KR100403896B1

KR100403896B1 - 채소류 모잘록병균에 길항하는 바실러스 에히멘시스

Info

Publication number: KR100403896B1
Application number: KR10-2001-0016801A
Authority: KR
Inventors: 주길재; 김진호
Original assignee: 주길재
Priority date: 2001-03-30
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2003-11-03
Also published as: KR20020076719A

Abstract

본 발명은 채소류 모잘록병균에 우수한 길항력이 있는 바실러스 에히멘시스(Bacillus ehimensis) YJ-3(한국과학기술원 유전공학센터 기탁번호 KCTC 18034P)에 관한 것이다.

본 발명의 바실러스 에히멘시스(Bacillus ehimensis) YJ-3은 채소류 모잘록병균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG-4 및 피시움 울티뭄(Pythium ultimum)에 길항하는 미생물로 채소류 뿌리에서 분리·선별한 근권길항미생물이다.

그리고 본 발명의 미생물제는 채소류의 근권에 토착화·우점화되기가 쉽고 뿌리에 친화성을 가지고 있기 때문에, 뿌리 주변에 서식하고 있는 모잘록병균 및 각종 병원성 진균의 생육을 억제하거나 사멸시킬 수 있으므로 채소류 모잘록병 및 각종 병원성 진균에 의한 병해를 미생물학적으로 용이하게 예방할 수 있는 등의 효과를 발휘한다.

Description

채소류 모잘록병균에 길항하는 바실러스 에히멘시스{ANTAGONISTIC BACILLUS EHIMENSIS AGAINST VEGETABLES DAMPING-OFF}

본 발명은 채소류 모잘록병균에 길항하는 바실러스 에히멘시스에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 채소류의 모잘록병균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 피시움 울티뭄(Pythium ultimum)에 길항하는 미생물을 채소류 뿌리에 서식하는 근권미생물 중에서 분리·선별하여 그들 중에서 가장 길항력이 우수한 미생물 바실러스 에히멘시스(Bacillus ehimensis) YJ-3(한국과학기술원 유전공학센터기탁번호 KCTC 18034P)를 이용함으로써 채소류 모잘록병 및 각종 병원성 진균에 의한 병해를 미생물학적으로 용이하게 예방할 수 있도록 하는 채소류 모잘록병균에 길항하는 바실러스 에히멘시스에 관한 것이다.

채소류는 유묘 생산이 농사의 성패를 좌우할 만큼 중요한데, 대부분 채소류 재배 농가에서는 병원균에 오염된 인공 용토나 자재 등을 사용함으로 인하여 모잘록병에 의한 피해를 많이 보고 있다.

채소류 모잘록병은 파종상이나 가식상의 지온이 낮고 다습할 때, 모잘록병원균의 발생이 심하며, 토양이 산성일 경우에 발병이 더욱 심하고, 특히 기온 17℃~23℃일 때, 번식력이 가장 왕성하며, 피해가 심할 때에는 재파종하게 된다.

일반적으로 작물에서 모잘록병을 일으키는 병원 미생물은 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 피시움 울티뭄(Pythium ultimum), 피시움 아파니데르마툼(P. aphanidermatum), 피시움 에치노카르품(P. echinocarpum), 피시움 부트레이(P. butleri), 만활병균(Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae) 등이 알려져 있다.

채소류 모잘록병균은 주로 사나테포루스 쿠쿠메리스(Thanatephorus cucumeris : 무성세대, Rhizoctonia solani AG-4), 피시움 울티뭄(Pythium ultimum)이 주종을 이루고 있다.

라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)는 담자균류에 속하며, 완전세대는 사나테포루스 쿠쿠메리스(Thanatephorus cucumeris)로 알려져 있고, 이 병원균은 다범성으로 1년생 작물에 병을 일으키며 불규칙하고 짙은 갈색의 균핵을 형성하는특징을 가지고 있다.

