CN104068063B - 利用玉米秸秆酶解液制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用玉米秸秆酶解液制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法。该方法，包括：(1)将玉米秸秆在180-200℃和1.0-2.0Mpa条件下进行水热处理，得到经过预处理的玉米秸秆；(2)将所述经过预处理的玉米秸秆粉碎后，用纤维素酶进行酶解，分别收集酶解液和酶解残渣；（3）用所述酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基，每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20-50g；(4)向所述发酵培养基中接入牡丹抗病促生菌进行发酵，发酵结束后收集发酵液，将所述发酵液和所述酶解残渣混合，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂。
Description
技术领域
本发明涉及利用玉米秸秆酶解液制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法。背景技术
牡丹归芍药科（Paeoniaceae）、芍药属（Paeonia），一直以来都是中国最重要的观赏植物和药用植物之一，已有1600多年的历史。目前，牡丹在国内的主要栽培地点为荷泽、洛阳、北京、临夏、天彭、铜陵等。近年来，牡丹的油用价值日渐凸显，油用牡丹的发展呈现出快速扩张的态势。对于观赏牡丹来讲，一个突出的问题是，由于不同地区气候环境和土壤性质的差异造成的土壤微生态活性降低，是引种地区栽培牡丹生长状况不良、观赏性状下降的重要原因之一。而对于油用牡丹，如何科学施肥并显著提高牡丹籽的产量则是非常迫切的问题。在牡丹的栽培过程中，还面临着一些真菌病害的威胁，主要有灰霉病（Botrytispaeoniae）、红斑病（Cladosporiumaeoniae）和褐斑病（Cercosporapaeoniae）等。因此，研制促进牡丹生长并拮抗病原菌的微生物菌剂具有显著和迫切的现实意义。其中，筛选对牡丹兼具促生和拮抗病原菌功能的植物促生细菌菌种资源是限制微生物菌剂发展的重要瓶颈因素。
目前大多数菌剂的发酵都采用淀粉质原料，但我国耕地资源紧张，粮食生产压力巨大，难以支撑庞大发酵工业的可持续发展。因此，需要寻找更丰富的可再生资源作为生产原料以用于菌剂的生产。
发明内容
本发明所要解决的一个技术问题是提供一种缩短生产周期并且菌体含量达到淀粉质原料生产水平的制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法。
本发明所提供的制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法，包括：
(1)将玉米秸秆在180-200℃（如180℃或200℃）和1.0-2.0Mpa（如1.0Mpa或2.0Mpa）条件下进行水热处理，得到经过预处理的玉米秸秆；
(2)将所述经过预处理的玉米秸秆粉碎后，用纤维素酶进行酶解，分别收集酶解液和酶解残渣；
（3）用所述酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基，每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20-50g（如20g）；
(4)向所述发酵培养基中接入促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌进行发酵，发酵结束后收集发酵液，将所述发酵液和所述酶解残渣混合，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂。
上述方法中，所述（1）中，所述水热处理时间可为10-20min（如10min或20min）。
上述方法中，所述(2)可为将所述经过预处理的玉米秸秆粉碎后，按以干重计每克秸秆加入10-15FPU（纤维素酶活单位）（如15FPU）的比例加入纤维素酶，在55-80℃（如55℃）、pH为4.8-5.0的条件下在水中酶解24-48h（如48h），得到玉米秸秆酶解物，将所述玉米秸秆酶解物进行离心，分别收集上清液和沉淀，所述上清液即为所述酶解液，所述沉淀即为所述酶解残渣。
上述方法中，所述（3）中，每升所述发酵培养基中，(NH4)2SO4的含量为10g，MgSO4的含量为0.4g、CaCO3的含量为6g、玉米浆的含量为2g。
上述方法中，所述（4）中，所述发酵液和所述酶解残渣可按照1:1的质量比进行混合。
上述方法中，所述（2）中，所述粉碎是将所述经过预处理的玉米秸秆粉碎至50-100目。
上述方法中，所述促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌为多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.8527。
上述方法中，所述(4)在30℃培养18-30小时（如24-30小时）进行发酵。在本发明的一个实施方式中，在所述发酵培养基中培养14小时时补加所述酶解液，使发酵培养基中的葡萄糖含量为20g/L，继续培养16小时结束发酵；在本发明的另一个实施方式中，在所述发酵培养基中培养24小时结束发酵。
由上述方法制备的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂及该菌剂的用途也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的用途，所述用途为下述C1）-C3）中任一种：
