CN113766833A - 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)菌株及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种包含含有杀镰孢菌素和十三肽菌素的类芽孢杆菌属种菌株的生物纯的培养物或其无细胞制品的组合物;其中所述杀镰孢菌素用由显示出与SEQ ID NO:3至少90.5%序列同一性的DNA序列编码的fusA的杀镰孢菌素合成酶基因产生;和所述十三肽菌素用由显示出与SEQ ID NO:7至少90.0%序列同一性的DNA序列编码的triE的非核糖体肽合成酶(NRPS)基因产生。还提供了处理农业植物以防治病害的方法和用所公开的组合物增加农业植物的活力和/或作物产量的方法。

Description

类芽孢杆菌属(Paenibacillus)菌株及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年3月7日提交的美国临时专利申请号62/815,069的优先权,其全部内容通过引用的方式全文纳入本文。
技术领域
本发明涉及细菌菌株及其防治植物病害和增加植物活力和作物产量的能力的领域。具体而言,本发明涉及产生杀镰孢菌素和十三肽菌素(tridecaptin)的类芽孢杆菌属种(Paenibacillus sp.)菌株及其维持植物健康和改善植物生长的用途。
引用以电子方式提交的序列表
序列表的正式副本通过EFS-Web、作为ASCII格式的序列表以电子方式提交,其文件名为“BCS189006WO_ST25.txt”,创建于2020年2月25日,大小为185千字节,并与说明书一同提交。该ASCII格式文件中包含的序列表是说明书的一部分,其全部内容通过引用的方式纳入本文。
背景技术
杀真菌剂有多种用途,包括用于作物保护;作为食品、饲料和化妆品防腐剂;以及作为用于人和兽医应用的治疗剂。在发达国家和发展中国家均存在作物减产、食物传播的疾病以及人和动物的真菌感染的问题。
合成杀虫剂或杀真菌剂通常是非特异性的,因此可作用于靶生物体以外的生物体,包括其他天然存在的有益生物体。由于其化学性质,它们也可能是有毒的和非生物可降解的。全世界的消费者越来越意识到与化学品残留相关的潜在环境问题和健康问题,特别是在食品产品中。这已经导致针对减少化学(即合成)农药的使用或至少减少其数量的不断增加的消费者压力。因此,需要管理食物链需求,同时仍允许有效的害虫防治。
另一个随着合成杀虫剂或杀真菌剂的使用而出现的问题是,重复和单独施用杀虫剂或杀真菌剂通常导致对抗性病原微生物的选择。通常,这样的菌株还对其他具有相同作用模式的活性成分具有交叉抗性。之后,使用所述活性化合物来有效防治病原体将不再可能。然而,具有新作用机制的活性成分难以开发并且开发成本高。
病原体种群中抗性发展的风险以及对环境和人健康的担忧促进了对鉴定用于管理植物病害的合成杀虫剂和杀真菌剂的替代方案的兴趣。生物防治剂的使用是一种替代方案。
类芽孢杆菌属是一种GC含量低、形成内生孢子、革兰氏阳性细菌属(厚壁菌门(Firmicutes))。属于该属的细菌是工业相关胞外酶和抗微生物物质(包括非核糖体肽类)的高产生产者。类芽孢杆菌属内的物种和菌株之间存在相当大的可变性,其中只有某些菌株在防治植物病原体和促进植物生长方面表现出功效。
需要具有增强的杀真菌活性和改善植物生长和活力的能力的类芽孢杆菌属种菌株。非常需要提高现有杀真菌剂的功效,并开发不易产生真菌抗性的替代品。
发明内容
本发明涉及包含含有杀镰孢菌素和十三肽菌素的类芽孢杆菌属种菌株的生物纯的培养物或其无细胞制品的组合物;其中所述类芽孢杆菌属种菌株包含由显示出与SEQ IDNO:3至少90.5%序列同一性的DNA序列编码的fusA的杀镰孢菌素合成酶基因;和所述类芽孢杆菌属种菌株包含由显示出与SEQ ID NO:7至少90.0%序列同一性的DNA序列编码的triE的非核糖体肽合成酶(NRPS)基因。
在某些方面,fusA的杀镰孢菌素合成酶基因由包含SEQ ID NO:3的DNA序列编码或由编码相同氨基酸序列的其简并核苷酸序列编码。在其他方面,triE的NRPS基因由包含SEQID NO:7的DNA序列编码或由编码相同氨基酸序列的其简并核苷酸序列编码。
在一些实施方案中,所述组合物包含杀镰孢菌素A、杀镰孢菌素B、杀镰孢菌素C、杀镰孢菌素D、LiF05a、LiF05b、LiF06a、LiF06b、LiF07a和/或LiF07b。
