CN110184213B - 水生产碱菌df-27菌株及其应用 - Google Patents

水生产碱菌df-27菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种水生产碱菌DF‑27菌株。该菌株从槽式堆肥中筛选得到，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2018年7月25日，保藏编号CGMCC No.16149。该菌株经常规的活化培养与扩大发酵培养可应用于生物除臭与除味，去除含氮化合物类恶臭物质与甲酸和/或乙酸和/或丙酸类挥发酸物质。该菌株还可应用于粪便堆肥的生物除臭除味。能够实现对单一或混合种类的畜禽粪便原位除臭除味。该菌株除臭除味启动快、效果优良，铵态氮去除率达到99％以上，三种挥发酸物质浓度总体去除率96.46％。该菌株从被氨气、硫化氢、挥发酸等物质长期胁迫的环境样品中筛选得到，符合生态安全法规。

Description

水生产碱菌DF-27菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种水生产碱菌，特别是涉及一种能够应用于生物除臭除味的水生产碱菌，属于工业微生物技术领域。
背景技术
恶臭是世界上七大环境公害之一，是由于恶臭物质在厌氧条件下的复杂还原性反应释放出臭味气体而对环境产生的危害。恶臭物质根据其组成可分为含氮化合物、含硫化合物、含氧组成的化合物、烃类物质、卤素及其衍生物五大类。不良挥发气体对环境的污染是由除已划定为恶臭物质的某些挥发性化合物释放气体分子到环境中，使人体产生的不适与厌恶感。虽然不良挥发气体对环境的污染虽然未列入环境公害，大部分人群对不良挥发气体产生的不适与厌恶程度不及恶臭污染，但气体分子依然存在刺激人体神经系统的问题。并且，由于个体差异的存在，部分人群对不良挥发气体产生的不适与厌恶感可能并不低于恶臭物质。
生物除臭/除味技术生物除臭技术是利用微生物的生化营养代谢过程破坏恶臭物质或其它挥发性物质在厌氧条件下的还原反应，并将恶臭物质或其它挥发性物质分解转化为无臭味的化合物。生物除臭/除味一般是利用在固体介质或填料上固定的微生物吸附分解恶臭物质，包括生物滤池法、生物滴滤塔法、生物滤膜法、活性污泥法等，通常是在常温常压下进行，运行时仅需要消耗使恶臭物质或其它挥发性物质与微生物相接触的动力费用和少量的调整营养环境的药剂费用。生物除臭/除味技术因其不良气体去除率高、生产维护成本低、二次污染少、工艺能耗低等特征成为环境治理领域中公认的理想技术，具有广阔的应用前景。
无论何种生物除臭/除味技术，其关键是有针对性降解恶臭物质或其它挥发性物质的微生物菌株。目前应用于生物除臭/除味的微生物种类各异，各有不同的应用范围。以含氮化合物恶臭气体的生物除臭技术为例：含氮化合物恶臭气体的去除对象主要是NH3。传统生物脱氮理论包括硝化作用和反硝化作用两个过程，即：①铵态氮首先在化能自养菌亚硝化细菌，如亚硝化单胞菌属(Nitrosobacteria)作用下氧化为亚硝酸；亚硝酸由化能自养生菌硝酸化细菌，如硝化杆菌属(Nitrobacter)作用下氧化为硝酸。②亚硝酸在厌氧反硝化细菌，如地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)、脱氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)和若干假单胞菌属(Pseudomonas)作用下转化为气态氮化物N2和N2O。现今，伴随异养硝化细菌，如假单胞菌属、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)等和好氧反硝化细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等的发现，使得进行两类型反应的细菌在同一反应体系内同时高效生存成为可能，同时，众多异养硝化细菌同时具有好氧反硝化作用，如脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans GB17)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)等。
水生产碱菌(Alcaligenes aquatilis)是产碱菌属(Alcaligenes)的一类。现有技术尚未发现其在生物除臭/除味技术领域中的工业用途。
发明内容
本发明的目的就是提供一种水生产碱菌菌株。该菌株具有除臭/除味功能的工业用途。
为实现上述目的，本发明首先提供一种水生产碱菌菌株，其技术方案如下：
一种水生产碱菌(Alcaligenes aquatilis)DF-27菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2018年07月25日，保藏编号CGMCC No.16149。
