CN117481143A - 多粘类芽孢杆菌yf在促进植物生长中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YF在促进植物生长中的应用，所述的多粘类芽孢杆菌YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517；所述的多粘类芽孢杆菌YF在含Trp培养基中分泌的吲哚乙酸IAA量为13.83mg/L；且可分泌铁载体；成功表达绿色荧光，在根和茎表面和内部均可检测到，平均定殖率为104CFU/g，且持续时间较长。108CFU/mL多粘类芽孢杆菌YF处理马铃薯的各项生理指标比对照处理均提高，说明多粘类芽孢杆菌YF对马铃薯有促进生长的效果。
Description
技术领域
本发明涉及农业微生物技术领域，具体涉及多粘类芽孢杆菌YF在促进植物生长中的应用。
背景技术
马铃薯(Solanum tuberosum L)属茄科多年生草本植物，是我国第四大粮食作物。一方面，该作物含有胡萝卜素，经常食用马铃薯可以有效降低高血压，对降低患结肠癌及心脏病几率也有辅助作用。另一方面，马铃薯播种的总面积达到1920.50万公顷，产量和产值均占全世界全部粮食作物的13％左右，是继小麦、水稻和玉米之后的世界第四大粮食作物。马铃薯种植户为了追求更高的产量和效益，种植中大量使用化肥，导致土壤板结、肥料利用率降低、环境污染等诸多问题。用微生物肥料替代化学肥料，既可以促进作物生长、改善土壤，又可以减少环境污染。
植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)指生存在植物根际范围中对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌。能够改善植物根际土壤环境、提高速效养分含量、降解毒害物质，分泌抗病促生物质，诱导菌植互作，对植物整体的生长发育、抗病促生，具有显著的影响。例如发明专利CN107593769B公开了巨大芽孢杆菌YJB3在促进植物生长和生防中的应用；发明专利CN113373094B公开了耐寒短杆菌SDB5在促进植物生长中的应用。但是，目前常用的植物促生菌存在植物促生效果不理想、抗逆性差、在药用植物中不能应用的技术问题，因此有必要寻找一种植物促生作用更好且抗逆性强的菌株。
发明人在研究过程中意外的发现，多粘类芽孢杆菌YF能够分泌的吲哚乙酸IAA和铁载体；能够定植于马铃薯根部和茎部，促进植物生长，具有广阔的应用前景。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的首要目的是提供多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YF在促进植物生长中的应用，所述的多粘类芽孢杆菌YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21517。
优选的，所述的植物为马铃薯。
优选的，所述的植物生长指标包括以下一项或几项：株高、根长、鲜重、干重和茎粗。
本发明的第二目的使提供多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YF在合成铁载体中的应用，所述的多粘类芽孢杆菌YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517。
本发明的第三目的使提供多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YF在合成吲哚乙酸IAA中的应用，所述的多粘类芽孢杆菌YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517。
优选的，所述的多粘类芽孢杆菌YF发酵液的制备方法为：将多粘类芽孢杆菌YF接种到已灭菌的富集培养基中，摇床震荡培养，使用无菌水稀释到1×108CFU/mL，所述的培养条件为：温度为30-37℃，转速为150-180rpm，培养时间为36-48h。
优选的，所述的富集培养基的配方为葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，硫酸镁5g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙1g/L，pH为6.5～7.5。
优选的，所述的多粘类芽孢杆菌YF加入农药学上可接受的辅料制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。
优选的，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