在其他实施方案中,所述组合物有效防治由选自灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、黄瓜白粉菌(Sphaerotheca fuliginea)和小麦叶锈菌(Puccinia triticina)的真菌引起的植物病害。
在某些方面,所述类芽孢杆菌属种菌株为类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724或其杀真菌的突变菌株。
在其他方面,所述组合物包含类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724或其杀真菌的突变菌株的发酵产物。
在一个方面,所述杀真菌的突变菌株的基因组序列与类芽孢杆菌属种菌株NRRLB-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724具有大于约90%的序列同一性,以及/或者所述杀真菌的突变菌株具有与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724相当或更好的杀真菌活性和/或杀镰孢菌素水平。
在一些实施方案中,所述类芽孢杆菌属种菌株还包含固氮基因簇;并且所述固氮基因簇包含由显示出与SEQ ID NO:10至少96.9%序列同一性的DNA序列编码的nifB的固氮基因。
在一个实施方案中,所述固氮基因簇包含由包含SEQ ID NO:10的DNA序列编码或由编码相同氨基酸序列的其简并核苷酸序列编码的nifB的固氮基因。
在其他实施方案中,所述固氮基因簇的表达有助于增强植物生长、植物活力和/或作物产量。在又其他实施方案中,所述类芽孢杆菌属种菌株包含由显示出与SEQ ID NO:1至少97.3%序列同一性的DNA序列编码的fusA的杀镰孢菌素合成酶基因和所述类芽孢杆菌属种菌株包含由显示出与SEQ ID NO:5至少97.5%序列同一性的DNA序列编码的triE的NRPS基因。
在一个方面,fusA的杀镰孢菌素合成酶基因由包含SEQ ID NO:1的DNA序列编码或由编码相同氨基酸序列的其简并核苷酸序列编码。在另一个方面,triE的NRPS基因由包含SEQ ID NO:5的DNA序列编码或由编码相同氨基酸序列的其简并核苷酸序列编码。
在某些方面,所述类芽孢杆菌属种菌株为类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724或其杀真菌的突变菌株。
在其他方面,所述组合物包含类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724或其杀真菌的突变菌株的发酵产物。
在一些实施方案中,所述杀真菌的突变菌株的基因组序列与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724具有大于约90%的序列同一性,以及/或者所述杀真菌的突变菌株具有与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724相当或更好的杀真菌活性和/或杀镰孢菌素水平。
在某些方面,本发明提供了处理农业植物以防治病害的方法,其中所述方法包括将有效量的本文公开的组合物施用于所述植物、所述植物的部分和/或所述植物的位置(locus)。
在一个方面,所述方法包括将组合物施用于叶片植物部分。在另一个方面,将组合物以每公顷约1×1010至约1×1012菌落形成单位(CFU)的类芽孢杆菌属种菌株或以每公顷约0.5kg至约5kg发酵固体施用。在又另一个方面,所述病害是真菌病害或细菌病害。
在其他实施方案中,本发明提供了增加农业植物的活力和/或作物产量的方法,其中用有效量的本文公开的组合物处理植物、植物繁殖体、植物的种子和/或植物正在生长或打算生长的位置。
在一个实施方案中,所述处理作为沟内处理、种子处理和/或叶片处理进行。
在另一个实施方案中,农业植物选自大豆、玉米、小麦、黑小麦、大麦、燕麦、黑麦、油菜、粟、稻、向日葵、棉花、糖用甜菜、仁果、核果、柑橘、香蕉、草莓、蓝莓、扁桃、葡萄、芒果、木瓜、花生、马铃薯、番茄、胡椒、葫芦、黄瓜、甜瓜、西瓜、大蒜、洋葱、西兰花、胡萝卜、卷心菜、菜豆、干豆、油菜籽、豌豆、小扁豆、苜蓿、车轴草(trefoil)、三叶草(clover)、亚麻、象草、牧草、莴苣、甘蔗、茶、烟草和咖啡;每一种都为其天然或遗传修饰的形式。
在又另一个实施方案中,本发明涉及用本文公开的组合物处理的种子。
附图说明
