CN115873750A

CN115873750A - 一株防治西瓜枯萎病的普城沙雷氏菌、菌剂及应用

Info

Publication number: CN115873750A
Application number: CN202211075255.5A
Authority: CN
Inventors: 李昭煜; 马金秀; 李佳佳; 田永强; 沈彤
Original assignee: Lanzhou Jiaotong University
Current assignee: Lanzhou Jiaotong University
Priority date: 2022-09-04
Filing date: 2022-09-04
Publication date: 2023-03-31

Abstract

本发明公开了一株普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)MM、菌剂及其在西瓜枯萎病生物防治中的应用，该菌株于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24997。该菌株对引起西瓜枯萎病的尖孢镰刀菌西瓜专化型具有较好的拮抗作用，可有效防治西瓜枯萎病，同时该菌株还有促进西瓜种子萌发和植株生长的作用。利用该菌株开发西瓜抗病促生微生物菌剂具有较好的应用前景。

Description

一株防治西瓜枯萎病的普城沙雷氏菌、菌剂及应用

技术领域

本发明涉及植物病害生物防治技术和微生物菌剂制备领域，具体地说，涉及一株防治西瓜枯萎病的普城沙雷氏菌、菌剂及应用。

背景技术

西瓜是全球最受欢迎的水果之一，在我国各个地方均被广泛种植。由尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum，FON)引起的西瓜枯萎病是一种破坏性强的土传病害，病菌可以轻易在土壤中滋生繁衍，极难防控，且感染率较高，有时甚至可以导致作物绝收。目前尚无理想的防治方法，嫁接防治会影响西瓜的口感及品质，抗病品种培育周期长，且易丧失抗病性，化学农药长期使用，农药残留及抗药性问题突出，严重影响食品安全。而生物防治相对安全有效，符合可持续性绿色农业发展要求，因此利用微生物制剂防治西瓜枯萎病具有重要的实践意义。

普城沙雷氏菌，可产生多种细胞壁降解酶、硝吡咯菌素、植物生长素和多种活性因子，因此在农业病虫害防治和农作物促生长方面具有广阔的应用前景。利用普城沙雷氏菌用于防治西瓜枯萎病为首次报道，因此，普城沙雷氏菌作为西瓜枯萎病防治和促进西瓜种子萌发和植株生长的微生物菌剂，能够解决农药残留及抗药性问题，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一株对西瓜枯萎病具有较好抑制效果的普城沙雷氏菌MM，本发明所述的普城沙雷氏菌MM能够有效防治植物病害和促进植物生长，解决西瓜枯萎病抗药性强，防治难等问题，为西瓜枯萎病的防治提供新的微生物资源。

本发明对MM通过培养观察期菌落和菌体形态，进行生理生化试验，及16SrDNA分子生物学鉴定，确定其为普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)，现已于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号CGMCC No.24997。

本发明还提供了一种包含上述普城沙雷氏菌MM的微生物菌剂。

优选的，菌剂中普城沙雷氏菌MM的浓度为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL。

本发明提供了普城沙雷氏菌MM在防治西瓜枯萎病中的应用。

优选的，普城沙雷氏菌MM能够抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型的菌丝生长，有效防治西瓜枯萎病的发生。

本发明提供了普城沙雷氏菌MM菌剂在促进西瓜种子萌发和植株生长中的应用。

优选的，普城沙雷氏菌MM菌剂能够提高西瓜种子的发芽率，能够促进西瓜植株生长。

本发明提供了普城沙雷氏菌MM微生物菌剂的制备方法：普城沙雷氏菌MM接种于液体培养基中培养，培养16h至OD₆₀₀值为1.6时即为种子液，将得到的种子液接种于发酵培养基中(1000mL蒸馏水，葡萄糖12.7g、牛肉膏2.1g，酵母粉3.1g)扩大培养，发酵培养条件为30℃，PH7，180r/min，接种量3％，发酵时间36h，获得微生物菌剂。

本发明提供了普城沙雷氏菌MM微生物菌剂的使用方法：西瓜移栽缓苗或直播出苗后，将所述菌剂稀释100倍后，人工或利用滴灌灌根，连续使用2次，每次间隔30天，防治西瓜枯萎病的发生；将所述菌剂稀释150倍拌种促进西瓜种子萌发，稀释200倍间隔14d灌根2次，促进植株生长。