C1）促进牡丹生长和拮抗病原菌；
C2）促进牡丹生长；
C3）拮抗病原菌。
上述用途中，所述促进牡丹生长可体现为下述B1）-B7）中的任一种：
B1）缩短牡丹种子生根时间；
B2）提高牡丹种子生根率；
B3）缩短牡丹种子的发芽时间；
B4）提高牡丹种子的发芽率；
B5）提高牡丹的主根长度；
B6）提高牡丹苗高；
B7）提高牡丹幼苗生物量；
所述拮抗病原菌可为拮抗牡丹葡萄孢菌（Botrytispaeoniae）、牡丹枝孢霉（Cladosporiumpaeoniae）和芍药杂色尾孢霉菌（CercosporavarricolorWinter）中的三种、任两种或任一种。所述提高牡丹幼苗生物量体现为提高牡丹幼苗的鲜重或干重。
本发明还提供了一种利用促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂促进牡丹生长的方法。
本发明所提供的促进牡丹生长的方法，包括在生根前将浸种后的牡丹种子用所述促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂处理1-3小时（如1小时）再进行生根培养的步骤。
上述方法中，将浸种后的牡丹种子用所述菌剂处理的方式因所述菌剂的物理状态而异，如果所述菌剂为液态，直接用所述菌剂浸泡所述浸种后的牡丹种子即可，所述菌剂中的所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101的含量可为108cfu/ml-109cfu/ml（如109cfu/ml）；如果所述菌剂为固态，需要向所述菌剂中加水制成液体菌剂，再用该液体菌剂浸泡所述浸种后的牡丹种子，所述液体菌剂中的所述多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101的含量可为108cfu/ml-109cfu/ml（如109cfu/ml）。
上文中，所述牡丹可为凤丹（Paeoniaostii）。
本发明以玉米秸秆作为发酵生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的原料，针对淀粉质原料发酵蒸煮、液化等预处理高能耗的缺点，采用水热处理技术、纤维素酶酶解技术对玉米秸秆进行预处理，具有如下特点：1、采用水热处理技术对玉米秸秆进行预处理，省去了淀粉质原料长时间的蒸煮过程，降低了发酵生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的能耗，缩短了生产周期。2、采用玉米秸秆酶解液替代淀粉质原料发酵生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂，其活菌数可达2.58×1010cfu/mL，芽孢生成率为80%以上，达到了淀粉质原料的生产水平；玉米秸秆酶解残渣直接作为促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的载体，提高了玉米秸秆的综合利用率。实验证明，本发明菌剂处理的牡丹种子（菌剂组层积处理）的生根时间比对照组层积处理提前了10天；菌剂组层积处理的生根率达到95.0%，比对照组层积处理（未用菌剂处理）的生根率提高了33.8%；菌剂组层积处理的主根长度为69.0mm，是对照组层积处理的1.68倍；菌剂组层积处理的主根长度≥40mm的种子百分率达到90±0.5%，是对照组层积处理的1.3倍；菌剂组层积处理的发芽时间比对照组层积处理缩短了10天；菌剂组层积处理的发芽率达到99.0%，是对照组层积处理的1.2倍；菌剂组层积处理的苗高是对照组层积处理的1.77倍，菌剂组层积处理的干重是对照组层积处理的2.27倍。说明以多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527为活性成分的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂不但拮抗牡丹病原菌还显著地促进了牡丹种子的生根（胚根萌发）和发芽（胚芽萌发）和牡丹幼苗的生长。
保藏说明
菌种名称：多粘类芽孢杆菌
拉丁名：Paenibacilluspolymyxa
菌株编号：CSM1101
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2013年12月09日
保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.8527
附图说明
图1为菌剂组层积处理和对照组层积处理部分种子生根培养60天的照片。
a为对照组层积处理，b为菌剂组层积处理。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的牡丹葡萄孢菌（Botrytispaeoniae）ACCC36053和牡丹枝孢霉（Cladosporiumpaeoniae）ACCC36063于本申请的申请日前均收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心（简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081），这两个菌株的收藏日均为2006年8月31日，自收藏之日起，公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。