모잘록병균(R. solani)은 현재 11개의 균사 융합군(anstomosis group)으로 분류되어 있으며, 각 균사융합균 간에는 다소간의 기주 특이성이 존재한다.

이들 AG 계열 중 AG-4에 속하는 균주는 작물에 뿌리썩음병(root rot), 모잘록병(damping-off) 등의 매우 파괴적이며 급속한 발병을 일으키는 균주이며, 모잘록병균 AG04(R. solani AG-4)가 일으키는 모잘록병은 대표적인 토양전염성 식물병으로써 대개 어린 식물의 줄기부분을 공격하여 식물체를 고사시키며, 지제부가 갈색 내지 암갈색으로 변하며 마른 상태로 썩는 특성을 나타낸다.

그 발병형태에 따라 프리이머전스 모잘록병(pre-emergence damping-off)와 포스트이머전스 모잘록병(post-emergence damping-off)으로 구분되고 있다.

피시움(Pythium) 균은 균사에 격막이 없고 유주자를 형성하며, 유성생식후 난포자를 형성한다. 형태가 조류와 비슷해 조균류라 부르기도 하며, 노균병균목 안의 부패균과에 속하고 여기에는 피시움(Pythium)과 파이토프토라(Phytophthora)의 2속이 있다.

피시움(Pythium)은 육상식물 뿐만 아니라 조류에도 기생하나 대부분은 토양이나 민물에서 부생생활을 하며, 세포막이 다른 곰팡이들과 달리 주로 섬유소(cellulose)로 구성되어 있으며, 스테롤(sterol)을 생체내에서 합성하지 못하는 곰팡이이다.

피시움(Pythium) 균의 의한 증상은 식물체의 지제부가 수침상으로 물러 썩는 것으로 나타난다.

지금까지 모잘록병의 방제는 살균제 처리에 의한 토양소독과 종자침지 등 농약을 주로 사용하며, 발리다미신(validamycin), 코로피크린(choropicrin), 카프탄(captan), 타키가렌(tachigaren), 호마이(homai), 카프타폴(captafol), PCNB, 마넵(maneb) 등의 농약류가 이용되고 있다.

최근 길항미생물을 이용한 생물학적 방제가 환경오염문제나 인축의 농약중독성 문제를 감소시킬 수 있는 환경친화형 미생물학적 방제의 한 방법으로 인식되면서 각종 미생물비료나 미생물농약이 제제화되어 등록되거나 시판되고 있다.

그러나 종래의 국내외 미생물제제에 사용되는 길항미생물의 역가는 우수하나, 실제 재배에서는 그 역가가 현저히 감소하는 경향이 있다.

이러한 이유로는 근권정착 능력의 부족, 선택미생물의 현장 생존력 부족, 토착미생물과의 경합 부족, 온도에 저항력 부족 등의 환경조건의 무시, 전달체계의 미흡이나 토양 우점화 방법의 미확립, 캐리어(carrier)의 편향적 사용 등의 문제점 때문이다.

지하부 병해의 미생물학적 방제를 위해서는 먼저 식물의 근권환경을 이해하는 것이 가장 중요하다.

그러나 미생물제제에 사용되는 유용미생물은 근권에서 생존하지 못하거나 뿌리 분비물에 저항하지 못하여 정착능력이 현저히 감소하여 그 효과를 볼 수가 없는 실정이다.

특히 채소류 모잘록병은 지하부 뿌리주변에서 서식하는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG-4 및 피시움 울티뭄(Pythium ultimum) 등의 병원균에 의해 자주 발생되고, 그 피해가 아주 광범위하므로 지하부 근권의 환경을 잘 이해 해야하는 것이 무엇보다도 중요하다.

일반적인 작물의 지하부 근권환경을 살펴보면, 식물 뿌리는 타감물질(allelochemics) 및 근권미생물의 먹이가 되는 여러 가지 유기물질들을 배출하고 있다.

