CN104894014A - 一株芽孢杆菌及其在高盐废水中降解有机物的应用 - Google Patents

一株芽孢杆菌及其在高盐废水中降解有机物的应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一株芽孢杆菌及其在高盐废水中降解有机物的应用。本发明提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)Y5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10527。芽孢杆菌Y5可用于降解高盐废水中的有机物，具有耐盐、适用pH值范围宽、适用温度范围宽，以及操作简单、降解效率高的优点。

Description

一株芽孢杆菌及其在高盐废水中降解有机物的应用
技术领域
本发明涉及一株芽孢杆菌及其在高盐废水，特别是高盐生活污水中降解有机物的应用。
背景技术
高盐废水是指含有有机污染物和至少3.5％(质量浓度)的总溶解固体物(TDS)的废水，属于难生物处理废水。高盐废水的总含盐质量分数≥1％，其中所含盐类物质多为Cl-、SO4 2-、Na+、Ca2+。
我国高盐废水产生数量在总废水中达5％，每年仍以2％的速率增长。高盐废水主要来源于海水代用排放的废水,如发达国家年海水冷却水用量已经超过了1000亿立方米，目前我国海水的年利用量为60多亿立方米。此外，还有工业废水和其他高盐废水，例如我国西北边疆地区由于地理环境问题所排放的生活污水等。高盐废水中离子浓度过高，则会对微生物产生抑制和毒害作用，盐浓度高、渗透压高、微生物细胞脱水引起细胞原生质分离；盐析作用使脱氢酶活性降低；Cl-1浓度高对细菌有毒害作用；由于水的密度增加，活性污泥易上浮流失，严重影响生物处理系统的净化效果。
因此仍需要研发适于高盐废水处理的微生物。
发明内容
为此，本发明的目的是提供一株芽孢杆菌及其在高盐废水中降解有机物的应用。
本发明的第一方面提供一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)Y5，该菌株已于2015年02月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号邮编100101)，保藏号为CGMCC No.10527。本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)Y5简称芽孢杆菌Y5。
本发明的第二方面提供一种用于高盐废水处理的产品，所述产品包括本发明的芽孢杆菌Y5培养液的冻干粉末。
所述冻干粉末优选是用浓度为108～109cfu/mL的所述芽孢杆菌Y5的高盐无机培养液冻干而成。
所述高盐无机培养液中的盐浓度为30～80g/L，优选为40～60g/L，具体可为50g/L NaCl。所用高盐无机盐培养基的pH值为6.0～8.0，优选7.0～7.5，具体可为7.25。
所述高盐无机培养液中除用于产生盐度的NaCl外，主要是适于细菌筛选的常规无机培养液。本领域技术人员可以根据需要选择适宜的无机培养液。本发明采用的是基础盐培养液，其中典型地包括：NaCl 0.5g、MgSO4 0.5g、NH4Cl 0.5g、KH2PO4 0.5g、K2HPO4 1.5g、NH4NO3 1.0g、酵母膏0.05g。将各组分依次溶解后调节pH＝7.0，最后定容至1L。
优选将所述芽孢杆菌Y5接种至所述高盐无机盐培养基中，在25～40℃(如37℃)振荡培养12～36小时(如24小时)，然后将培养液冻干。
更进一步地，本发明还提供一种制备上述产品的方法，包括如下步骤：将所述芽孢杆菌Y5接种至所述高盐无机盐培养基中，进行培养，(例如可以在25～40℃(如37℃)振荡培养12～36小时(如24小时))，然后将培养体系冻干，得到所述产品。
优选地，接种后，所述芽孢杆菌Y5的初始浓度具体可为103～105cfu/mL，如104cfu/mL。完成所述振荡培养后，所述培养体系中所述芽孢杆菌Y5的浓度可达到为108～109cfu/mL。所述振动培养可采用任何合适的转速，例如200r/min。