下述实施例中所用的牡丹褐斑病病原菌为芍药杂色尾孢霉菌（CercosporavarricolorWinter）（张建国，2001.牡丹的主要病害及防治.中国花卉园艺，23：32-34）公众可从上海辰山植物园获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的牡丹为凤丹（Paeoniaostii）（JigangHan,YaoSong,ZhigangLiu,etc.2011.Culturablebacterialcommunityanalysisintherootdomainsoftwovarietiesoftreepeony(Paeoniaostii).FEMSMicrobiolLett,322:15–24）公众可从上海辰山植物园获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所用的培养基如下：
半固体Dbereiner无氮培养基：蔗糖，10g；苹果酸，5g；KH2PO4·H2O，0.4g；K2HPO4·H2O，0.1g；MgSO4·7H2O，0.2g；NaCl，0.1g；CaCl2·2H2O，0.02g；FeCl3，0.01g；Na2MoO4·2H2O，0.02g；琼脂，3g；用蒸馏水定容至1000ml、pH7.0-7.2。121℃蒸气灭菌20min。
Dbereiner无氮培养基：蔗糖，10g；苹果酸，5g；KH2PO4·H2O，0.4g；K2HPO4·H2O，0.1g；MgSO4·7H2O，0.2g；NaCl，0.1g；CaCl2·2H2O，0.02g；FeCl3，0.01g；Na2MoO4·2H2O，0.02g；琼脂18g；用蒸馏水定容至1000ml、pH7.0-7.2。121℃蒸气灭菌20min。
NB培养基：葡萄糖5.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
NA培养基：葡萄糖5.0g，蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，琼脂18g，用蒸馏水定容至1000ml，pH7.0-7.2，121℃灭菌20min。
PDA培养基：葡萄糖20g，琼脂18g，马铃薯200g，加水1000mL煮沸30min滤取汁液，加水补足1000ml，pH6.0-7.0，121℃灭菌20min。
下述实施例中的纤维素酶购于生工生物工程（上海）股份有限公司。下述实施例中的纤维素酶酶活力单位（FPU）定义为1g纤维素酶粉在55℃下60min内水解滤纸所得葡萄糖μmol数。纤维素酶酶活力的具体测定方法如下：取纤维素酶10.00g，加100mlpH4.85的0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液充分溶解，得到纤维素酶液，将纤维素酶液稀释后，吸取0.5ml，加入0.05mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液1.5ml，1×6cm新华一号滤纸条一张，55℃下水解60min。水解完毕后采用如下的DNS法测定体系中的葡萄糖含量,并计算纤维素酶的酶活力。
下述实施中，发酵培养基中葡萄糖含量的测定方法采用DNS法，具体如下：
(1)DNS试剂的配制：200X酒石酸钾钠，溶于一定量的水中，加热溶解，添加10.0g3,5-二硝基水杨酸，10gNaOH溶解后加入2g苯酚，0.5g无水亚硫酸钠，全部加热溶解后，冷却至室温，定容至1000ml。
(2)葡萄糖标准曲线的绘制：准确称取100.0mg分析纯的无水葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml容量瓶中，再定容到刻度、摇匀，浓度为1mg/mL。取10支试管，分别加入葡萄糖标准溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.6mL后，用蒸馏水稀释至2mL，再加入2.5mLDNS试剂混合均匀，在沸水中加热5min。取出后即用水冷却至室温，定容到25ml，摇匀。30min后于520nm下测OD值。以OD520值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线，形式为Y=aX+b。
(3)发酵液中葡萄糖浓度的测定：取稀释到一定浓度的发酵上清液(4000r/min，离心20min)，加入2.5mLDNS试剂混合均匀，在沸水中加热5min。取出用水冷却到室温，定容至25mL，摇匀，静置30min后于520nm出测OD520值。根据样品的OD520值与标准曲线计算发酵液中的葡萄糖含量。
实施例1、多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101的分离与鉴定
一、多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101的分离
从安徽省铜陵市顺安镇金山村丹皮种植地的牡丹（Paeoniaostii，凤丹）（株龄6年）植株的根际采集土样，将土样放入装有无菌水和灭菌玻璃珠的小三角瓶中，200rpm/min振荡20min；取振荡后的悬液做系列梯度稀释，103、104稀释度悬液各吸取200μl均匀涂布Dbereiner无氮培养基，置30℃培养4d后，挑取单菌落，在
Dbereiner无氮培养基固体培养基平板上用平板划线法进行菌种纯化。将分离纯化所得的其中一个菌株命名为牡丹根际固氮菌CSM1101。
二、牡丹根际固氮菌CSM1101的鉴定
1.形态特征观察和生理生化特性测定
形态学和生理生化特性鉴定参考“伯杰氏系统细菌学手册”（Garrity,2001）和“一般细菌学常用鉴定方法”（东秀珠等，2001），按照常规方法进行。