本发明的有益效果是：(1)本发明提供了多粘类芽孢杆菌YF在促进植物生长中的新用途，所述的多粘类芽孢杆菌YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21517；(2)所述的多粘类芽孢杆菌YF在含Trp培养基中分泌的吲哚乙酸IAA量为13.83mg/L；且多粘类芽孢杆菌YF可分泌铁载体；(3)多粘类芽孢杆菌YF成功表达绿色荧光，在根和茎的表面及内部均可检测到，平均以104CFU/g定殖于马铃薯根部和茎部，且持续时间较长。(4)与对照处理相比，108CFU/mL多粘类芽孢杆菌YF处理马铃薯的各项指标比对照处理分别提高56.03％、57.52％、13.73％、11.46％和16.41％，说明多粘类芽孢杆菌YF对马铃薯有促进生长的效果。
附图说明
图1为多粘类芽孢杆菌YF基于16s rDNA序列的系统发育树
图2为多粘类芽孢杆菌YF生成铁载体和吲哚乙酸(IAA)检测图注：a为CAS固体培养基，b为IAA标准液(左)、不含L-色氨酸的菌液(中)和含有L-色氨酸的菌液(右)的比色反应。
图3为多粘类芽孢杆菌YF成功定殖于马铃薯根部和茎部图
注：左为马铃薯根部定殖图，右为马铃薯茎部定殖图。
图4为多粘类芽孢杆菌YF成功定殖于马铃薯根部和茎部的持续效果统计
注：左为马铃薯根部持续效果统计，右为马铃薯茎部持续效果统计。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的保护范围并不受以下实施例的限制。
以下实施例中所述的富集培养基的配方为葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，硫酸镁5g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙1g/L，pH为6.5～7.5。
以下实施例中所述的LB固体培养基的配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L。
以下实施例中所述的燕麦番茄培养基的配方为：燕麦50g/L，西红柿汁100mL/L，CaCO30.4g/L，琼脂16g/L。
实施例1、菌株的分离、纯化和鉴定
2019年9月20日从甘肃省定西市临洮县玉井镇养殖户羊粪堆肥采集样品，采用稀释涂布法对微生物分离纯化，称取样品1g加入装有9mL无菌水稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等不同浓度，涂布于LB固体培养基，于30℃培养箱倒置培养，挑取单菌落平板划线纯化，得到纯菌株。筛选拮抗效果好的菌株命名为YF。菌落为圆形，突起，乳白色，粘稠状，不透明，表面湿润光滑边缘不整齐，具有很强的粘性。通过16srDNA分子生物学鉴定，确定菌株为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)，基于16sr DNA序列的系统发育树和菌落照片如图1所示。
将筛选得到的菌株多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YF于2020年12月21日在中国普通微生物菌种保藏管理中心登记保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21517，联系电话为：010-64807355。
以下实施例中，将多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YF，简写为多粘类芽孢杆菌YF。
实施例2、多粘类芽孢杆菌YF对马铃薯促生作用
多粘类芽孢杆菌YF在含有L-色氨酸和不含有L-色氨酸的LB液体培养基中培养2天，温度30℃，转速180rpm。12000rpm离心5min后，上清液与Salkowski试剂(150mL浓H2SO4，250mL sdH2O，7.5mL 0.5M FeCl3·6H2O)按1:1比例以短涡流方式混合。在30℃和黑暗中孵育30分钟后，用分光光度计在530nm处测量混合物的光吸光度。
通过O-CAS检测定性地检测了铁载体的产生，细菌在LB琼脂平板上划线，30℃孵育24h。菌落接种在以琼脂糖为胶凝剂的CAS培养基上，30℃孵育48h，在菌落周围出现一个清晰的光晕被认为是产生铁载体的标志。
实验结果如图2所示，多粘类芽孢杆菌YF在不含L-色氨酸的培养基的比色反应中呈淡红色，相反在含有L-色氨酸的培养基中的比色反应是深红色，多粘类芽孢杆菌YF在含Trp培养基中分泌的吲哚乙酸IAA量为13.83mg/L；此外通过O-CAS检测可得多粘类芽孢杆菌YF可分泌铁载体，说明多粘类芽孢杆菌YF可促进植物生长。
实施例3、多粘类芽孢杆菌YF在马铃薯根部和茎部定殖作用
用GFP标记的载体pGFP4412构建了GFP标记的多粘类芽孢杆菌YF-GFP。多粘类芽孢杆菌YF-GFP在100mL含100μg/mLAmp的LB液体培养基中培养过夜，30℃孵育。将生长良好的马铃薯块茎经表面灭菌后移栽至无菌土壤的花盆中，再加入100mL YF-GFP(108CFU/mL)发酵液，100mL水为空白对照。在接种后5、10、15、20、25d随机采集马铃薯根部和茎部组织样本，采用平板法检测菌落数，并在488nm的激发波长下使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSMOlympus FV3000)进行观察。
