KR20030070755A

KR20030070755A - 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카

Info

Publication number: KR20030070755A
Application number: KR1020020010279A
Authority: KR
Inventors: 김진호; 주길재
Original assignee: 김진호
Priority date: 2002-02-26
Filing date: 2002-02-26
Publication date: 2003-09-02
Also published as: KR100430961B1

Abstract

본 발명에 의한 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카는 대파 뿌리로부터 근권미생물을 분리하여 대파 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum)에 길항하는 쎄라티아 플리무티카 AL-1 균주를 최종 선별하였다.

분리주 AL-1은 플로카리오테스(procaryotes)와 버지스 매뉴얼(Bergey's mannual of systematic bacteriology)의 방법, 세포법 지방산 분석(Microbial ID Inc. Sherlock system)의 방법, 16S rDNA의 부분염기서열(767bp) 결정하여 리보솜 데이터베이스(ribosomal database)에서 상동성 검색 등의 방법으로 쎄라티아 플리무티카(Serratia plymuthica)로 동정되었다.

쎄라티아 플리무티카(S. plymuthica) AL-1은 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum)에 대해서는 생육저지환의 크기가 15㎜로 나타났으며, 고추 검은무늬병(Alternaria altrata)은 9㎜, 고추 탄저병균(Colletotrichum gleosporioids)은 13㎜, 도라지 줄기마름병균(Phoma sp.)은 10㎜, 고추 잘록병균(Rhizoctonia solani)은 8㎜, 고추 흰별무의병균(Stemprhlium solani)은 8㎜, 오이 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum)은 7㎜, 수박 덩굴쪼김병(Fusarium oxysporium niveum)은 7㎜로 길항력을 나타내었으나, 참외 만고병균(Didymella bryoniae)에서는 길항력이 없었다.

쎄라티아 플리무티카(S. plymuthica) AL-1은 1% 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 첨가한 TSB 배지에서 분자량 10,000 이상의 분획에서는키티나제(chitinase(3.2 units/㎖))가 유도 생산되었고, 80℃에서 30분간 열처리할 경우, 키티나제(chitinase)의 활성은 없어 졌으나 길항력(6.4㎜)은 남아있었다.

또한 분자량 10,000 이하의 분획에서는 키티나제(chitinase) 활성은 없으나 길항력(5.2㎜)은 나타내었고, 80℃에서 열처리하여도 길항력(5.0㎜)이 남아있어 효소외 다른 생리활성물질이 존재함을 확인하였다.

Description

대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카{SERRATIA PLYMUTHICA ANTAGONISTIC TO WHITE ROT FUNGI SCLEROTIUM CEPIVORUM}

본 발명은 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대파 뿌리로부터 근권미생물을 분리하여 대파 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum)에 길항하는 쎄라티아 플리무티카 AL-1 균주(Serratia plymuthica AL-1 : 기탁번호 KCTC 10187BP)를 이용함으로써 대파의 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum) 및 각종 병원성 진균에 의한 병해를 미생물학적으로 용이하게 예방할 수 있도록 하는 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카에 관한 것이다.

식물 뿌리는 타감물질(allelochemics) 및 근권미생물의 먹이가 되는 여러 가지 유기물질들을 배출하며, 뿌리로부터 분비되는 물질의 종류와 양은 식물의 종류, 년령, 온도, 광, 식물의 영양상태, 미생물 및 토양습도 등에 의해 크게 좌우된다.

이러한 물질들은 주로 뿌리의 선단부 근관에서 만드는 점액초(mucigel sheath)의 가용물과 근모에서 배출되는 액체방울, 그리고 세포에서 나오는 가용성 분비물, 세포벽의 노화로 인하여 생성되는 박리편, 미생물에 의해 피층 세포로부터 분리된 물질 등에 존재하는 것이다.

