CN102965294B - 一种粪产碱杆菌及其制备脱硫除臭剂的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一株粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)菌株M50-B1，其保藏编号为CGMCC 5219。本发明还提供了该菌在生物脱硫除臭剂中的应用。将该菌制成液体菌剂和固体菌剂，在氧化硫化氢的过程中，不产酸，同时弱酸性菌液在喷洒过程中能够吸收空气中的氨，起到了很好的除臭作用，固型菌剂中的活性炭弥补了生物除臭延期性的缺点，并节约了除臭成本。本发明提供的粪产碱杆菌及利用其制备的生物脱硫除臭剂，除臭效果好，制备方法简单、成本低廉，不造成二次污染，适合于在生活垃圾及畜禽生产的除臭中推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵领域，具体地，涉及一种粪产碱杆菌及其在环境除臭中的应用。
背景技术
禽畜粪便及生活垃圾中存在大量的致臭微生物，能够降解含硫有机物尤其是蛋白质，从而释放硫化氢，产生恶臭。随着农村规模化、集约化畜牧业的发展，畜禽生产中产生的硫化氢对环境的污染不断加剧。硫化氢作为臭气主要成分之一，能刺激人的嗅觉神经和三叉神经，对呼吸中枢产生毒害，不但对人类的健康造成极大的威胁，导致大气污染，而且也严重地影响着家畜(禽)的健康和生产性能的发挥，因此畜牧场臭气中的硫化氢污染愈来愈引起人们的重视。其次随着生活垃圾开始集中收集填埋，在垃圾的集中、运输、中转、压缩、填埋等过程中，发酵产生的硫化氢不可避免的污染着大气环境，也对人们的健康造成威胁。
针对以上现象，需要能够快速去除硫化氢、适用于多种设施且成本低廉的除臭方法。目前常用的硫化氢的去除方法主要有：物理法、化学法和生物法三种。
物理吸附剂能够短时间的吸附臭气，但不能改变臭气的组成，而且饱和后对臭气的去除率迅速降低；化学法虽然除臭时间短，杀菌能力强，但是易对环境造成二次污染；而生物除臭法，具有处理效率高、无二次污染、所需设备简单便于操作、费用低廉和管理维护方便的特点，成为许多国家研究和应用的热点。
生物除臭中，现有的技术中常应用自养硫氧化菌进行硫化氢的去除，其缺点是菌株代谢时间长，生长慢，不易获得高密度菌体，现有 的异养硫氧化菌需要定期添加营养物质，增加了除臭反应的成本。再者，自养硫氧化菌在氧化硫化氢的同时产生硫酸，一方面抑制了硫氧化菌活性，大量产酸还会导致菌体自溶；另一方面需要加入碱进行中和，增加了处理的成本。因此迫切需要一种高效低毒、无二次污染，成本低、除臭效果迅速持久的除臭方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种粪产碱杆菌及其制备脱硫除臭剂的方法和应用，以克服上述现有技术存在的不足。
本发明提供的菌株为粪产碱杆菌菌株M50-B1，该菌株于2011年9月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)保藏编号为CGMCC No.5219。
粪产碱杆菌M50-B1，菌体形态杆状(图1)，直径0.5μm-1.0μm，长0.5μm-2μm，革兰氏阴性(图2)，好氧，可在硝酸盐存在情况下进行厌氧呼吸，有反硝化作用，最适生长温度为28℃，氧化酶与接触酶阴性，柠檬酸盐反应阳性，V.P.实验阳性，不产生吲哚，可在自养条件下好氧生长，也具备氧化硫化氢的作用。
本发明提供了上述菌株在环境除臭中的应用。
本发明提供了一种含有粪产碱杆菌M50-B1的脱硫除臭剂。
本发明提供了上述脱硫除臭剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将粪产碱杆菌M50-B1的种子液接种至新鲜灭菌的异养硫氧化液体细菌培养基中，28-30℃发酵培养，期间定期测定菌浊度，至600nm处吸光度达到20时，停止发酵，得到液体脱硫除臭剂；或
(2)将粪产碱杆菌M50-B1的种子液接种至新鲜灭菌的异养硫氧化液体细菌培养基中，28-30℃发酵培养，期间定期测定菌浊度，至600nm处吸光度达到20时，停止发酵，将得到的发酵液与颗粒活性炭按1∶1(V∶V)混合均匀后，将吸附菌体的活性炭载体于40℃干 燥至含水率60％，得到固型脱硫除臭剂。