牡丹根际固氮菌CSM1101的形态学特征如下：革兰氏阳性，运动，菌体呈杆状，直径为0.6-0.8μm，长为2.0-7.6μm。芽孢柱状，1.6-3.5×1.2-1.5μm，中生到次端生。孢子囊明显膨大成纺锤型或棒状。其菌落边缘不整齐裂片状，半透明到不透明。后其菌落粗糙，浅白色，中间略突起。菌落粘着在培养基表面。
牡丹根际固氮菌CSM1101的生理生化特征测定结果如下：
水解淀粉：阴性；
水解酪蛋白：阴性；
水解明胶：阴性；
利用柠檬酸盐：阴性；
酪氨酸分解：阴性；
苯丙氨酸脱氨酶实验：阴性；
卵黄卵磷脂酶实验：阴性；
吲哚产生：阴性；
马尿酸盐实验：阴性；
接触酶实验：阳性；
硝酸盐还原实验：阳性；
二羟丙酮产生：阳性；
抗溶菌酶实验：阳性；
分解葡萄糖产酸产气：阳性；
分解阿拉伯糖产酸产气：阳性；
分解木糖产酸产气：阳性；
分解甘露醇产酸产气：阳性；
耐盐性试验：7%NaCl生长；
在pH6.8的营养肉汤培养基（NB）和pH5.7的沙氏葡萄糖肉汤培养基中均可生长。在MR-VP肉汤上产生乙酰甲基甲醇，pH6.0。
2.16SrDNA的序列扩增和分析
采用细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司）提取基因组DNA作为PCR反应的模板。PCR引物（Pf5’-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和Pr5’-CGGGATCCAAGGAGGTGATCCAGCC-3’）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。使用Perkin-ElmerGeneAmpPCRSystem9700PCR扩增细菌的16SrDNA。反应体系为10×PCRbuffer，2.5uL；dNTP（2.5mM）（TaKaRa），2uL，Pf（10pmol/uL）0.1uL，Pr（10pmol/uL）0.1uL，Taq聚合酶（5U/uL）（TaKaRa），0.125uL，基因组DNA0.5uL，加ddH2O至25uL。PCR反应条件为，94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃复性1min，72℃延伸1min，72℃最后延伸10min，30个循环。PCR扩增产物由生工生物工程（上海）股份有限公司纯化并测序。将菌株的16SrDNA序列在GenBank核酸序列数据库进行序列比较分析。
结果表明测得的牡丹根际固氮菌CSM110116SrDNA序列全长1496bp，如SEQIDNo.1。在GENBANK进行blastn分析的结果表明，其序列与PaenibacilluspolymyxastrainM-1（EF656457）的相似性达到99%。
根据牡丹根际固氮菌CSM1101的形态特征、生理生化特征和16srDNA序列同源性分析结果，将牡丹根际固氮菌CSM1101鉴定为多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）。多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101已于2013年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCCNo.8527。
实施例2、多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101的生物活性
一、多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101的固氮活性测定
固氮活性测定采用乙炔还原法。在15mm×15mm螺口试管中加入2.5mL半固体Dbereiner无氮培养基，接种多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527后，塞好棉塞，30℃培养24h；再换无菌胶塞密封，抽出10%气体，注入相同体积的乙炔,30℃培养24h。抽取气样在VarianVISTA6000型气相色谱仪上测定ARA（acetyienereductionactivity，乙炔还原活性）。实验设三个重复，取其平均值并计算方差不大于5%。
测定结果表明，CSM1101在Dbereiner无氮培养基中表现出了较高的固氮活性。其乙炔还原活性为12.6C2HXnmolmL-1h-1。
二、多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101的抑菌活性
以牡丹葡萄孢菌（Botrytispaeoniae）ACCC36053、牡丹枝孢霉（Cladosporiumpaeoniae）ACCC36063、芍药杂色尾孢霉菌（CercosporavarricolorWinter）中的任一菌株单独为病原菌，均采用平板对峙法测定抑菌率，具体方法如下：病原菌菌株在PDA斜面上活化后，加入无菌水制成病原菌悬浮液，将病原菌悬浮液加到融化后冷却到45-50℃的PDA培养基中混匀倒平板，在30℃培养4天，得到病原菌平板，用直径为6mm的打孔器打取病原菌菌饼。