이러한 물질들은 주로 뿌리의 선단부 근관에서 만드는 점액초(mucigel sheath)의 가용물과 근모에서 배출되는 액체방울, 그리고 세포에서 나오는 가용성 분비물, 세포벽의 노화로 인하여 생성되는 박리편, 미생물에 의해 피층 세포로부터 분리된 물질 등에 존재하며, 식물의 근권에서 기생균의 내구체를 특이하게 유도 발아시키는 경향이 있다.

아무리 좋은 유용미생물을 묘상이나 작물의 심는 부위에 집중적으로 투입한다 할지라도 대상 작물이 생산하는 타감물질로 인해 생육이 어렵게 되기 때문에 미생물의 효과를 얻기 어려울 것이다.

그러므로 대상식물 근권에 길항미생물을 정착시키려면 먼저 대상작물의 근권에 토착화·우점화되어 서식하는 근권 길항미생물을 분리 선별하고 이용함으로써 대상식물에 친화성을 쉽게 가지게 되므로 미생물학적 병해방제 적용에 더욱 유리할 것이다.

지금까지 보고된 바실러스 에히멘시스(Bacillus ehimensis)에 관한 연구내용으로는 키토산나제(chitosanase)를 분비하는 고초균으로 1996년 일본에 쿠로시마(Kuroshima) 등이 키틴(chitin)을 분해하는 세균을 토양으로부터 분리하여동정한 결과, 인터내셔널 저널(International Journal of Systematic Bacteriology)에 발표한 것이 처음이며, 1999년 일본에 아키야마(Akiyama) 등이 간행물(Journal of Bioscience and Bioengineering)에 키토산나제의 정제 및 그 유전자를 클로닝(cloning)하여 발표하였고, 2000년 일본에 시모사카 등이 응용공학(Applied Microbiology Biotechnology)에 그 유전자의 특성에 관하여 발표되었다.

그 외 아직까지 바실러스 에히멘시스에 관한 연구는 발표된 것이 없으며, 더욱이 바실러스 에히멘시스를 이용한 미생물학적방제에 관한 문헌이나 특허는 없는 실정이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 상기와 같은 모잘록병균의 길항미생물을 채소류의 근권에서 직접 분리·선별하여 이용함으로써, 작물의 근권정착능력을 증가시키고 채소류의 모잘록병균의 생육을 억제할 수 있는 항진균성 미생물 균주를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 의한 바실러스 에히멘시스의 항진균 활성을 관찰하기 위한 도면 대용 사진,

도 2는 도 1의 사진에 대응하는 배지에 도면 부호를 기재한 도면,

도 3은 버지스 매뉴얼의 방법에 의한 본 발명의 균주의 동정 결과표,

도 4는 세포벽 지방산 분석법에 의한 본 발명의 균주의 동정 결과표,

도 5는 16S rRNA 부분 염기서열 결정에 의한 본 발명의 균주의 동정 결과도이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부한 도면에 의거하여 더욱 상세하게 설명하며, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 채소류는 경상남도 창녕, 경상북도 성주, 고령 일원에서 일반적으로 재배되고 있는 무, 배추, 수박, 참외, 대파, 마늘 등 채소류의 뿌리를 수집하여 균원시료로 이용하였다.

근권미생물은 균원시료인 뿌리를 잘 세척하고 그 크기가 1mm가 되게 절단하여 그 1g에 0.85% NaCl 멸균수 10ml를 첨가하고 3단 희석한 후, NA(Nutrient agar) 배지에 100㎛씩 도말한 후 37℃에서 3일간 배양하여 순수 독립 colony 만을 분리하여 근권미생물로 사용하였다.

모잘록병균은 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG-4 및 피시움 울티뭄(Pythium ultimum)을 이용하였고, 이들 병원성 곰팡이 균주는 PDA(Potato Dextrose Agar) 배지상에서 28℃ 조건으로 4-10일간 배양한 다음 4℃에서 보관하면서 사용하였다.