水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149是自四川中农润泽生物科技有限公司槽式堆肥中筛选得到。筛选过程为：将15g堆肥样品加入250ml富集驯化培养基中，在30℃、180r/min条件下富集驯化4d；再以10％的接种量接种于好氧硝化富集培养基进行第二次富集驯化，时间4d；4d后以与第二次富集化相同的条件、时间进行第三次富集驯化。3次富集驯化后，取驯化液利用分离培养基进行平板涂布分离，1d～2d后在平板上形成单菌落，挑取单菌落在分离培养基平板进行划线分离，重复3次以上分离获得纯菌株。该菌株命名为DF-27。
菌株DF-27在显微镜下观察可见，菌落颜色为淡黄色，单菌落表面湿润光滑，中央凸起，小圆形，边缘整齐。革兰氏染色为阴性，菌株细胞形态为杆状。菌株生理特点为：该菌最适pH为7.0，在20℃～35℃均能快速生长，最适温度35℃。该菌营养类型为异养营养型，能利用牛肉膏、蛋白胨等有机碳源进行异养快速生长。提取上述菌株的16SrDNA进行基因测序，将上述菌株的16SrDNA基因序列(如SEQ ID NO.1)在BLAST平台进行比对，DF-27与水生产碱菌属的同源性达到了99.4％，因此初步鉴定上述菌株为一种水生产碱菌，命名为水生产碱菌DF-27(Alcaligenes aquatilis DF-27)。
本发明实验数据证明，水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149能够降解培养基中的含氮化合物类恶臭物质。在实验室条件下经24h～132h培养，培养基中铵态氮转化率达99.1％以上。水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149还能够去除培养基中的挥发酸。在实验室条件下经48h培养，培养基中甲酸、乙酸、丙酸分别降低97.56％、99.31％、92.53％。据此，本发明还提供水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149用途类技术方案，具体如下：
水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149在生物除臭和/或除味中的应用。
水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149在畜禽粪便堆肥除臭/除味中的应用。畜禽粪便具体可以是鸡粪、猪粪、牛粪等畜禽粪便单一或混合粪便。
本发明提供的水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149可以进一步依照常规加工工艺加工成除臭产品，其技术方案如下：
以水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149为除臭/除味效用成分的除臭产品。上述产品以加工成除臭菌剂为例，可以麸皮为填充剂，将水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149菌株在扩大发酵液体培养基中适宜条件下培养制得液体除臭菌剂，再将液体除臭菌剂与灭菌麸皮按质量比1:1(W/W)混合后，在恒温箱中烘干至控制水分，即为固体除臭菌剂。除臭菌剂又可进一步加工包装成多类除臭产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)提供了新的水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149，该菌株具有去除含氮化合物类恶臭物质与去除挥发酸的生物除臭/除味用途。(2)水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149营养类型为异养营养型，在异养条件下实现菌体的快速繁殖，15h～20h即结束对数生长期，达到稳定期，实现高效除臭。菌株也可利用异养条件快速获得高密度菌体，从而实现生物除臭工程的快速启动。(3)水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149除臭/除味效率高，铵态氮去除率达到99％以上、甚至达100％，甲酸、乙酸、丙酸的去除率均能够达到92％以上，三种组分浓度总体下降96.46％。(4)仅须单一菌株即可应用于生物除臭/除味，具有使用方便，包装、运输便利，易形成商品化的明显的技术优势；(5)水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149是从被氨气、硫化氢、挥发酸等物质长期胁迫的环境样品中筛选得到，对周围环境不具有生态入侵威胁，符合生物安全法规。
附图说明
图1是水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149在不同温度下的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述。
实施例一
菌株筛选与鉴定。
1、菌株筛选
1.1样品与培养基
样品：从四川中农润泽生物科技有限公司的好氧堆肥槽中选取5个采样点(采样点涵盖堆肥的升温阶段、高温阶段、降温阶段)，利用采样器从各采样点分别采集500g堆肥物料，然后将5个点采集的堆肥物料进行混匀，混匀后再从中采集500g作为样品备用。该好氧堆肥原料包括鸡粪、猪粪、污泥、木屑、菌渣等多种原料。