按照如下方法测定多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101对每种病原菌的抑菌率：实验重复三次，每次重复病原菌设两个处理，即CSM1101组和对照组。将20个无菌PDA平板均分为两组，即CSM1101组和对照组，每组10个平板，进行以下接种处理：在CSM1101组的无菌PDA平板中心接种直径为6mm的病原菌菌饼，将多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527斜面活化菌种接种于距病原菌菌饼3cm处。同时，在对照组的无菌PDA平板中心只接种直径为6mm的病原菌菌饼。将经过上述接种处理的CSM1101组平板和对照组平板在30℃培养5-7天，待对照组平板（仅接种病原菌）长满整个培养皿时，测量对照组的病原菌菌落直径和CSM1101组的病原菌菌落直径，计算抑菌率。
抑菌率（%）=（对照组的病原菌菌落直径-CSM1101组的病原菌菌落直径）/对照组的病原菌菌落直径×100。
结果如表1所示，表明多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527对牡丹葡萄孢菌（Botrytispaeoniae）ACCC36053、牡丹枝孢霉（Cladosporiumpaeoniae）ACCC36063和芍药杂色尾孢霉菌（CercosporavarricolorWinter）均具有较强的平板抑菌活性，其抑菌率分别达到了57.2%、65.7%和88.3%。
表1多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527对病原
菌的抑菌率
下述实施例3-6采用的原料均是相同的，只是工艺条件有差异，如表2所示。
表2、实施例3-6的工艺条件
实施例3、利用玉米秸秆酶解液生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂A
1、发酵培养基的制备
取玉米秸秆8000g（以干重计），切成小段，投入水热反应釜，在180℃和1.0Mpa的条件下进行水热处理20min后自然晾干，得到经过预处理的玉米秸秆；将该经过预处理的玉米秸秆粉碎至100目后，按照以干重计每克秸秆加入15FPU的比例加入纤维素酶，按照以干重计每200克干秸秆加入1L蒸馏水的比例加入蒸馏水，于55℃，100rpm（旋转半径20mm），pH＝4.8的条件下水解48h后冷却离心，分别收集上清液和沉淀，该上清液即为酶解液，该沉淀即为酶解残渣。测定酶解液中的葡萄糖含量，结果表明酶解液中的葡萄糖含量为55g/L。用酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵培养基由酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为
20g；每升所述发酵培养基中，(NH4)2SO4的含量为10g、MgSO4的含量为0.4g、CaCO3的含量为6g、玉米浆的含量为2g。
2、发酵培养
2.1种子培养
将多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527在NA培养基斜面上活化培养后取2－3环接种到500ml三角瓶内的50mlNB培养基中。28℃，26mm振幅，200r/min振荡培养24h作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。
2.2发酵培养
取50L步骤1的发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121℃灭菌20min，冷却后，将2.1所得的种子液接入发酵培养基，接种量（V／V）为10%。培养温度为30℃，通过调节通气量和搅拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30%，发酵过程中自动调节pH为6.8-7.2。培养14小时时补加步骤1的酶解液，使发酵培养基中的葡萄糖含量为15g/L，继续培养16小时，结束发酵。总共发酵30小时。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结果取平均值。结果表明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101的含量为2.58×1010cfu/mL，芽孢含量为85%。将该发酵液和步骤1中的酶解残渣等质量混合，喷雾干燥后（60℃）制粒，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂A。
实施例4、利用玉米秸秆酶解液生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂B
1、发酵培养基的制备
取玉米秸秆8000g（以干重计），切成小段，投入水热反应釜，在180℃和1.0Mpa的条件下进行水热处理20min后自然晾干，得到经过预处理的玉米秸秆；将该经过预处理的玉米秸秆粉碎至100目后，按照以干重计每克秸秆加入15FPU的比例加入纤维素酶，按照以干重计每200克干秸秆加入1L蒸馏水的比例加入蒸馏水，于55℃，100rpm（旋转半径20mm），pH＝4.8的条件下水解48h后冷却离心，分别收集上清液和沉淀，该上清液即为酶解液，该沉淀即为酶解残渣。测定酶解液中的葡萄糖含量，结果表明酶解液中的葡萄糖含量为55g/L。用酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵培养基由酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20g；每升所述发酵培养基中，(NH4)2SO4的含量为10g、MgSO4的含量为0.4g、CaCO3的含量为6g、玉米浆的含量为2g。
2、发酵培养
2.1种子培养