上述步骤(1)、(2)种子液的浓度为107CFU/mL，添加体积百分数为2％-5％。
上述颗粒活性炭其粒径为0.85-2mm。
异养硫氧化液体细菌培养基配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨15.0g，酵母膏3.0g，Na2HPO4·12H2O 2.0g，NaCl 3.0g，Na2S2O3·5H2O 8.0g，蒸馏水1L，1mol/L盐酸调pH至7.0，121℃，灭菌20min。
异养硫氧化固体细菌培养基配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨15.0g，酵母膏3.0g，Na2HPO4·12H2O 2.0g，NaCl 3.0g，Na2S2O3·5H2O 8.0g，蒸馏水1L，1mol/L盐酸调pH至7.0，121℃，加琼脂1.5％-2％，灭菌20min。
本发明提供了该脱硫除臭剂的使用方法，将液体脱硫除臭剂按粪便或垃圾量的1％(V/V)量进行喷施，要求菌液均匀覆盖垃圾表面，每天一次连续喷施3天，或，将固体脱硫除臭剂按垃圾或粪便量的2％(V/V)均匀撒布至垃圾表面。
本发明提供的脱硫除臭剂可以用于畜禽养殖场、生物滤池、生物滴滤塔和/或生活垃圾处理场的除臭应用。
本微生物脱硫除臭剂在常温下，液体形态有效期约为2个月，固体形态菌剂有效期为3个月以上。
本发明提供一种硫氧化菌发酵液，包含高效的硫氧化菌，能将硫化氢氧化形成硫的多聚物，不产生硫酸，没有二次污染，粪产碱杆菌M50-B1均可以在环境中快速增殖，在去除硫化氢的同时占据一定的生态位，从而减少了臭气的生成，从而根本的解决臭气问题。另一方面弱酸性菌液在喷洒的过程中能够吸收空气中的氨，从而还有一定的除氨作用。固型菌剂中的活性炭能够起到吸附臭气物质的作用，且可以在较短的时间内发生作用，从而弥补了生物除臭有一定延迟期的缺点。本发明的微生物脱硫除臭菌剂，具有制备简单，除臭迅速、效果 持久、没有二次污染的特点。
附图说明
图1是粪产碱杆菌M50-B1菌株的电子显微镜照片；
图2是粪产碱杆菌M50-B1菌株革兰氏染色光学显微镜照片；
图3是异养条件下粪产碱杆菌M50-B1的生长及硫氧化效率图；
图4是自养条件下粪产碱杆菌M50-B1的生长及硫氧化效率图；
图5是使用脱硫除臭剂后养殖场硫化氢变化曲线图；
图6是液体菌剂储藏除臭有效期实验图；
图7是固体菌剂储藏除臭有效期实验图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
异养硫氧化细菌液体培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨15.0g，酵母膏3.0g，Na2HPO4 12H2O 2.0g，NaCl 3.0g，Na2S2O3 5H2O 8.0g，蒸馏水1L，1mol/L盐酸调pH至7.0，121℃，灭菌20min。
异养硫氧化细菌固体培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨15.0g，酵母膏3.0g，Na2HPO4 12H2O 2.0g，NaCl 3.0g，Na2S2O3 5H2O 8.0g，蒸馏水1L，1mol/L盐酸调pH至7.0，121℃，加琼脂1.5％-2％，灭菌20min。
硫氧化细菌富集培养基：牛肉膏1.5g，蛋白胨10.0g，酵母膏1.0g，Na2HPO4 12H2O 2.0g，NaCl 3.0g，Na2S2O3·5H2O 8.0g，自然pH，121℃，灭菌20min。
颗粒活性炭：粗产品活性炭，购自北京化学试剂公司，经10目-20目筛分过滤获得，粒径在0.85-2mm之间。
实施例1 粪产碱杆菌M50-B1菌株的分离及鉴定
1、菌株的分离