本发明的第三方面提供所述芽孢杆菌及上述含有本发明芽孢杆菌的产品在高盐废水处理中的应用。具体地用于降解高盐废水、特别是高盐生活污水中有机物的应用。应用所述芽孢杆菌或所述产品处理高盐废水时，反应体系的pH值可为6.0～8.0，优选为7.0～8.0。
所述高盐废水中的盐浓度可为5g/L以上，可以达到10～30g/L。所述盐度为NaCl盐度(即，将废水中的盐度换算为NaCl来表示)。
根据本发明的第四方面，提供一种高盐废水处理方法，包括以下步骤：在高盐废水中投入所述芽孢杆菌Y5或所述产品，并发酵一段时间。其中所述高盐废水的含盐量由NaCl提供为5g/L以上，优选为10～30g/L，pH值为6.0～8.0，优选为7.0～8.0。
根据一种实施方式，所述发酵的温度为10℃～40℃，优选为20℃～35℃。发酵时间为80～100小时。
根据一种实施方式，所述芽孢杆菌或所述产品的投入量为使高盐废水中初始菌含量为104～105cfu/mL。
本发明从某污水处理厂的活性污泥中分离到一株能够高效降解高盐废水中有机物的菌株。经形态、培养特征及生理生化实验结果观察，鉴定出该菌为芽孢杆菌。该菌株对高盐废水中有机物具有很高降解效果。该菌在高盐废水的高盐浓度溶液和低温的条件下，依然表现出良好的降解能力。实际应用中，可将该菌株扩大培养制成成品菌悬液或粉剂，投放于实际的废水体系中。本发明具有成本低、操作简单、降解效率高、适应性强等优点。
本发明的优点及效果：(1)本发明的菌株可适应废水中高盐高有机物的特性，可适用范围宽；(2)采用该菌株进行高盐污水处理具有成本低、操作简单、降解效率高的优点；(3)采用该菌株进行污水处理环境相容性好，可减少或避免使用化学试剂，避免二次污染。本发明的菌株在高盐类物质污染环境的生物修复方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明芽孢杆菌Y5的16S rRNA的序列。
图2为实施例2中各个样本中有机物的浓度。
图3为实施例3中各个样本中有机物的浓度。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
LB培养基的制备方法：将10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物和所需盐度相应的NaCl用MiLLi-Q水溶解并定容至1L。
无机盐培养基的制备方法：将4g K2HPO4、4g NaH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.01gCaCl2·H2O、0.01g FeSO47·H2O、0.01g MnSO4·2H2O按顺序溶于MiLLi-Q水，定容至1L，并调节pH至7.0～7.2。在该无机盐培养基中根据实验需要的盐度加入氯化钠后使用。
实施例中所用的缓冲液是1M、pH为7.0的PBS缓冲液。
实施例1、芽孢杆菌Y5的获得和鉴定
一、芽孢杆菌Y5的获得
污泥样本为2014年3月取自北京市某污水处理厂活性污泥。
在容器中，加入少量污泥样品以及盐度为20g/L的LB液体培养液，于摇床中25℃恒温振荡48小时后取5mL培养液，加入新鲜的20g/L的LB液体培养液中继续培养48小时，再取5mL培养液加入新鲜的20g/L的LB液体培养液中继续培养，如此反复操作一周。最后取5mL培养液投加到盐度为30g/L的新鲜LB液体培养液中在同样条件下培养48小时，按上述方法在盐度为30g/L的培养液中反复操作培养一周，在将培养液的盐度提高到40g/L，以此类推，最后将LB液体培养液的盐度升高到80g/L，并在该盐度下反复培养操作一周，诱导菌株产生耐高盐的机制，从中获得耐盐菌株。然后采用液体稀释法获得纯培养的菌株，再通过高盐废水中有机物降解实验，从中筛选对有机污染物去除能力强的菌株。
最终获得一株耐高盐的菌株，将其命名为Y5。
二、芽孢杆菌Y5的鉴定
1、形态鉴定
菌落形态：菌落直径2mm左右菌落，全缘，无色，半透明。革兰氏阳性菌，生芽孢，需氧、化能异养。
2、生理生化鉴定
可利用D-核糖、糖元、葡萄糖等多种碳源。
3、分子鉴定