파속(Allium sp.)의 식물들도 타감물질이나 다양한 유기물질들을 분비하며, 대표적으로 바닐린산(vanillic acid)와 수용성 알킬 시스테인 술포사이드(alkyl cysteine sulphoxides) 등이 있으며, 특히 바닐린산(vanillic acid)은 리그닌(lignin) 분해 중간대사산물로서 호밀, 귀리, 사탕수수, 옥수수와 브라키아리아 무티카(Brachiaria mutica)의 뿌리 및 경엽의 잔사나 담배, 고구마, 파인애플및 바나나 재배 토양에서 타감작용을 유도하는 물질로서 많이 관찰되며, 연작한 국화의 생육을 억제시킨 것으로 확인되었다.

기주의 분비물이 기생균의 내구체를 특이하게 발아 유기 시키는 예로서 파속(Allium sp.)과 파 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum)의 균핵과의 사이에서 나타난다.

파속식물의 수용성 알킬 시스테인 술포사이드(alkyl cysteine sulphoxides)는 흙 속에 확산되어 토양 미생물에 의해 휘발성 알킬 술파이드(alkyl sulphides)로 변환되며, 이것이 파 흑색썩음균핵병균(S. cepivorum)의 균핵에 강한 발아유도 작용을 함으로써 파속식물의 근부 환경에 우점하게 되어 흑색썩음균핵병(white rot)을 유발시킨다.

식물 토양병해의 경종적 방제기술로는 파와 박을 혼식함으로써 병해를 방제하는 경우와 파·부추 혼식에 의한 토마토 시들음병을 방제하는 경우처럼 파·부추에 정착하는 근권 미생물은 토마토의 뿌리에는 정착하지 못하지만 파와 토마토 혼식에 의해 파의 뿌리에 존재하는 미생물을 토마토의 근권에 서식할 수 있도록 함으로써 병이 방제되는 경우가 있다.

이처럼 대상식물 근권에 길항미생물을 정착시키려면 외래 유용미생물을 묘상이나 작물의 심는 부위에 집중적으로 투입하는 것도 중요하지만, 투입되는 외래 유용미생물이 대상 작물이 생산하는 타감물질이나 유기물질에 의해 대부분 사멸되거나 생육에 어려움을 겪게되므로 올바른 미생물의 효과를 볼 수가 없게 된다.

그러므로 대상작물의 근권에 토착화되어 있거나 우점화되어 서식하는 근권길항미생물을 직접 분리하고, 이들 근권미생물을 다시 재 투입하면 대상식물에 친화성을 가지고 있기 때문에 미생물학적 병해방제 적용에 더욱 유리할 것이다.

본 발명은 대파 뿌리로부터 근권미생물 146종을 분리하여 대파 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum)에 길항하는 쎄라티아 플리무티카 AL-1 균주를 이용함으로써 대파의 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum) 및 각종 병원성 진균에 의한 병해를 미생물학적으로 용이하게 예방할 수 있는 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카를 제공하는 데 있다.

도 1a,1b은 본 발명에 의한 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 미생물을 선별하기 위한 도면 대용 사진,

도 2는 본 발명에 의한 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카를 주사 현미경(15,000배 확대)으로 확대한 도면 대용 사진,

도 3은 버지스 매뉴얼의 방법에 의한 본 발명의 균주의 동정 결과표,

도 4는 세포법 지방산 분석법의 방법에 의한 본 발명의 균주의 동정 결과표,

도 5는 16S rDNA의 부분염기서열(767bp) 결정의 방법에 의한 본 발명의 균주의 동정 염기서열,

도 6은 병원성 곰팡이에 대한 본 발명의 균주의 길항력을 조사한 도표,

도 7은 본 발명에 의한 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카의 길항물질 생성능력을 나타내는 도표,

도 8a,8b은 본 발명에 의한 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카의 대파 뿌리에 서식하는 길항균을 나타내는 도면 대용 사진이다.

이하 본 발명에 의한 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카의 바람직한 실시예를 더욱 상세하게 설명하며, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 대상작물의 근권에 토착화되어 있거나 우점화되어 서식하는 근권 길항미생물을 직접 분리하고, 이들 근권미생물을 다시 재 투입하면 대상식물에 친화성을 가지게 된다.