모잘록병균에 대한 길항력조사는 생육저지대 측정법(pairing plate culture)을 이용하였다.

즉 PDA 배지에서 키운 모잘록병 균체 덩어리를 PDA 배지 중앙에 올려놓고 가장자리 4곳에 순수분리한 미생물을 한 백금이씩 접종하여 30℃에서 7∼10일간 배양한 후 모잘록병균의 균사체의 생장억제 정도(inhibition zone)를 조사하여 생성된 클리어 존(clear zone)의 크기가 큰 미생물을 길항균으로 선발하였다.

길항미생물의 동정은 첫째 일반적인 동정법인 버지스 매뉴얼(Bergey's Mannual of Systematic Bacteriology)의 방법에 준하여 미생물의 형태학적, 배양학적, 생리·생화학적 특성을 조사하였으며, 둘째, 미생물의 세포벽의 지방산의 조성으로 자동 동정하는 미디(MIDI)사의 세포벽 지방산 분석법(Sherlock system Microbial Identification system)을 이용하는 방법, 셋째, 16S 리보솜 알엔에이 부분 염기서열 결정(16S rRNA sequence ;Jukes and Cantor model, Neighbor-joining method)을 통한 분류 방법으로 동정하였다.

각종 식물의 병원성 진균에 대한 길항력조사를 위해 사용한 병원성 진균으로는 알터나리아 알트라타(Alternaria altrata), 콜렉토트리쿰 글로에스포리오이데스(Collectotrichum gloeosporioides), 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 푸사리움 옥시스포룸 쿠쿠메리눔(F. oxysporum cucumerinum), 푸사리움 옥시스포룸 니베움(F. oxysporum niveum), 글로에오스포리움 스포룸 글로에오스포리움 주그란디스(Gloeosporium sp. Gloeosporium juglandis), 글로메렐라 스포룸 글로에오스포리움 신굴라타(Glomerella sp. G. cingulata), 글로에오스포리움 라제나리아(G. lagenaria), 페니실리움 이타리쿰(Penicillium italicum), 페니실리움 디기타툼(P. digitatum), 파이토프소라 카피시(Phytophthora capsici), 스템프리리움 솔라니(Stemprhylium solani), 다이디멜라 브리오니애(Didymella bryoniae), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum) 등을 대상으로 하여 B. ehimensis YJ-3과 대치배양하여 균사체의 억제정도로 항진균 활성을 상기와 같은 방법으로 조사하였다.

바실러스 에히멘시스(Bacillus ehimensis) YJ-3은 2000년 8월 3일자로 부다페스트 조약에 따른 국제기탁기관인 한국과학기술원 생명공학연구소 내 유전자은행(Korea Collection for Type Cultures, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)에 기탁번호 KCTC 18034P로 기탁되었다.

첫째, 채소류 모잘록병에 길항하는 미생물의 선발

채소류 모잘록병균에 길항력을 가지는 미생물을 선발하기 위하여 경상남북도 일원의 균원시료로부터 근권미생물을 순수분리하고 2종류의 모잘록병균인 라이족토니아 솔라니 AG-4(Rhizoctonia solani AG-4)와 피시움 울티뭄(Pythium ultimum)에 각각 서로 대치배양하여 생육저지대 측정법으로 조사한 후 2종의 병원균에서 가장 강한 균사 생장억제 효과를 나타내는 YJ-3 균주를 최종 선발하였다. 선발한 YJ-3균주는 대파, 마늘, 무 등 채소류의 뿌리 중에서 많이 존재하였다.