分离源来自于堆肥生物滤池表层木屑，将样品按5％(V/V)接种量接入100ml异养硫氧化细菌筛选培养基中，放入恒温摇床中培养，控制温度30℃，120r/min，定期(7天)转接至新鲜培养基中继续富集。对经过21天驯化，对连续传代3次后的样品进行硫氧化效率测定，得出其中代谢效率达到90％以上。将获得的富集培养液梯度稀释后涂布到异养硫氧化细菌培养基固体平板上，在30℃培养7天，挑取单菌落并进行划线分离纯化后获得该菌株，编号为M50-B1。
2、菌株的鉴定
分子生物学鉴定：应用细菌基因组提取试剂盒(天根公司)提取M50-B1菌株的DNA，采用细菌16S rDNA序列通用引物27F-1492R扩增，获得的1400bp 16S rDNA片段经过Blastn软件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)比对，与已知的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)其他菌株相似性为100％。
生理生化鉴定：采用API 20NE(Biomerieux)试剂盒进行鉴定，鉴定结果见表1：
表1 分离菌株M50-B1的生化鉴定结果
| 试剂或特征 | 结果 |
| β-半乳糖苷酶 | - |
| 精氨酸双水解酶 | - |
| 赖氨酸脱羧酶 | - |
| 鸟氨酸脱羧 | - |
| 柠檬酸利用 | + |
| 硫化氢产生 | - |
| 脲酶 | - |
| 色氨酸脱氨酶 | - |
| 吲哚实验 | - |
| V.P.实验 | + |
| 明胶酶 | - |
| 葡萄糖 | - |
| 甘露醇 | - |
| 肌醇 | - |
| 山梨醇 | - |
| 鼠李糖 | - |
| 蔗糖 | - |
| 蜜二糖 | - |
| 苦杏仁苷 | - |
| 阿拉伯糖 | - |
| 细胞色素氧化酶 | - |
| 硝酸盐还原 | + |
补充碳源醋酸盐、戊酸盐利用实验，结果为阳性，生理及生化实验M50-B1与粪产碱杆菌特征相符。
综合分子生物学鉴定和生理生化鉴定结果，确定M50-B1菌株为粪产碱杆菌新分离株。
菌株M50-B1于2011年9月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)保藏编号为CGMCC No.5219。
实施例2 液体脱硫除臭剂的制备和使用
(1)无菌条件下，挑取-80℃低温保存于甘油管的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)M50-B1菌株1-2环，在新鲜的异养硫氧化细菌固体培养基平板上划线，28℃培养3天。
(2)挑取一环(1)培养物至在150ml异养硫氧化液体细菌培养基中28℃摇床振荡培养，培养26小时，得到种子液。在7L小型发酵罐中加入5L水，并加入牛肉膏15g，蛋白胨45g，酵母膏15g， Na2HPO4·12H2O 10g，NaCl 15g，1mol/L盐酸调pH至7.0，121℃，灭菌20min。培养基温度降至28℃时，将种子液按照2％的体积比接种于发酵罐内，温度28℃、通气量5L/分钟、搅拌转速150-200r/min，加入2.5mL泡敌(进口分装，购自江西省利康科技有限公司)作为消泡剂，每两小时取样一次，测600nm下的吸光度，至600nm处吸光度达到20时，停止发酵，发酵液即为脱硫除臭剂的液体菌剂。
液体脱硫除臭剂的使用方法
将制备的脱硫除臭剂菌液按粪便或垃圾量的1％(V/V)量进行喷施，要求菌液均匀覆盖垃圾表面，每天一次，连续喷施3天，除臭效果可持续一个星期。
实施例3 固体脱硫除臭剂的制备和使用
(1)菌种活化：无菌条件下，挑取-80℃低温保存于甘油管的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)M50-B1菌株1-2环，在新鲜的异养硫氧化细菌固体培养基平板上划线，30℃培养2天。
(2)挑取一环(1)培养物至在50-150mL异养硫氧化液体细菌培养基中30℃摇床培养，培养25小时，得到种子液。
(3)将上述种子液，按5％的体积比，接种至含有新鲜灭菌的异养硫氧化液体细菌培养基的发酵罐中，28℃发酵培养，罐压0.05Mpa、通气量80L/min、搅拌转速150r/min，加入40mL泡敌作为消泡剂，每两小时取样一次，稀释后测600nm下的吸光度，至600nm处吸光度达到20时，停止发酵。