富集驯化培养基：(NH4)2SO4 4.5g，丁二酸钠12.35g，葡萄糖4.5g，乙酸钠4.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，NaCl 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4 0.005g，加水至1000ml，pH7.0。121℃，20min高温蒸汽灭菌。
好氧硝化富集培养基：(NH4)2SO4 5g，MgSO4·7H2O 0.1g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，K2HPO4 0.5g，MnSO4 0.005g，CaCO3 5g，加水至1000ml，pH 7.2。121℃，20min高温蒸汽灭菌。
分离培养基：(NH4)2SO4 2.5g，丁二酸钠8.5g，葡萄糖2.5g，乙酸钠2.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，NaCl 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4 0.005g，琼脂粉18g，加水至1000ml，pH 7.0。121℃，20min高温蒸汽灭菌。
1.2分离纯化菌株
将15g样品加入250ml富集驯化培养基中，在30℃、180r/min条件下富集驯化培养4d；将富集液以10％(V/V)的接种量接种于好氧硝化富集培养基，进行第二次富集驯化培养；培养4d后，转接并以与第二次富集驯化培养相同的条件、时间进行第三次富集驯化培养；第三次富集驯化后取驯化液1ml进行10倍梯度稀释，然后从各稀释梯度下分别吸取0.1mL稀释后的菌液，于分离培养基平板上进行涂布分离，从平板上形成单菌落中挑取适宜的单菌落，重新稀释涂布，重复3次以上获得纯菌。
2、菌株鉴定
2.1菌株形态、生长特征及16SrDNA序列分析
取上述菌株在光学显微镜下观察，菌株呈杆状，较小。菌落颜色为淡黄色，单菌落表面湿润光滑，中央凸起，小圆形，边缘整齐。革兰氏染色为阴性。将菌株接种于96孔板中，放置于全自动生长曲线测试仪中，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下进行中速振荡培养，由仪器自动测定菌株在不同时间下的OD值，根据上述菌株不同温度下的生长曲线图(如图1所示)确定上述菌株生长温度范围为20℃～35℃，最适生长温度为35℃。
采用细菌全基因组快速抽提试剂盒提取上述纯菌株的全基因组，以通用引物17F/1429R进行16S rDNA序列扩增，扩增的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳和紫外光分光光度计检测浓度与纯度合格后进行测序分析。测序结果在NCBI上进行BLAST比对，获知与水生产碱菌(Alcaligenes aquatilis)的序列同源性高达99.4％以上，确定上述纯菌株的分类学地位。
2.2确定纯化菌株的种名
综合纯化菌株形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析(如SEQ ID NO.1)，确定该纯化菌株为水生产碱菌(Alcaligenes aquatilis)，命名为水生产碱菌(Alcaligenesaquatilis)DF-27。
上述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌保中心，邮编100101；保藏日期2018年07月24日，保藏编号CGMCC No.16149。
实施例二
本发明水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149应用于含氮类恶臭物质去除。
1、培养基
生长与保存培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，H2O 1000ml，pH 7.0。121℃，20min高温蒸汽灭菌。
高浓度铵离子培养基：(NH4)2SO4 3.8g，丁二酸钠13.5g，葡萄糖6.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，NaCl 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4 0.005g，加水至1000ml，pH7.0。以每150ml分装至250ml三角瓶中，121℃，20min高温蒸汽灭菌。
低浓度铵离子培养基：(NH4)2SO4 0.5g，丁二酸钠5.4g，葡萄糖1.6g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，NaCl 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4 0.005g，加水至1000ml，pH7.0。以每150ml分装至250ml三角瓶中，121℃，20min高温蒸汽灭菌。
2、实验方法