둘째, 미생물의 일반적인 동정

상기 선발균주 YJ-3은 도 3에 도시한 바와 같이, 그람(gram) 염색에서 양성이었고, 운동성이 없으며, 전자현미경 관찰하에서는 여러 개의 편모를 가지고, 내생포자를 형성하는 간균 형태이며, 카탈라제(catalase)는 음성, 혐기적 조건에서는 생육이 불가능하였으며, 보게스프로스타우레 테스트(Voges-Prostaure test) 양성, 글루코스(D-glucose), 아라비노스(L-arabinose), 크실로스(D-xylose), 만니톨(D-mannitol)에서는 산을 생성하였고, 글루코스(glucose)에서 배양할 경우 가스를 생성하였으며, 카세인(casein), 젤라틴(gelatin), 녹말(starch)을 가수분해하며, 티로신(tyrosine)을 분해하지 못하였고, 또한 질산염 감소(nitrate reduction)과 구연산염(citrate) 이용성 및 인돌(indole) 생성능은 음성, 2% NaCl 이하 농도에서는 생육이 가능하며, 50℃까지 생육하는 특성을 가지고 있어 바실러스(Bacillus) 속임을 확인하였다.

셋째, 세포벽 지방산 분석법(Sherlock system)에 의한 동정

미디(MIDI)사의 세포벽 지방산 분석(Sherlock system)의 미생물 동정장치로YJ-3의 세포벽 지방산 분석결과는 도 4에 도시한 바와 같이, 주로 C14:0 iso, C14:0, C15:0 iso, C15:0 anteiso, C15:0, C16:1 w7c alcohol, C16:0 iso, C16:1 w11c, C16:0, C17:1 w10c, C17:0 iso, C17:0 anteiso로 이루어져 있으며, 포화지방산인 C15:0 iso(7.80%), C15:0 anteiso(52.26%) 및 C17:0 iso(3.18%)가 많이 포함되어 있었다. 이러한 결과, 바실러스 에히멘시스(Bacillus ehimensis)는 표준균주와 0.869의 유의성 즉, 86.9%의 유사도를 가지는 것이며, 패니바실러스 고르도네(Paenibacillus gordonae)는 0.645, 패니바실러스 폴리믹사(Paenibacillus polymyxa)는 0.350의 유의성을 가지는 것으로 확인되었다.

넷째, 16S rRNA 염기서열 결정에 의한 동정

상기 YJ-3 균주의 16S rRNA 부분 염기서열(604bp)을 결정하여 주크(Jukes)와 캔터(Cantor)의 모델(model)에 의하여 이벨루션너리 디스턴스(evolutionary distance)를 계산하여 네이버 조인 방법(Neighbor-joining method)으로 계통수를 작성한 결과, 분리주 YJ-3은 도 5에 도시한 바와 같이, 바실러스 에히멘시스(Bacillus ehimensis)의 표준균주와 97.84%의 높은 유사도를 보였으며, 패니바실러스 코린시스(Paenibacillus koreensis)와 96.85%, 패니바실러드 발리더스(Paenibacillus validus)와 93.86%, 패니바실러스 키바엔시스(Paenibacillus chibaensis)와 92.79%의 유사도를 나타내었다.

다섯째, 채소류 모잘록병균의 생육억제

바실러스 에히멘시스 YJ-3(B. ehimensis YJ-3)의 배양 상등액으로부터 얻어진 무균여과액을 10%(v/v)되게 첨가하여 만든 피디브로스(PD broth) 배지와 무균여과액을 첨가하지 않은 피디브로스(PD broth) 배지(대조구)에 모잘록병균 라이족토이나 솔라니 AG-4(Rhizoctonia solani AG-4)와 피시움 울티뭄(Pythium ultimum)의 균체 덩어리를 각각 접종하여 7일간 배양한 후 균사 생장 억제를 관찰한 결과, 모잘록병균이 대조구에 비하여 처리구에서는 강한 균사생장 억제효과를 나타내었으며, 특히 대조구에서는 관찰되지 않고 있는 균사의 분지접이 많이 생성되었고, 하단세포나 중앙세포가 심하게 팽윤되거나 세포벽이 손상되었으며, 전체 균사가 똘똘말린 모습을 관찰할 수 있었고 또한 균사의 색은 진한 갈색이었으나 처리한 구에서는 약간 연갈색으로 탈색되었다.