对菌株进行16S rRNA鉴定，其编码序列如图1所示。将16S rRNA的编码序列进行BLAST分析，发现与其同源性最好的菌株为Bacillus subtilis(GENBANK ACCESSIONNO.EU-144043.1)，同源性为99％。
三、芽孢杆菌Y5的保藏
根据细胞形态、生理生化、16S rRNA鉴定的结果，菌株属于芽孢杆菌(Bacillus sp.)。虽然保藏中心最后将该菌株鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，但是通过对照发育树，可以认定该菌株属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，同源性超过99％。
芽孢杆菌(Bacillus sp.)Y5，已于2015年02月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.10527。芽孢杆菌(Bacillus sp.)CHS简称芽孢杆菌Y5。
实施例2、芽孢杆菌Y5在降解高盐污水中有机物的应用(采用不同pH环境)
高盐污水的pH值通常为6.0-8.0，不同pH对芽孢杆菌Y5降解高盐污水中有机物会有一定的影响，所以本实施例用于检测芽孢杆菌Y5在不同pH环境中对高盐生活污水中有机物的降解能力。以下所用生活污水取自北京市某居民区，TOC(总有机物含量)约为80mg/L，不同盐度梯度均通过投加相应质量的NaCl实现。
1、将芽孢杆菌Y5用PBS缓冲液配制成菌浓度为107cfu/mL的菌悬液。
2、分组处理(采用平行处理，每组设置三个重复处理)
第一组：(空白组)将1mL不含菌液的PBS缓冲液接种至100mL盐度为30g/L的生活污水中，25℃、200r/min振荡培养；
第二组：将1mL步骤1的菌悬液接种至100mL盐度为30g/L的生活污水(pH值为6.0)中，25℃、200r/min振荡培养；
第三组：将1mL步骤1的菌悬液接种至100mL盐度为30g/L的生活污水(pH值为6.5)中，25℃、200r/min振荡培养；
第四组：将1mL步骤1的菌悬液接种至100ml盐度为30g/L的生活污水(pH值为7.0)中，25℃、200r/min振荡培养；
第五组：将1mL步骤1的菌悬液接种至100ml盐度为30g/L的生活污水(pH值为7.5)中，25℃、200r/min振荡培养；
第六组：将1mL步骤1的菌悬液接种至100ml盐度为30g/L的生活污水(pH值为8.0)中，25℃、200r/min振荡培养；
从接种完开始计时，分别于0小时、12小时、36小时、60小时、84小时和108小时后取样。
将各个时间取得的样本分别进行如下处理：首先取10ml混合液于10ml离心管中，然后在3000r/min，20℃条件下离心5min，取上清液，采用总有机碳检测器(日本SHIMADZU)检测上清液的有机物浓度。
结果示于图2中，由图2可见，本发明的菌株在pH 6.0～8.0、特别是在7.0～8.0的范围内，均匀优异的降解有机物的作用。
实施例3、芽孢杆菌Y5在降解高盐污水中有机物的应用(采用不同温度条件)
我国大部分地区冬季生活污水温度较低以及西北边疆地区由于地理环境问题所排放的生活污水盐度高同时也面临着环境温度低的问题，所以本实施例用于检测芽孢杆菌Y5在不同温度下对高盐废水中有机物的降解能力。所用污水与实施例2中的相同。1、同实施例2的步骤1。
2、分组处理(采用平行处理，每组设置三个重复处理)
第一组：将1mL不含菌液的PBS缓冲液接种至100mL盐度为30g/L的生活污水中，常温下200r/min振荡培养；
第二组：将1mL步骤1的菌悬液接种至100mL盐度为30g/L的生活污水中，10℃、200r/min振荡培养；
第三组：将1mL步骤1的菌悬液接种至100mL盐度为30g/L的生活污水中，15℃、200r/min振荡培养；
第四组：将1mL步骤1的菌悬液接种至100mL盐度为30g/L的生活污水中，20℃、200r/min振荡培养；
第五组：将1mL步骤1的菌悬液接种至100mL盐度为30g/L的生活污水中，25℃、200r/min振荡培养；