与现有技术相比，本发明一株防治西瓜枯萎病的普城沙雷氏菌、菌剂及应用，具有如下优势：

1、本发明的普城沙雷氏菌及其菌剂均对西瓜枯萎病具有强烈的抑制作用，具有优异的防治西瓜枯萎病的生防作用，同时能够提高西瓜种子的发芽率、促进西瓜植株的生长。

2、该菌的繁殖速度快，抗逆能力强，不会对环境产生污染，生产条件和成本要求低，是一种理想的微生物杀菌剂，具有较好的市场开发应用前景。

附图说明

图1为普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)MM对引起西瓜枯萎病的尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum，FON)抑制作用效果图，a为抑制图，b为对照。

图2为普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)MM在LB培养基上的单菌落图，a为单菌落，b为革兰氏染色。

图3是普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)MM16S rDNA基因序列系统发育树图。

图4为普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)MM菌剂不同浓度对西瓜种子的促生作用图。

图5为普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)MM菌剂对西瓜枯萎病的室内盆栽防治效果图，A为菌剂稀释100倍，B为CK,C为菌剂稀释300倍,D为菌剂稀释200倍。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。

实施例1：生防菌株的分离与筛选

2019年9月从青海省南部高寒高海拔北纬32°39'东经101°23'三江源地区采集的约5-20cm深度的新鲜土壤数10g。采用稀释涂布法分离土壤拮抗细菌，挑取形态有差异的菌落划线纯培养，以引起西瓜枯萎病的尖孢镰刀菌为指示菌，采用平板对峙法进行筛选，27℃培养，通过筛选，发现MM菌株对尖孢镰刀菌具有较好的抑制作用，抑制率为65.46％(表1、图1)。

表1菌株MM对尖孢镰刀菌的拮抗作用

实施例2：生防菌株MM的形态学和分子生物学鉴定

形态学鉴定：观察生防菌株的形态特征并进行革兰氏染色和芽孢染色镜检。在LB培养基上28℃培养3d后，生防菌株MM单菌落菌体边缘齐整，表面凸起光滑，奶白色，短杆状，G-(见图2)。

分子生物学鉴定：生防菌株于LB培养基上活化培养24h后，直接挑取单菌落采用16S rDNA基因序列进行PCR鉴定(见图3)。

综合形态特征、16S rDNA基因序列分析，最终将生防菌株MM鉴定为普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)。菌株MM现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.24997。

实施例3：普城沙雷氏菌MM菌剂促进西瓜种子萌发

普城沙雷氏菌MM菌剂制备：普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)MM接种于液体培养基中培养，培养16h至OD600值为1.6时即为种子液，将得到的种子液接种于发酵培养基中(1000mL蒸馏水，葡萄糖12.7g、牛肉膏2.1g，酵母粉3.1g)扩大培养，发酵培养条件为30℃，PH7，180r/min，接种量3％，发酵时间36h，得到浓度为1×10⁸～1×10¹⁰CFU/mL的菌剂。

选取颗粒饱满的西瓜种子，洗净消毒，置于无菌纱布中风干备用。将MM无菌滤液分别稀释至10、50、100、150和200倍的梯度加入MS培养基中，以加无菌水的MS培养基为对照，将备用种子置于MS培养基中，每瓶5粒，每个处理重复3次，25℃，相对湿度80％左右，光照与黑暗交替培养7d后，记录西瓜种子生长情况。

普城沙雷氏菌MM无菌滤液稀释倍数为100、150、200倍时，对西瓜种子的萌发有显著的促进作用，发芽率分别为95.90％、98.53％、96.13％。在150倍时发芽率、株高、根长、鲜重、干重较对照差异最显著，且分别较对照增加了11.33％、63.38％、35.55％、87.80％、125.00％，表明菌株MM无菌滤液稀释150倍时对西瓜种子的萌发促进作用最强(表2，图4)。

表2普城沙雷氏菌MM菌剂对西瓜种子萌发的影响

小写字母为差异显著性分析。

实施例4：普城沙雷氏菌MM菌剂的室内防治及促生效果试验

普城沙雷氏菌MM菌剂制备同实施例3。盆栽防效试验：设菌剂稀释100倍、200倍、300倍和CK三个处理，将长势均匀的西瓜幼苗移栽至花盆中，每个处理5盆，处理组每个花盆分别先灌入稀释100倍、200倍、300倍的20ml普城沙雷氏菌MM菌剂，对照组CK灌入等量清水，然后分别接种尖孢镰刀菌(FON)孢子悬液(10⁷孢子/mL)5ml，14d时，处理组再分别先灌入稀释100倍、200倍、300倍的20ml普城沙雷氏菌MM菌剂，对照组CK灌入等量清水，末次26d时，调查统计枯萎病的病情指数，计算菌剂MM的防治效果。