将多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527在NA培养基斜面上活化培养后取2－3环接种到500ml三角瓶内的50mlNB培养基中。28℃，26mm振幅，200r/min振荡培养24h作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。
2.2发酵培养
取50L步骤1的发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121℃灭菌20min，冷却后，将2.1所得的种子液接入发酵培养基，接种量（V／V）为10%。培养温度为30℃，通过调节通气量和搅拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30%，发酵过程中自动调节pH为6.8-7.2。培养24小时，结束发酵。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结果取平均值。结果表明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101的含量为1.86×108cfu/mL，芽孢含量为85%。将发酵液和步骤1中的酶解残渣等质量混合，喷雾干燥后（60℃）制粒，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂B。
实施例5、利用玉米秸秆酶解液生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂C
1、发酵培养基的制备
取玉米秸秆8000g（以干重计），切成小段，投入水热反应釜，在200℃和2.0Mpa的条件下进行水热处理20min后自然晾干，得到经过预处理的玉米秸秆；将该经过预处理的玉米秸秆粉碎至100目后，按照以干重计每克秸秆加入15FPU的比例加入纤维素酶，按照以干重计每200克干秸秆加入1L蒸馏水的比例加入蒸馏水，于55℃，100rpm（旋转半径20mm），pH＝4.8的条件下水解48h后冷却离心，分别收集上清液和沉淀，该上清液即为酶解液，该沉淀即为酶解残渣。测定酶解液中的葡萄糖含量，结果表明酶解液中的葡萄糖含量为60g/L。用酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵培养基由酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20g；每升所述发酵培养基中，(NH4)2SO4的含量为10g、MgSO4的含量为0.4g、CaCO3的含量为6g、玉米浆的含量为2g。
2、发酵培养
2.1种子培养
将多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527在NA培养基斜面上活化培养后取2－3环接种到500ml三角瓶内的50mlNB培养基中。28℃，26mm振幅，200r/min振荡培养24h作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。
2.2发酵培养
取50L步骤1的发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121℃灭菌20min，冷却后，将2.1所得的种子液接入发酵培养基，接种量（V／V）为10%。培养温度为30℃，通过调节通气量和搅拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30%，发酵过程中自动调节pH为6.8-7.2。培养24小时，结束发酵。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结果取平均值。结果表明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101的含量为2.78×109cfu/mL，芽孢含量为85%。将发酵液和步骤1中的酶解残渣等质量混合，喷雾干燥后（60℃）制粒，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂C。
实施例6、利用玉米秸秆酶解液生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂D
1、发酵培养基的制备
取玉米秸秆8000g（以干重计），切成小段，投入水热反应釜，在200℃和2.0Mpa的条件下进行水热处理10min后自然晾干，得到经过预处理的玉米秸秆；将该经过预处理的玉米秸秆粉碎至100目后，按照以干重计每克秸秆加入15FPU的比例加入纤维素酶，按照以干重计每200克干秸秆加入1L蒸馏水的比例加入蒸馏水，于55℃，100rpm（旋转半径20mm），pH＝4.8的条件下水解48h后冷却离心，分别收集上清液和沉淀，该上清液即为酶解液，该沉淀即为酶解残渣。测定酶解液中的葡萄糖含量，结果表明酶解液中的葡萄糖含量为46g/L。用酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵培养基由酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20g；每升所述发酵培养基中，(NH4)2SO4的含量为10g、MgSO4的含量为0.4g、CaCO3的含量为6g、玉米浆的含量为2g。
2、发酵培养
2.1种子培养
将多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527在NA培养基斜面上活化培养后取2-3环接种到500ml三角瓶内的50mlNB培养基中。28℃，26mm振幅，200r/min振荡培养24h作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。