따라서 본 발명은 파속 작물의 뿌리에서 주로 발생되는 흑색썩음균핵병을 미생물학적으로 방제하기 위한 실험의 일환으로 먼저 대파(Allium fistulosum)의 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum)에 길항하는 항진균성 길항미생물을 대파의 뿌리에서 분리하여 동정하고, 키티나제(chitinase) 및 생리활성물질 생산능을 조사하였다.

우선 본 발명에 사용되는 병원성 곰팡이는 농촌진흥청에서 분양 받은 대파의 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum)이다.

상기 병원균은 5℃∼20℃에서만 생육하는 저온 병원성 곰팡이이므로 PDA(potato dextrose agar) 배지에 20℃ 이하에서 배양하여 균핵을 형성시킨 후, 이를 수집하여 4℃에 보관한다.

그 외 각종 병원성 진균으로 고추 검은무늬병균(Alternaria altrata), 고추 탄저병균(Colletotrichum gleosporioids), 도라지 줄기마름병균(Phoma sp.), 고추 잘록병균(Rhizoctonia solani), 고추 흰별무의병균(Stemprhlium solani), 오이 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum), 수박 덩굴쪼김병(Fusarium oxysporium niveum), 참외 만고병균(Didymella bryoniae) 등을 사용하였으며, 이들 병원성 곰팡이들은 농촌진흥청과 KCTC(유전자은행) 등에서 분양받아 PDA 배지에 28℃에서 배양하여 4℃에 보관하게 된다.

대파 뿌리에 서식하는 근권미생물을 분리하기 위해, 대구 인근 칠곡, 영천, 고령, 성주 등지에서 대파 뿌리 시료를 채취하여 살균 증류수로 수회 세척하고, 작게 조각낸 다음, 살균된 0.85% NaCl 용액에 넣고 균질기(homogenazer)로 2분간 마쇄하여 원심분리한 후, 그 상등액을 균원시료로 사용하였다.

상기 균원시료 1㎖를 0.85% NaCl 용액으로 3단 희석한 뒤, 세균은 NA(nutrient agar) 및 TSA(tryptic soy agar) 배지, 방선균은 YMA(yeast extract-malt extract agar)배지에 0.4% 프로피온나트륨(sodium propionate)와 25㎎/ℓ 날리시딕산(nalicidic acid)을 첨가하여 사용하였고, 곰팡이는 PDA 배지를 사용하여각각의 배지에 상기 균원시료 용액을 100㎕씩 도말하고, 세균은 20℃로 3일간, 방선균은 30℃에 5일간, 곰팡이는 28℃에서 7일간 인큐베이터(incubator)에서 배양하여 각각의 콜로니(colony) 형태 및 색깔, 냄새 등으로 1차 분류하고, 광학현미경으로 형태학적 세균, 방선균, 곰팡이로 2차 분리하여 사용하였다.

키틴(Chitin) 분해력을 가진 균주를 확인하기 위해, 각각의 균들 선택 배지에 1%의 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 첨가하고, 이를 배양한 후, 키틴(chitin) 분해환 생성능을 확인하였다.

저온 병원성 진균인 흑색썩음균핵병균(S. cepivorum)에 길항하는 미생물의 선발은 분리균과 병원균을 대치배양(pairing plate culture)하여 생육억제환의 크기로 선발하였다.

PDA 배지에서 키운 병원균체 덩어리를 1% 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 첨가한 PDA 배지 중앙에 올려놓고, 가장자리 4곳에 순수분리한 미생물을 한 백금이씩 접종하여 20℃에서 7일∼10일간 배양한 후, 병원균의 균사체의 생장억제 정도(inhibition zone)를 조사하여 생성된 클리어존(clear zone)의 길이가 큰 분리균을 길항균으로 선별하였다.

길항미생물의 동정은 3가지 방법으로 행하게 된다.

먼저 플로카리오테스(procaryotes)와 버지스 매뉴얼(Bergey's mannual of systematic bacteriology)의 방법에 준하여 미생물의 형태학적, 배양학적, 생리·생화학적 특성을 조사하게 된다.

다음으로는 미생물의 세포법의 지방산의 조성을 자동으로 동정하는분석법(Microbial ID Inc. Sherlock system)(미생물동정장치, GC : HP Co., 6890 series)으로 동정하였다.