第六组：将1mL步骤1的菌悬液接种至100mL盐度为30g/L的生活污水中，35℃、200r/min振荡培养；
从接种完开始计时，分别于0小时、12小时、36小时、60小时、84小时和108小时后取样。
3、同实施例2的步骤3。
结果示于图3，各个样本中有机物的浓度在各个温度条件下，芽孢杆菌Y5对有机物均具有良好的降解效果。特别在20℃～35℃下对有机物的降解效果更好。
实施例4、芽孢杆菌Y5粉剂的制备及其对高盐污水有机物的降解作用
一、芽孢杆菌Y5粉剂的制备
1、将芽孢杆菌Y5接种至盐度(以NaCl计)为50g/L的无机盐培养基(pH值为7.25)中，使其初始浓度为104cfu/mL，25℃、200r/min振荡培养12小时，完成培养后培养体系中芽孢杆菌Y5的浓度为108cfu/mL，将培养体系冻干，得到粉剂，即为产品Ⅰ。
2、将芽孢杆菌Y5接种至盐度为50g/L无机盐培养基(pH值为7.75)中，使其初始浓度为104cfu/mL，25℃、200r/min振荡培养24小时，完成培养后培养体系中芽孢杆菌Y5的浓度为109cfu/mL，将培养体系冻干，得到粉剂，即为产品Ⅱ。
二、芽孢杆菌Y5粉剂对高盐生活污水有机物的降解作用
1、分别将步骤一制备的产品Ⅰ、产品Ⅱ进行如下实验：
将1g产品I和产品II分别投放至20mL盐度为50g/L、初始有机物浓度为80mg/L的生活污水(pH值为8.75)中，25℃、200r/min振荡培养96小时。然后检测培养体系中的有机物浓度。所用污水与实施例2中的相同。
投放产品Ⅰ并振荡培养96小时后，培养体系中有机物的浓度为35mg/L。
投放产品Ⅱ并振荡培养96小时后，培养体系中有机物的浓度为37mg/L。
2、分别将步骤一制备的产品Ⅰ、产品Ⅱ进行如下实验：
生活污水取自北京市某污水处理厂的原水，通过添加NaCl调节生活污水盐度为5％，初始有机物浓度为80mg/L，pH平均值为7.2。
将1g步骤一制备的产品投放至20mL高盐生活污水中，25℃、200r/min振荡培养，96小时后检测培养体系中的有机物浓度。
投放产品Ⅰ并振荡培养96小时后，培养体系中有机物的浓度为25mg/L。
投放产品Ⅱ并振荡培养96小时后，培养体系中有机物的浓度为30mg/L。

Claims (10)

1.一株芽孢杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10527。
2.一种用于高盐废水处理的产品，所述产品包括权利要求1所述的芽孢杆菌培养液的冻干粉末。
3.如权利要求2所述的产品，其中所述冻干粉末是用所述芽孢杆菌浓度为108～109cfu/mL的高盐无机培养液冻干而成；优选地将所述芽孢杆菌接种至高盐无机盐培养基中，在25～40℃振荡培养12～36小时，然后将所得培养液冻干。
4.如权利要求3所述的产品，其中所述高盐无机培养液中的盐浓度为30～80g/L，优选为40～60g/L，优选所述盐为NaCl。
5.如权利要求1所述的芽孢杆菌或如权利要求2～3中任一项所述的产品在高盐废水处理中的应用。
6.一种高盐废水处理方法，包括以下步骤：在高盐废水中投入权利要求1所述的芽孢杆菌或如权利要求2～3中任一项所述的产品，并发酵一段时间。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述高盐废水的含盐量由NaCl提供为5g/L以上，优选为10～30g/L，pH值为6.0～8.0，优选为7.0～8.0。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中发酵温度为10℃～40℃，优选为20℃～35℃。
9.如权利要求8所述的方法，其中发酵时间为80～100小时。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述芽孢杆菌或所示产品的投入量为使高盐废水中初始菌含量为104～105cfu/mL。
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