盆栽促生长试验：方法同盆栽防效试验，不接种病原菌尖孢镰刀菌(FON)孢子悬液，末次26d时统计植株的株高。

西瓜枯萎病分级标准：0级为茎内维管束正常，外部无症状；1级为茎内维管束25％以下变色；3级为茎内维管束25％-50％变色；5级为茎内维管束51％-75％变色；7级为茎内维管束75％以上变色，部分叶片萎蔫；9级为整株枯死。

病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100

相对防效(％)＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100

盆栽试验结果表明：普城沙雷氏菌MM菌剂100倍稀释液对西瓜枯萎病的防治效果最好，为76.33％，200倍对西瓜植株的促生作用最好，因此，100倍为该菌剂的最佳防治西瓜枯萎病的稀释倍数，200倍为促进西瓜植株生长的最佳稀释倍数(表3、图5)。

表3普城沙雷氏菌MM菌剂的促生效果及室内防效

小写字母为差异显著性分析。

实施例5：生防菌株F3A的田间防治效果试验

根据上述室内盆栽试验结果较好的稀释浓度进行田间试验，田间试验在甘肃省嘉峪关市野麻湾村进行，普城沙雷氏菌MM菌剂制备同上。设普城沙雷氏菌MM菌剂100倍、30％噁霉灵水剂1000倍、清水对照三个处理，每个处理3次重复，西瓜出苗15天后，菌剂100倍、30％噁霉灵水剂1000倍、清水滴灌一次，30d后，各处理按以上浓度再滴灌一次，末次灌根30天后，每个处理的每个重复随机取20株，统计病情指数，计算防效，分级标准和计算方法同实施例4(表4)。

田间防治效果试验表明：普城沙雷氏菌MM菌剂100倍防效71.10％，与常规使用药剂30％噁霉灵水剂防效75.59％相差不大，均能有效防治西瓜枯萎病的发生，在生产上有较好的推广利用价值。

表4普城沙雷氏菌MM菌剂对西瓜枯萎病的田间防治效果

小写字母为差异显著性分析。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，其他的任何未背离本发明的改变、修饰、替代、组合、简化，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）MM在抑制尖孢镰刀菌生长和促进西瓜种子萌发和植株生长中的应用，其特征在于，所述的普城沙雷氏菌MM于2022年06月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24997，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，联系电话为：010-64807355。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的尖孢镰刀菌为引起西瓜枯萎病的尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp.niveum，FON）。

3.权利要求1所述的普城沙雷氏菌MM在防治尖孢镰刀菌西瓜专化型引起的西瓜枯萎病病害中的应用。

4.权利要求1所述的普城沙雷氏菌MM在促进西瓜种子萌发和植株生长中的应用。

5.一种防治西瓜枯萎病和促进西瓜种子萌发和植株生长的微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂含有1所述普城沙雷氏菌MM。

6.如权利要求5所述的微生物菌剂，其特征在于，发酵液中普城沙雷氏菌MM的浓度为1×10⁸~1×10¹⁰CFU/mL。

7.以上5所述微生物菌剂的制备方法：普城沙雷氏菌MM接种于液体培养基中培养，培养16h至OD600值为1.6时即为种子液，将得到的种子液接种于发酵培养基中（1000mL蒸馏水，葡萄糖12.7g、牛肉膏2.1g，酵母粉3.1g）扩大培养，发酵培养条件为30℃，PH7，180 r/min，接种量3%，发酵时间36h，获得5所述微生物菌剂。

8.权利要求5所述的普城沙雷氏菌MM菌剂防治3所述西瓜枯萎病的方法：西瓜移栽缓苗或直播出苗后，将所述菌剂稀释100倍，人工或利用滴灌灌根，连续使用2次，每次间隔30天。

9.权利要求5所述的普城沙雷氏菌MM菌剂促进西瓜种子萌发和植株生长的方法：将所述菌剂稀释150倍拌种，或稀释200倍间隔14d灌根2次。