그 다음으로는 16S rDNA의 부분염기서열(767bp) 결정하여 리보솜 데이터베이스(ribosomal database)에서 상동성 검색 등의 방법인 16S rDNA sequence 법으로 동정하였으며, 이 때 PCR primer는 R14(5'-ACg ggC ggT gTg TAC-3')와 R15( 5'-gCC AgC AgC CgC ggT A-3')를 이용하였고, 시퀀스 테이타(sequencing data)는 ribosomal database에서 상동성을 검색하여 동정하였다.

콜로이달 키틴(Colloidal chitin)의 조제 및 키티나제(chitinase)의 활성 측정을 위해서는 크루드 키틴(Crude chitin)(Sigma Co., C-7170) 100g에 cold conc. HCl 2ℓ를 가하여 4℃에서 12시간 교반한 후, 95% cold ethanol 2ℓ를 가하여 생성된 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 6,000 x g에서 10분간 원심분리(Beckman Co., L8-55M)하여 회수하고, 증류수로 희석한 후, 5N NaOH로 pH를 중화시키고, 증류수로 수회 세척하여 회수된 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 건조하여 효소의 기질로 사용하였다.

키티나제(Chitinase) 활성측정은 인산완충액(0.05M Na₂HPO₄-KH₂PO₄buffer, pH 7.5)에 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 0.5%로 현탁시킨 기질용액 0.5㎖에 인산완충액 1㎖을 넣은 후, 효소액 0.2㎖를 첨가하여 45℃에서 1시간 30분 동안 반응시킨 후, DNS(dinitrosacylic acid)법으로 환원당량을 측정하였다.

효소활성 1 unit는 시간당 colloidal chitin으로부터 1μM의 N-아세틸글루토사민(acethylglucosamine)을 생성시키는 효소량으로 환산하였다.

길항균의 길항 방제기작을 조사하기 위하여, 1% colloidal chitin을 첨가하거나 또는 첨가하지 않은 TSB 배지에 종균을 접종하여 20℃에서 3일간 진탕배양하고 10,000 x g에서 30분간 원심분리하여 상등액을 회수한 후, YM10(Amicon Co.) 멤버레인(membrane)으로 분자량 10,000을 기준으로 여과한 후, 각각의 항균활성을 조사하였으며, 또한 배양 상등액을 80℃에서 30분간 열처리하여 잔존 길항력을 조사하였다.

본 발명에 의한 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카는 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국과학기술원 생명공학연구소 내 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10187BP로 기탁되었다.

첫째, 대파 뿌리에 서식하는 근권미생물의 분리

대파의 근권미생물은 대파 뿌리를 균원시료로 하여 각각 선택배지 등에서 배양시킨 후, colony의 형태, 색깔, 냄새 등이 서로 다른 양상의 colony를 확보하여 광학현미경으로 관찰하여 분리한 결과, 세균(AL) 98종, 방선균(GL) 33종, 곰팡이(DL) 15종 등 총 146종의 근권미생물을 분리하였다.

이들 146종의 분리 미생물을 1% colloidal chitin이 함유된 각각의 선택 고체배지에서 배양한 결과, 세균은 12종, 방선균은 2종이 chitin 분해환을 나타내었고, 분리주 No. AL-32, AL-1, GL-14 등이 clear zone을 나타내었다.

특히 분리 세균들은 20℃이하 저온에서 생육이 양호한 미생물이었으며, 특히 분리주 AL-32와 AL-1은 4℃에서도 생육이 가능하였고, 40℃에서는 자라지 않았다.

일반적으로 대파, 양파, 마늘 등 파속식물은 비교적 저온에서 생육하는 작물이므로 이들 작물에 병해의 미생물학적 방제를 위해서는 우선 저온에서 생육이 가능한 저온미생물이 유리할 것으로 판단하여 균분리부터 20℃ 저온에서 배양하여 자라는 균을 선별하였다.