实验结果如图3和4所示，定殖效果通过观察马铃薯根部和茎部接种菌株GFP-YF后不同时间在激光共聚焦显微镜下的荧光菌体判断。在接种10天后，根部绿色荧光强度达到最大，说明GFP-YF已经明显定殖到马铃薯根部的表面，接种15天后，可以观察到GFP-YF已经渗入到马铃薯根的内部，随后趋于稳定；在接种5天后，茎部绿色荧光强度达到最强，说明GFP-YF已经明显定殖到马铃薯茎部的表面，接种10天后，可以观察到GFP-YF已经渗入到马铃薯茎的内部，随后趋于稳定。最终证实，GFP-YF在马铃薯的根部和茎部均能稳定定殖，定殖率均在104CFU/g以上，且持续时间较长。
实施例4、多粘类芽孢杆菌YF对马铃薯幼苗促生效果评价
盆栽实验在兰州交通大学的温室中进行。马铃薯块茎用75％酒精进行表面消毒，种植在装有消毒土壤的塑料盆(直径20厘米)中，并在25℃下培养发芽。每盆每5天用50mL多粘类芽孢杆菌YF悬浮液(1×108CFU/mL)灌溉一次，水作为阴性对照。种植30天后，测量高度、根长、茎粗、鲜重和干重，每个处理包括30个马铃薯苗。
实验结果如表1所示，与对照处理相比，108CFU/mL多粘类芽孢杆菌YF处理马铃薯的株高、根长、鲜重、干重和茎粗等各项指标比对照处理分别提高16.41％、57.52％、11.46％、56.03％和13.73％，说明多粘类芽孢杆菌YF对马铃薯有促进生长的效果。
表1多粘类芽孢杆菌YF对马铃薯幼苗促生效果评价
注：不同字母表示各组间具有显著性差异。
综上所述，本发明提供了多粘类芽孢杆菌YF在促进植物生长中的新用途，所述的多粘类芽孢杆菌YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517；所述的多粘类芽孢杆菌YF在含Trp培养基中分泌的吲哚乙酸IAA量为13.83mg/L，且多粘类芽孢杆菌YF可分泌铁载体；成功表达绿色荧光-多粘类芽孢杆菌YF，在根部和茎部的表面及内部均可检测到，平均104CFU/g定殖于马铃薯根部和茎部，且持续时间较长。同时，与水处理相比，108CFU/mL多粘类芽孢杆菌YF处理马铃薯根部的各项指标比水处理分别提高56.03％、57.52％、13.73％、11.46％和16.41％，说明多粘类芽孢杆菌YF对马铃薯根部有促进生长的效果。
Claims (9)
1.多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YF在促进植物生长中的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植物为马铃薯。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的植物生长指标包括以下一项或几项：株高、根长、鲜重、干重和茎粗。
4.多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YF在合成铁载体中的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517。
5.多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)YF在合成吲哚乙酸IAA中的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌YF于2020年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21517。
6.如权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌YF发酵液的制备方法为：将多粘类芽孢杆菌YF接种到已灭菌的富集培养基中，摇床震荡培养，使用无菌水稀释到1×108CFU/mL，所述的培养条件为：温度为30-37℃，转速为150-180rpm，培养时间为36-48h。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的富集培养基的配方为葡萄糖10g/L，蛋白胨15g/L，硫酸镁5g/L，氯化钠3g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，氯化钙1g/L，pH为6.5～7.5。
8.如权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于，所述的多粘类芽孢杆菌YF加入农药学上可接受的辅料制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、水悬浮剂或可分散油悬浮剂。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述农药学上可接受的辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
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