将实施例一所得菌株接种于装有5ml生长与保存培养基的试管中，好氧条件35℃下培养1d。观察菌液生长好，得活化菌液。
分别将菌液以接种量1％(V/V)接种至高浓度铵离子培养基、低浓度氨离子培养基中(250ml三角瓶)。接种操作完毕立即从接有菌液的三角瓶中取样测定液体中的铵态氮、硝态氮、亚硝态氮、总氮含量。20℃～35℃条件下培养。每24h取样测定一次高铵离子浓度培养液中氮含量，每12h取样测定一次低氨离子浓度培养液中氮含量。直至各三角瓶中铵离子浓度很低时停止测定。每个实验组设三个平行。
对照组(CK)分别向高浓度铵离子培养基三角瓶、低浓度铵离子培养基三角瓶中加入等量无菌水，同样培养测定操作。
3、实验结果
接种量本发明菌株的高、低浓度铵离子培养液中各种形态的氮的浓度变化见表1。从表1可知，在高浓度氨离子培养液，培养5.5d时铵离子转化率达99.1％，日转化氨离子143mg/L。总氮损失率约9.8％；在低浓度铵离子培养液，12h铵离子转化率达85.1％，24h时氨离子浓度降到检测下限，转化率达100％，总氮损失率约8.1％。
表1各形态N素浓度随时间变化表(mg/L，以N计)
Figure BDA0002054958890000091
实施例三
本发明水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149应用于挥发酸去除。
1、培养基
生长与保存培养基同实施例二。
挥发酸去除实验培养基：甲酸1.5ml，乙酸1.5ml，丙酸1.5ml，葡萄糖1.5g，(NH4)2SO4 1.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，NaCl 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，MnSO4 0.005g，加水至1000ml，pH7.0。以每150ml分装至250ml三角瓶中，121℃，20min高温蒸汽灭菌。
2、实验方法
将实施例一所得菌株接种于装有5ml生长与保存培养基的试管中，好氧条件35℃下培养1d。观察菌液生长好，得活化菌液。
实验组：将活化菌液以接种量1％(V/V)接种至挥发酸去除实验培养基(250ml三角瓶)。接种操作完毕立即取样测定液体中的甲酸、乙酸、丙酸含量。20℃～35℃条件下培养。每8h取样测定一次挥发酸的含量。实验设三个平行。
对照组(CK)向挥发酸去除实验培养基三角瓶中加入等量无菌水，同样培养测定操作。
3、实验结果
接种了本发明菌株的挥发酸去除实验培养基中各种挥发酸的浓度变化见表2。从表2可知，甲酸、乙酸、丙酸的浓度都随时间的延长而逐渐下降；但下降快慢有所区别，其中乙酸下降最快；48h下降率分别为97.56％、99.31％、92.53％，三种组分浓度总体下降96.46％。对照组培养基中各中挥发酸的初始浓度和最终浓度见表3。
表2实验组挥发酸浓度随时间变化表(mg/L)
时间/h 0 8 16 24 32 40 48
甲酸 1481.3 1267.4 1022.5 778.3 531.4 284.6 36.1
乙酸 1486.7 1245.2 995.4 751.6 501.5 254.1 10.3
丙酸 1490.1 1305.8 1068.2 836.1 601.3 362.7 111.3
总计 4458.1 3826.4 3102.1 2390 1666.2 941.4 205.7
表3对照组挥发酸浓度(mg/L)
时间/h 0 24 48
甲酸 1495.2 1492.1 1490.3
乙酸 1490.8 1489.3 1488.5
丙酸 1494.1 1493.6 1493.1
总计 4480.1 4475.0 4471.9
实施例四
本发明水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149应用于鸡粪、猪粪好氧堆肥中减少氨气和挥发酸产生量。
1、培养基
生长与保存培养基同实施例二。
2、实验方法
将实施例一所得菌株接种于装有5ml生长与保存培养基的试管中，好氧条件35℃下培养1d。观察菌液生长好后，将菌液接种于含250ml生长与保存培养基的三角瓶中，好氧条件35℃下培养1d，待菌液生长好得扩培活化菌液。
设置三组不同的堆肥原料组合进行实验：第一组堆肥原料为鸡粪与木屑，二者体积比为3：1；第二组堆肥原料为猪粪与秸秆粉，二者体积比为3：1；第三组堆肥原料包括鸡粪、猪粪、菌渣、米糠，体积比为3：3：1：1。各组均将各种原料混合均匀，按照1m3堆肥原料喷洒200ml扩培活化菌液的比例使水生产碱菌DF-27菌株与堆肥原料均匀混合。每组堆肥总体积约20m3，堆体底部铺设有多空塑料管道，采用涡轮增压风机向堆体输送氧气进行好氧发酵。每一组堆肥实验均设置对照组(CK)，其中不添加菌液。
使用复合式高精度气体分析仪(型号PGD5-C-M5)在不同的堆肥发酵时间测定堆体内气体中氨气、TVOC(Volatile Organic Compound)的浓度。
3、实验结果
接种了本发明菌株的好氧堆肥堆体内氨气浓度变化见表4。从表4可知，接种了本发明菌株的好氧堆肥堆体内的氨气浓度明显低于对照组。
表4不同好氧堆肥堆体内氨气浓度随时间变化表(ppm)
Figure BDA0002054958890000121
