镰刀菌酸的能力。
实施例3、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF抑制毒素镰刀菌酸合成效果测定
将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF接种到已灭菌的富集培养基中，摇床震荡培养，使用无菌水稀释到1×108CFU/mL，所述的培养条件为：温度为30-37℃，转速为150-180rpm，培养时间为36-48h；将其以10％(v/v)的接种量接种到100mL镰刀菌酸的产生菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)发酵液中共培养，培养条件为：温度为28℃，转速为150-180rpm，培养时间为15天；15天后将发酵产物用乙酸乙酯萃取，旋蒸并溶于甲醇，获得镰刀菌酸粗毒素；使用高效液相色谱(HPLC)测定镰刀菌酸粗毒素，分析抑制效果。HPLC检测镰刀菌酸的具体检测条件为：安捷伦C18柱的尺寸为250mm×4.6mm，5μm，流动相为乙腈/水(v/v)为55:45，流速为1mL/min，进样体积为10μL，激发波长为270nm。
实验结果表明，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)发酵15天后发酵产物的镰刀菌酸含量为2.45±7.95mg，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF处理后，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)发酵产物中的镰刀菌酸含量为0.52±7.28mg。因此，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)Y对毒素镰刀菌酸的生物合成具有较好的抑制作用，抑制率为78.90％(如图3所示)。
综上所述，本发明提供了多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液的新用途，实验结果显示，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液能够降解镰刀菌酸或者抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)合成镰刀菌酸，抑制率为78.90％，可以在防治植物枯萎病中应用，为有效控制植物枯萎病提供了一种安全、高效、经济、应用性强、环境友好型的方法。
序列表
<110> 兰州交通大学
<120> 多粘类芽孢杆菌YF在防治植物枯萎病中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)
<400> 1
tgcagtcgag cggggttgat agaagcttgc ttctattaac ctagcggcgg acgggtgagt 60
aacacgtagg caacctgccc acaagacagg gataactacc ggaaacggta gctaataccc 120
gatacatcct attcctgcat gggagaagga ggaaagacgg agcaatctgt cacttgtgga 180
tgggcctgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaaaggcc taccaaggcg acgatgcgta 240
gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt agggaatctt ccgcaatggg cgaaagcctg acggagcaac gccgcgtgag 360
tgatgaaggt attcggatcg taaagctctg ttgccaggga agaacgtctt gtagagtaac 420
tgctacaaga gtgacggtac ctgagaagaa agcctcggct aactacgtgc cagcagccgc 480
ggtaatacgt agggggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 540
ctctttaagt ctggtgttta atcccgaggc tcaacttcgg gtcgcactgg aaactgggga 600
gcttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatgt 660
ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tgggctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag 720
cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgaatgctag 780
gtgttagggg tttcgatacc cttggtgccg aagttaacac attaagcatt ccgcctgggg 840
agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcagtggagt 900
atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc cctctgaccg 960
gtctagagat agacctttcc ttcgggacag aggagacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgagtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat gcttagttgc 1080
cagctagtca agctgggcac tctaagcaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1140
atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtactac aatggccggt 1200
acaacgggaa gcgaaatcgc gaggtggagc caatcctaga aaagccggtc tcagttcgga 1260
ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc ggaattgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320
cgcggtgaat acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttacaa 1380
cacccgaagt cggtgggtaa cccgcaagga gccagccggt gggtaaag 1428

Claims (7)

1.多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液在防治植物枯萎病中的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话为：010-64807355。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植物枯萎病的病原体为镰刀菌。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的镰刀菌为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)。
4.多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液在抑制尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)合成镰刀菌酸中的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话为：010-64807355。
5.多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF或其发酵液在降解镰刀菌酸中的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话为：010-64807355。
6.如权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YF发酵液的发酵培养方法为：将多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)YF接种到已灭菌的富集培养基中，摇床震荡培养，使用无菌水稀释到1×108CFU/mL，所述的培养条件为：温度为30-37℃，转速为150-180rpm，培养时间为36-48h。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的富集培养基的配方为葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，硫酸镁5g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙1g/L，pH为6.5～7.5。
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