둘째, 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 미생물의 선별

대파 근권미생물 146종을 이용하여 대파 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum)에 길항하는 미생물을 선별한 결과, 도 1에 도시한 바와 같이 길항미생물의 수가 지역별로 비슷한 양상을 나타내었으며, 세균은 총 51종이 길항력을 나타내었고, 이들 중에서는 AL-1 균주가 15㎜(clear zone size)로 길항력이 가장 우수하였고, AL-8(13㎜), AL-32(12㎜), AL-48(10㎜) 순으로 길항성을 나타내었으며, 방선균은 총 9종이 갈항력을 가지고 있었으며, 이들중 GL-1균주가 초기배양에서는 길항성을 나타내지 못하였으나, 4일 배양 후 10㎜로 높은 길항성을 나타내었고, GL-7(8㎜), GL-8(7㎜) 등의 순으로 길항력을 나타내었다.

곰팡이는 5종에서 길항력을 나타내었으나, DL-4(3㎜)가 그들 중에서 비교적 약간의 길항력을 가지고 있으나, 그 외의 곰팡이는 아주 적은 길항성을 나타내었다.

따라서 도 2에 도시한 바와 같이, 대파에서 분리한 세균, 방선균, 곰팡이 등의 근권미생물 중에서 대파 흑색썩음균핵병균(S. cepivorum)에 가장 높은 길항력을 지닌 분리 세균 No. AL-1 균주를 공시균주로 사용하였다.

셋째, 길항균 No. AL-1의 동정 및 특성

먼저 플로카리오테스(procaryotes)와 버지스 매뉴얼(Bergey's mannual of systematic bacteriology)의 방법에 준하여 미생물의 형태학적, 배양학적, 생리·생화학적 특성을 조사한 결과, 도 3에 도시한 바와 같이 그람(gram) 음성 간구균으로 통성 혐기성조건에서 증식되며, 주모성 편모를 가졌고 운동성이 있으며, 인돌(indole) 반응은 음성, 보게스프로스타우레 테스트(V-P) 반응은 양성, 구연산염(citrate) 이용성은 양성, KCN 배지에서의 발육은 부분적으로는 생육이 가능하였다.

또한 카탈라제 테스트(catalase test)는 양성, 젤라틴(gelatin)을 액화하였고, 디나제(DNase) 활성을 가지고 있으며, 말로네이트(Malonate)에서는 생육이 되지 않았다.

리신(Lysine) 탈탄산효소, 아르기닌(arginine) 가수분해 효소, 오르니신(ornithine) 탈탄산효소 등은 생산하지 않았으며, 글루코스(glucose) 배지에서 가스(gas)는 생성되지 않았고, 색소도 생성되지 않았으며, 10여종의 당이용성 등을 조사하여 총 정리한 결과, 길항균 AL-1은 쎄라티아(Serratia) 속으로 판정되었다.

쎄라티아(Serratia) 속이나 그 유연균 중 쎄라티아 마르세신(S. marcesens) 같은 세균은 뉴트리언드(nutrient) 배지나 맥콘키(MacConkey) 배지에서 붉은 색의 프로디지오신(prodigiosin) 색소를 생성하나 본 길항균 Al-1은 색소생성은 없었다.

특히 생화학적 조사에서 지금까지 알려진 쎄라티아(Serratia) 속의 미생물 중에서 쎄라티아 플리무티카(S. plymuthica)와 가장 근접한 결과를 나타내었다.

다른 방법에서는 미생물의 세포벽의 지방산의 조성으로 자동 동정하는 분석법(Microbial ID Inc. Sherlock system)(미생물동정장치, GC : HP Co., 6890 series)으로 동정한 결과, 도 4에 도시한 바와 같이 지방산의 조성은 14:0 type이 8.03%, 15:0가 4.85%, 16:0가 29.03%, 17:0 cyclo type이 16.88%, 18:1이 8.14%로 존재하는 것으로 나타났고, 유사도가 47.9%로 비교적 낮게 나타났으나, 쎄라티아 폰티콜라(Serratia fonticola)로 동정되었다.