(4)将(3)中得到的菌液与颗粒活性炭按1∶1(V∶V)混合均匀后，将吸附菌体的活性炭载体于40℃干燥至含水率60％即为本脱硫除臭固型菌剂。
固体脱硫除臭剂的使用方法
按垃圾或粪便量的2％(V/V)均匀撒布至垃圾表面即可。该固 型菌剂还可以用于生物除臭滤池、生物滴滤塔快速启动，并且不用定期添加营养物质。
实施例4 粪产碱杆菌M50-B1的异养和自养条件下硫氧化特性实验
1 材料和方法
异养硫氧化细菌培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨15.0g，酵母膏3.0g，Na2HPO4·12H2O 2.0g，NaCl 3.0g，Na2S2O3·5H2O 8.0g，蒸馏水1L，1mol/L盐酸调pH至7.0，121℃，灭菌20min。
自养硫氧化细菌培养基：Na2S2O3·5H2O 8.0g，K2HPO4 2g，MgCl2·6H2O 0.2g，KH2PO4 2g，NH4Cl 0.4g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1L，1mol/L盐酸调pH至7.0，121℃，灭菌20min。
菌种活化：挑取-80℃保存的甘油管菌株一环，于新鲜的异养硫氧化固体培养基平板上划线，28℃培养2天，再各挑取一环至5mL灭菌异养硫氧化液体培养基，28℃，200r/min培养24小时。
接种：将活化的菌液按2％比例接种至100mL灭菌异养(或自养)硫氧化液体培养基中，28℃，200r/min培养24小时。每24小时取样一次，取1mL样品与-20℃冷冻保存，至实验结束后测S2-浓度，并计算硫氧化效率。
S2-浓度检测方法：碘量法(参见《水和废水监测分析方法》第四版)。
2 实验结果与分析
异养条件下粪产碱杆菌M50-B1的生长及硫氧化效率测试结果见图3。由图3可以看出，异养培养条件下M50-B1对硫的代谢效率与其菌体生长状况呈正相关，初始S2-浓度达到1620mg/L时，其4天代谢能力达到80％，7天氧化硫的量达到1414.26mg/L。而在畜禽粪便和生活垃圾中硫的量一般不超过500mg/L，该菌株能够满足畜禽粪便和生活垃圾生物除臭的技术要求。
自养条件下粪产碱杆菌M50-B1硫氧化效率见图4。自养条件下，该菌具有更佳的硫氧化代谢效率，如图4所示，72小时硫氧化效率达到了87％，3天内代谢效率就达到了80％，所以自养条件下有着较异养条件下更高的硫氧化效率，而生长阶段pH值始终保持在6.4以上，无需添加碱来调节pH，更适用于生物滤池、生物滴滤塔等寡营养的环境。
实施例5 微生物脱硫除臭剂固型载体筛选实验
1 材料和方法
实验载体种类：活性炭、硅藻土和碎干树叶，每种载体与混合菌液的吸附比例为：1∶1(V∶V)。除臭原料为新鲜猪粪500g，密闭至塑料盒中，接种量为1％(V/V)，阳性对照为喷施本发明的液体脱硫除臭剂，阴性对照不做处理。每天定时用硫化氢检测管检测硫化氢含量，实验周期为7天，对比各个处理的硫化氢去除特征。
2 结果与分析
结果见表2。实验表明，活性炭作为菌剂载体处理效果最佳，其他载体作为除臭菌剂载体如硅藻土反而消弱了菌液本身的除臭作用，液体除臭剂直接喷施作用与活性炭为载体的固型除臭剂相当，只是前期硫化氢含量相对较高，分析原因可能是缺少了活性炭对气体的吸附作用。
表2 不同载体类型菌剂处理猪粪7天后硫化氢浓度对比
实施例6 脱硫除臭菌剂在养猪场的除臭应用效果实验
1 实验场地：试验在通州区西集镇尹河村某养猪场，猪场面积为200m3，存栏数约为100头，猪粪日产量约为0.8m3。
2 实验方法：取实施例2制得的液体脱硫除臭剂，喷施量为1％(V/V)，实验前3天每天清完粪，喷洒菌液约12L，后4天不做喷洒。每天利用大气采样器，以0.5L/min的速率，采样1小时，采集样品立即冷冻保存，至实验结束后统一按亚甲基蓝分光光度法(GB/T16489)法检测。