여섯째, 채소류 병원성 진균에 대한 항진균성 조사

여기서 본 발명에 의한 바실러스 에히멘시스 YJ-3은 도 1과 도 2에 도시한 바와 같은 결과로 알 수 있으며, 배지 1에는 바실러스 에히멘시스(B. ehimensis) YJ-3, 2에는 페니실리움 이탈리쿰(Penicillium italicum), 3에는 피시움 울티뭄(Pythium ultimum), 4에는 스펨프리리움 솔라니(Stemprhylium solani), 5에는 페니실리움 다지타툼(P. digitatum), 6에는 푸사리움 모니리포르메(Fusarium moniliforme), 7에는 글로에오스포리움 스포룸(Gloeosporium sp.), 8에는 콜렉토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Collectotrichum gloeosporioides), 9에는 다이디멜라 브리오니애(Didymella bryoniae) 10에는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG-4, 11에는 글로에오스포리움 라제나리아(G. lagenaria), 12에는 파이토프소라 카프시시(Phytophthora capsici), 13에는 글로에오스포리움 신굴라타(G. cingulata), 14에는 알터나리아 알트라타(Alternaria altrata), 15에는 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 16에는 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 17에는 푸라시움 옥시스포룸 쿠쿠메리눔(F. oxysporum cucumerinum), 18에는 푸라시움 옥시스포룸 니베움(F. oxysporum niveum)의 병원균이 있다.

라이족토니아 솔라미 AG-4(Rhizoctonia solani AG-4) 및 피시움 울티뭄(Pythium ultimum) 이외에도 바실러스 에히멘시스(B. ehimensis) YJ-3에 의한 병원성 진균의 길항력을 조사한 결과, 도 1과 도 2에 도시한 바와 같이, 병원균인 Alternaria altrata, Collectotrichum gloeosporioides, Didymella bryoniae, Fusarium moniliforme, Fusarium oxysporum, F. oxysporum cucumerinum, F. oxysporum niveum, Gloeosporium sp., Glomerella sp. G. cingulata, G. lagenaria, Penicillium digitatum, P. italicum, Phytophthora capsici, Pythium ultimum, Rhizoctonia solani AG-4, Sclerotinia sclerotiorum, Stemprhylium solani 등 대부분의 병원균에 대해서 항진균 활성을 나타내었다.

특히 Alternaria altrata, Fusarium oxysporum cucumerinum, F. moniliforme, F. oxysporum niveum, Penicillium digitatum, Stemprhylium solani 등의 진균에서는 라이족토니아 솔라니 AG-4(Rhizoctonia solani AG-4)와 피시움 울티뭄(Pythium ultimum)에서의 길항력과 거의 동일하게 높은 항진균 활성을 가지고 있었다.

이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명의 바실러스 에히멘시스(Bacillusehimensis) YJ-3은 채소류 모잘록병균인 라이족토니아 솔라니 AG-4(Rhizoctonia solani AG-4) 및 피시움 울티뭄(Pythium ultimum)에 길항하는 미생물로 채소류 뿌리에서 분리·선별한 근권길항미생물이다.

그리고 본 발명의 미생물제는 채소류의 근권에 토착화·우점화되기가 쉽고 뿌리에 친화성을 가지고 있기 때문에, 뿌리 주변에 서식하고 있는 모잘록병균 및 각종 병원성 진균의 생육을 억제하거나 사멸시킬 수 있으므로 채소류 모잘록병 및 각종 병원성 진균에 의한 병해를 미생물학적으로 예방이 가능한 이점이 있다.

Claims

바실러스 에히멘시스 YJ-3(Bacillus ehimensis YJ-3 : KCTC 1803P) 균주로 이루어지는 채소류 모잘록병균에 길항하는 바실러스 에히멘시스.