또다른 방법에서는 길항미생물 AL-1의 16S rDNA의 부분염기서열을 결정한 결과, 도 5에 도시한 바와 같이 767bp의 염기서열이 결정되었고, 리보솜 테이타베이스(ribosomal database)에서 상동성을 검색한 결과, 쎄라티아 플리무티카(Serratia plymuthica(유사도 93.2%))로 동정되었다.

또한 PCR 증폭 16S rDNA의 767bp 염기서열 중에는 2곳의 제한효소 EcoR1 site와 1곳의 Xhol site를 가지고 있다.

따라서 상기 3가지 방법에서의 결과를 종합하여 분리주 AL-1은 쎄라티아 플리무티카(Serratia plymuthica)이거나, 그 유연균으로 동정되어 쎄라티아 플리무티카(Serratia plymuthica) AL-1으로 명명하였다.

쎄라티아(Serratia) 속의 대표적인 균종은 쎄라티아 마르세스켄스(Serratia marcescens)이며, 이들 외에도 S. liquefaciens, S. rubidaea, S. ficaria, S. adorifera, S. grimesii 등이 있으나, 이들은 폐렴, 폐화농증, 패혈증, 요로감염증, 수막염, 복막염, 창상 감염 등의 많은 감염증을 일으키는 것이 밝혀져 병원균으로 주목되고 있다.

쎄라티아 플리무티카는 밀, 귀리, 오이, 옥수수, 유지식물박, 토마토 등의 근권에서 분리되었며, 지금까지 사람에게 심각한 병을 일으키는 병원성 미생물로는 인식되지 않으나, 생선가공 공장의 오염 미생물로 또는 콘택트렌즈를 오염시키는 미생물로 보고되었다.

쎄라티아 플리무티카(S. plymuthica)는 농업에서 식물뿌리에 친화적인 미생물이므로 병원성 곰팡이의 생물학적 방제에 이용하려는 연구도 진행되고 있으며, 히스타민(histamine)을 생성, 수크로제 이소메라제(sucrose isomerase)를 생성한다고 보고되었다.

넷째 쎄라티아 플리무티카 AL-1에 의한 병원성 곰팡이 대한 길항력 조사

길항미생물 쎄라티아 플리무티카(S. plymuthica) AL-1에 의한 대파 병원균에 대한 길항력을 조사한 결과, 도 6에 도시한 바와 같이 대파의 병원성 진균으로 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum)에 대해서는 생육저지환의 크기가 15㎜로 나타났으며, 고추 검은무늬병(Alternaria altrata)은 9㎜, 고추 탄저병균(Colletotrichum gleosporioids)은 13㎜, 도라지 줄기마름병균(Phoma sp.)은 10㎜, 고추 잘록병균(Rhizoctonia solani)은 8㎜, 고추 흰별무의병균(Stemprhlium solani)은 8㎜, 오이 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum)은 7㎜, 수박 덩굴쪼김병(Fusarium oxysporium niveum)은 7㎜로 비교적 높은 길항력을 나타내었으나 참외 만고병균(Didymella bryoniae)에서는 길항력이 없었다.

상기 결과는 쎄라티아 플리무티카(S. plymuthica) AL-1을 15℃에서 배양하였을 경우에 나타나는 결과이나, 배양온도를 20℃∼30℃로 증가시키면 그 항균활성은 더욱 감소하다가 37℃ 배양때에는 균의 성장도 중지되었으며, 항균활성도 거의 나타나지 않는 특징을 가지고 있었다.

지금까지 알려진 쎄라티아 플리무티카의 길항력에 관한 연구로는 베르그(Berg)가 토마토의 버티실리움 시들음병을 유발하는 베르티실리움 다알리아에(Verticillium dahliae)와 모잘록병균 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 등의 곰팡이에 길항력이 높았다고 보고하였고, 클로에페르(Kloepper) 등이 오이 탄저병균(Collectotrichum orbiculare), 맥쿨라프(McCullagh) 등은 오이 피티움 뿌리썩음병균, 스탄리(Stanley) 등은 양배추 병원성 진균에 길항력을 가진다고 보고하였으며, 타닝(Thaning) 등은 감자, 강낭콩, 담배, 메밀 등에서 균핵병을 유발하는 오이 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum)에 길항하는 물질이 존재함을 보고하였다.