2.2发酵培养
取50L步骤1的发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121℃灭菌20min，冷却后，将2.1所得的种子液接入发酵培养基，接种量（V／V）为10%。培养温度为30℃，通过调节通气量和搅拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30%，发酵过程中自动调节pH为6.8-7.2。培养24小时，结束发酵。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结果取平均值。结果表明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101的含量为4.42×108cfu/mL，芽孢含量为85%。将发酵液和步骤1中的酶解残渣等质量混合，喷雾干燥后（60℃）制粒，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂D。
对比例：利用淀粉质原料生产促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂E
1、发酵培养基配制
发酵培养基：用淀粉、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基（即发酵培养基由淀粉、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水组成），每升所述发酵培养基中所述淀粉的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20g；每升所述发酵培养基中，(NH4)2SO4的含量为10g、MgSO4的含量为0.4g、CaCO3的含量为6g、玉米浆的含量为2g。）
该对比例的发酵培养基中采用的组分除将玉米秸秆酶解液替换为等葡萄糖含量的淀粉外，发酵培养基中的其它组分其它均与实施例3-6相同。
2、发酵培养
该发酵培养中，发酵液的制备方法与实施例4-6相同，具体如下：
2.1种子培养
将多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527在NA培养基斜面上活化培养后取2－3环接种到500ml三角瓶内的50mlNB培养基中。28℃，26mm振幅，200r/min振荡培养24h作为种子液，准备用于发酵罐发酵培养。
2.2发酵培养
取50L发酵培养基置于100L全自动发酵罐中，于121℃灭菌20min，冷却后，将2.1所得的种子液接入发酵培养基，接种量（V／V）为10%。培养温度为30℃，通过调节通气量和搅拌转速维持发酵培养基中的溶氧量为30%，发酵过程中自动调节pH为6.8-7.2。培养24小时，结束发酵。取发酵液，测定发酵液中的菌体含量，实验重复三次，结果取平均值。结果表明发酵液中实施例1的多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101的含量为3.66×109cfu/mL，芽孢含量为85%。将发酵液喷雾干燥后（60℃）制粒，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂E。
实施例7、促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂促进牡丹种子萌发和牡丹幼苗生长
种子采收：7月以果皮蟹黄为标准采收凤丹（Paeoniaostii）蓇葖果(安徽省铜陵市顺安镇金山村),置室内阴干至果皮开裂后收集种子，0.5%KMnO4浸泡2h进行消毒得到消毒后的凤丹（Paeoniaostii）种子用于试验。试验地点为上海市松江区上海辰山植物园。
多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527菌悬液的制备：将实施例3的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂A悬浮于无菌水中得到多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527菌悬液，使菌悬液中多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527的含量为109cfu/mL。
取消毒后的凤丹（Paeoniaostii）种子，用50℃无菌水浸种24h得到浸种后的凤丹（Paeoniaostii）种子，以下简称浸种后的牡丹种子，进行下述种子生根（胚根萌发）实验和发芽（胚芽萌发）实验。种子生根（胚根萌发）实验和发芽（胚芽萌发）实验均重复三次，每次重复设置两种处理，即菌剂组层积处理和对照组层积处理。种子生根（胚根萌发）实验中，每种处理300粒浸种后的牡丹种子。发芽（胚芽萌发）实验中，每种处理选取50粒主根长度≥40mm并且长度一致的生根种子。具体实验方法如下：
1、种子生根（胚根萌发）实验