3 结果与分析：在中试生物除臭实验中，在200m3的猪舍中，均匀布设四个采样点，由于通风程度不同，所以内部试验点(内一、内二)和外部试验点(外一、外二)的硫化氢初始浓度有差别，经过连续喷施3天复合微生物除臭剂，较高浓度的内一采样点空气中氨含量从0.062mg/m3降到0.0058mg/m3，硫化氢去除效率约91％，浓度较低的另外三个采样点，硫化氢的去除效率均达到90％，硫化氢变化曲线见图5。
实施例7 除臭菌剂有效期实验
1、材料与方法 取液体和固体两种除臭剂，常温放置，每15天取样一次，进行除臭效果实验，具体方法如下：除臭原料为500克猪粪，密闭放置，密闭至塑料盒中，接种量为1％(V/V)，阴性对照 不做处理。7天后用硫化氢检测管检测硫化氢含量，并计算去除率。
2、结果与分析：结果表明，在整个实验过程中，液体菌剂的有效除臭保质期是60天即2个月左右(图6)，而固体菌剂的有效除臭保质期在90天3个月左右(图7)。
Claims (10)
1.粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）菌株M50-B1，其保藏号为CGMCC No.5219。
2.一种脱硫除臭剂，其特征在于，含有权利要求1所述的菌株。
3.一种权利要求2所述的脱硫除臭剂的制备方法，其特征在于，该方法包括如下：
（1）将权利要求1所述的菌株菌种在异养硫氧化固体培养基中活化后接种于异养硫氧化液体细菌培养基中，制备种子液；将种子液接种至新鲜灭菌的异养硫氧化液体细菌培养基中，28-30℃发酵培养，期间定期测定菌浊度，至600nm处吸光度达到20时，停止发酵，得到液体脱硫除臭剂；或
（2）将权利要求1所述的菌株菌种在异养硫氧化固体培养基中活化后接种于异养硫氧化液体细菌培养基中，制备种子液；将种子液接种至新鲜灭菌的异养硫氧化液体细菌培养基中，28-30℃发酵培养，期间定期测定菌浊度，至600nm处吸光度达到20时，停止发酵，将得到的发酵液与颗粒活性炭按1：1（V:V）混合均匀后，将吸附菌体的活性炭载体于40℃干燥至含水率60%，得到固型脱硫除臭剂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的异养硫氧化液体细菌培养基配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨15.0g，酵母膏3.0g，Na2HPO4·12H2O 2.0g，NaCl 3.0g，Na2S2O3·5H2O 8.0g，蒸馏水1L，1mol/L盐酸调pH至7.0，121℃，灭菌20min。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的异养硫氧化固体细菌培养基配方为：牛肉膏3.0g，蛋白胨15.0g，酵母膏3.0g，Na2HPO4·12H2O 2.0g，NaCl 3.0g，Na2S2O3·5H2O 8.0g，蒸馏水1L，1mol/L盐酸调pH至7.0，121℃，加琼脂1.5%-2%，灭菌20min。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的方法（1）、（2）种子液的浓度为107CFU/mL，接种体积百分数为2%-5%。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的颗粒活性炭粒径为0.85-2mm。
8.权利要求2所述的脱硫除臭剂的使用方法，其特征在于，将液体脱硫除臭剂按粪便或垃圾量的1%（V/V）量进行喷施，要求菌液均匀覆盖垃圾表面，每天一次连续喷施3天，或，将固体脱硫除臭剂按垃圾或粪便量的2%（V/V）均匀撒布至垃圾表面。
9.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的脱氧除臭剂在环境除臭中的应用。
10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的环境是畜禽养殖场、生物滤池、生物滴滤塔和/或生活垃圾处理场。
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| GR01 | Patent grant |