또한 맥인로(McInroy) 등은 목화와 사탕옥수수의 내생 미생물(endophytes)로 존재함을 확인하였다.

그러나 대파 흑색썩음균핵병균(S. cepivorum), 고추 검은무늬병(Alternaria altreta), 도라지 줄기마름병균(Phoma sp.)에 대한 길항한다는 보고는 없는 상태이다.

다섯째, 길항균 쎄라티아 플리무티카 AL-1의 길항물질 생성능 조사

길항균의 길항 메카니즘에는 시데로포레스(siderophores), β-1,3-글루카나제(β-1,3-glucanase), 키티나제(chitinase), 앤티바오틱(antibiotic),시안화물(cyanide) 등 다양하게 알려져 있다.

대파의 흑색썩음균핵병균(S. cepivorum)에 대해 높은 길항력을 가진 길항균 쎄라티아 플리무티카(S. plymuthica) AL-1이 어떠한 길항물질에 의해 길항력을 가지는 지를 조사하기 위해 1% 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 첨가하거나 첨가하지 않은 TSB 배지에서 배양한 배양 상등액을 YM10 멤브레인(membrane)으로 분자량 10,000을 기준으로 나누어 각각의 항균활성을 조사한 결과, 도 7에 도시한 바와 같이 1% 콜로이달 키틴(colloidal chitin)을 첨가한 배양에서는 10,000 이상에서도 길항력이 나타났고, 10,000 이하에서도 길항력을 나타내었다.

그러나 1% 콜로이달 키틴(colloidal chitin) 첨가하지 않은 배양에서는 10,000이하에서만 활성을 나타내었고, 10,000 이상에서는 거의 항균 활성이 없었다.

또한 10,000 이하 물질들을 80℃에서 열처리한 후, 길항력을 조사하여도 길항력을 나타내어 상기 메카니즘에서 키티나제(chitinase) 뿐만 아니라 분자량 10,000이하의 다른 생리활성물질도 존재할 것으로 추정되며, 콜로이달 키틴(colloidal chitin)에 의해 키티나제(chitinase)가 유도 생산됨을 확인하였다.

물론 본 발명에 의한 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카는 도 8에 도시한 바와 같이 대파 뿌리에서 길항균으로 서식하는 상태를 나타내는 사진이며, 도 8a는 대파의 뿌리를 100배로 확대한 사진이고, 도 8b는 상기 대파의 뿌리의 단부를 3000배로 확대한 사진이다.

쎄라티아(Serratia) 속이 키티나제(chitinase)를 생산한다는 보고는 세라티아 마르세스켄스(Serratia marcescens), 세라티아 프로테아마쿨란스(S. proteamaculans), 세라티아 스포룸(Serratia sp.) JM 등에서 보고되었으나, 쎄라티아 플리무티카(S. plymuthica)는 보고된 적이 없는 것이다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카는 대파 뿌리로부터 근권미생물 146종을 분리하여 대파 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum)에 길항하는 AL-1 균주를 이용하기 때문에, 대파의 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum)에 의한 병해를 미생물학적으로 용이하게 예방할 수 있으며, 흑색썩음균핵병균(Sclerotium cepivorum), 고추 검은무늬병(Alternaria altrata), 고추 탄저병균(Colletotrichum gleosporioids), 도라지 줄기마름병균(Phoma sp.), 고추 잘록병균(Rhizoctonia solani), 고추 흰별무의병균(Stemprhlium solani), 오이 균핵병균(Sclerotinia sclerotiorum), 수박 덩굴쪼김병(Fusarium oxysporium niveum) 등과 같은 각종 병원성 진균에 의한 병해를 미생물학적으로 용이하게 예방할 수 있다는 이점이 있다.

Claims

쎄라티아 플리무티카 AL-1(Serratia plymuthica AL-1 : 기탁번호 KCTC 10187BP) 균주로 이루어지는 대파 흑색썩음균핵병균에 길항하는 쎄라티아 플리무티카.