菌剂组层积处理和对照组层积处理这两种处理中除生根前预处理方式不同外，其它处理方式完全相同。菌剂组层积处理的生根前预处理如下：将浸种后的牡丹种子置于多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527菌悬液（109cfu/mL）中在25-30℃浸泡1小时，完成生根前预处理。对照组层积处理的生根前预处理如下：将浸种后的牡丹种子在25-30℃置于无菌水中浸泡1小时，完成生根前预处理。然后将完成生根前预处理的种子均进行如下生根培养：将完成生根前预处理的种子与含水量为400%的高温灭菌的珍珠岩（层积基质）按照1：3的体积比混匀后，装入聚乙烯塑料袋均置于10℃-25℃（昼20-25℃,夜10-15℃）进行生根培养。每天观察1次，调查生根时间，生根培养90d调查测定生根率、主根长度、主根长度≥40mm的种子百分率。数据用SPSS软件进行差异显著性分析。
其中，以胚根露出种皮的长度为种子长度的1/2为生根。
生根率=（L1/L0）×100%；
L1：生根实验种子中生根种子粒数；L0：生根实验种子粒数。
2、发芽（胚芽萌发）实验
分别取步骤1的菌剂组层积处理和对照组层积处理这两种处理得到的主根长度≥40mm并且长度一致的生根种子在4℃贮藏21天后，栽植于高10cm装有泥炭和珍珠岩的穴盘中，置于10-25℃温室（昼20-25℃,夜10-15℃）中进行发芽培养成苗，每天观察1次，测定发芽时间，发芽培养90d测定发芽率、苗高、整个牡丹幼苗植株的干重，计算发芽率。数据用SPSS软件进行差异显著性分析。
其中，以胚芽露出种皮为发芽。
发芽率=（L1′/L0′）×100%；
L1′：发芽实验种子中发芽种子粒数；L0′：发芽实验种子粒数。
结果如表3-表5所示，菌剂组层积处理的生根时间比对照组层积处理提前了10天；菌剂组层积处理的生根率达到95.0%，比对照组层积处理的生根率提高了33.8%；菌剂组层积处理的主根长度为69.0mm，是对照组层积处理的1.68倍；菌剂组层积处理的主根长度≥40mm的种子百分率达到90±0.5%，是对照组层积处理的1.3倍；菌剂组层积处理的发芽时间比对照组层积处理缩短了10天；菌剂组层积处理的发芽率达到99.0%，是对照组层积处理的1.2倍；菌剂组层积处理的苗高是对照组层积处理的1.77倍，菌剂组层积处理的干重是对照组层积处理的2.27倍。说明以多粘类芽孢杆菌（Paenibacilluspolymyxa）CSM1101CGMCCNo.8527为活性成分的促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂显著地促进了牡丹种子的生根（胚根萌发）和发芽（胚芽萌发）和牡丹幼苗的生长。
图1显示了菌剂组层积处理和对照组层积处理部分种子生根培养60天的情况。
表3、菌剂处理对牡丹种子生根的影响
注：表中同列的英文字母表示差异显著程度，相同字母的处理间在0.05水平无显著差异，字母不同的处理间在0.05水平有显著差异。生根时间是指第1粒种子生根的时间。
表4、菌剂处理对牡丹种子发芽的影响
注：表中同列的英文字母表示差异显著程度，相同字母的处理间在0.05水平无显著差异，字母不同的处理间在0.05水平有显著差异。发芽时间是指第1粒主根长度≥40mm的生根种子发芽的时间。
表5、菌剂处理对牡丹幼苗生长的影响
注：表中同列的英文字母表示差异显著程度，相同字母的处理间在0.05水平无显著差异，字母不同的处理间在0.05水平有显著差异。苗高是幼苗地上部分的高度，干重是整个植株的干重，包括根和芽。
Claims (5)
1.制备促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂的方法，包括：
(1)将玉米秸秆在180-200℃和1.0-2.0Mpa条件下进行水热处理，得到经过预处理的玉米秸秆；
(2)将所述经过预处理的玉米秸秆粉碎后，用纤维素酶进行酶解，分别收集酶解液和酶解残渣；
(3)用所述酶解液、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCO3、玉米浆和水配制发酵培养基，每升所述发酵培养基中所述酶解液的含量满足每升所述发酵培养基的葡萄糖含量为20-50g；
(4)向所述发酵培养基中接入促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌进行发酵，发酵结束后收集发酵液，将所述发酵液和所述酶解残渣混合，得到促进牡丹生长并拮抗病原菌的菌剂；所述促进牡丹生长并拮抗病原菌的细菌为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)CSM1101，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.8527。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述水热处理时间为10-20min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述(2)为将所述经过预处理的玉米秸秆粉碎后，按以干重计每克秸秆加入10-15FPU的比例加入纤维素酶，在55-80℃、pH为4.8-5.0的条件下在水中酶解24-48h，得到玉米秸秆酶解物，将所述玉米秸秆酶解物进行离心，分别收集上清液和沉淀，所述上清液即为所述酶解液，所述沉淀即为所述酶解残渣。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：每升所述发酵培养基中，(NH4)2SO4的含量为10g，MgSO4的含量为0.4g、CaCO3的含量为6g、玉米浆的含量为2g；和/或，所述发酵液和所述酶解残渣按照1:1的质量比进行混合。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述(4)在30℃培养18-30小时进行发酵。
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