接种了本发明菌株的好氧堆肥堆体内TVOC氨气浓度变化见表5，从表5可知，接种了本发明菌株的好氧堆肥堆体内的TVOC浓度明显低于对照组。
表5不同好氧堆肥堆体内TVOC浓度随时间变化表(ppm)
Figure BDA0002054958890000122
序列表
SEQ ID NO.1
<212>DNA
<213>水生产碱菌DF-27(Alcaligenes aquatilis DF-27)
GGCAGCACGAGAGAGCTTGCTCTCTTGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATATATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTGGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGGGGGGGATTCTTCGGAACCTCTCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTCACCAAGGCAACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTATGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTTGGCAGAGAAGAAAAGGTATCTCCTAATACGAGATACTGCTGACGGTATCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGTGTAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCATTTTTAACTGCCGAGCTAGAGTATGTCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGATAATACTGACGCTCAGACACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGCCGTTAGGCCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATCCCGAAGAGATTTGGGAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCTCAGAAACCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACCG

Claims (12)

1.水生产碱菌(Alcaligenes aquatilis)DF-27菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2018年07月25日，保藏编号CGMCC No.16149。
2.权利要求1所述的水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149在生物除味中的应用。
3.权利要求1所述的水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149在生物除臭中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述生物除味是生物方法去除恶臭物质和/或挥发酸物质。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述恶臭物质是含氮化合物；所述挥发酸是甲酸和/或乙酸和/或丙酸。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述恶臭物质是含铵离子化合物。
7.根据权利要求2、4、5、6任一所述的应用，其特征在于：水生产碱菌DF-27菌株CGMCCNo.16149在生长与保存培养基中好氧条件35℃下培养1d，得活化菌液；菌液接种至待除味物质，20℃～35℃条件下培养；所述生长与保存培养基组分是牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，水1000ml，pH 7.0。
8.权利要求1所述的水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149在堆肥除味中的应用。
9.权利要求1所述的水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149在堆肥除臭中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述堆肥是畜禽粪便堆肥。
11.以水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149为除味效用成分的除味产品。
12.以水生产碱菌DF-27菌株CGMCC No.16149为除臭效用成分的除臭产品。
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