图1描绘了与其他几种类芽孢杆菌属种菌株相比,使用类芽孢杆菌属种菌株NRRLB-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724实现的对黄瓜白粉菌(PODOXA)的防治。
图2描绘了通过用类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRLB-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724的全肉汤培养物进行浸透处理而在番茄植物中产生的植物生长促进作用。
具体实施方式
本文所述的微生物和特定菌株,除非另外特别说明,均从自然界分离并在人工条件下生长,例如在摇瓶培养中或通过放大制造过程(例如在生物反应器中)以例如使生物活性代谢物的产生最大化。在这样的条件下的生长导致菌株“驯化”。通常,这样的“驯化”菌株与其天然存在的对应菌株的区别在于,“驯化”菌株被培养为均质种群(homogenouspopulation),其不经受自然环境中存在的选择压力,但是经受人工选择压力。
如本文所使用的,本说明书和权利要求书中所使用的动词“包含”及其变化形式以其非限制性的意义用于表示包括该词之后的项目,但不排除未具体提及的项目。此外,不定冠词“一(a)”或“一个(an)”对一个要素的引用并不排除存在一个以上要素的可能性,除非上下文明确要求存在一个且仅存在一个要素。因此,不定冠词“一(a)”或“一个(an)”通常表示“至少一个”。
在某些方面,本发明的类芽孢杆菌属种菌株选自以下任一种:土地类芽孢杆菌(P.terrae)、巴西类芽孢杆菌(P.brasilensis)、多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)或皮奥利亚类芽孢杆菌(P.peoriae)。在一个方面,本发明的类芽孢杆菌属种菌株是土地类芽孢杆菌。在另一个方面,本发明的类芽孢杆菌属种菌株是巴西类芽孢杆菌。在另一个方面,本发明的类芽孢杆菌属种菌株是皮奥利亚类芽孢杆菌。在另一个方面,本发明的类芽孢杆菌属种菌株是多粘类芽孢杆菌。
在一个实施方案中,提供了类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724的突变菌株。术语“突变的”是指衍生自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRLB-67724的遗传变体。在一个实施方案中,所述突变体具有类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724的一个或多个或全部识别(功能性)特征。在一个特定的实例中,突变体或其发酵产物至少与亲代类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724一样防治真菌、卵菌和/或细菌(作为识别功能性特征)。这种突变体是这样的遗传变体,即其基因组序列与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724具有大于约85%、大于约90%、大于约95%、大于约98%或大于约99%的序列同一性。突变体可以通过使用化学品或辐照处理类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724的细胞获得;或通过从类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724细胞种群选择自发突变体(如噬菌体抗性或抗生素抗性突变体)获得;通过基因组重排获得,如下所述;或通过本领域技术人员熟知的其他方法获得。
通过使用称为原生质体融合的方法,可以促进类芽孢杆菌属菌株之间的基因组重排。该方法始于营养杆状细菌细胞(bacillary cell)形成原生质体。肽聚糖细胞壁的去除(通常使用溶菌酶和渗透稳定剂)导致原生质体的形成。该过程在光学显微镜下可见,呈球形细胞。然后加入PEG(聚乙二醇)诱导原生质体融合,使两个或多个细胞的遗传内容物接触,从而促进重组和基因组重排。然后重新分配融合的细胞,并在固体生长培养基上回收。在恢复过程中,原生质体重建肽聚糖细胞壁,转变回杆状细菌形状。参见Schaeffer,et.al.,(1976)PNAS USA,vol.73,6:2151-2155)。
在某些方面,本发明涉及产生杀镰孢菌素的类芽孢杆菌属种菌株。杀镰孢菌素是具有15-胍基-3-羟基十五酸(GHPD)尾的缩酚酸肽(depsipeptide)家族,以及它们的线性对应物。杀镰孢菌素的特定的保守特征是该GHPD尾,以及序列中六个氨基酸中的三个:(1)苏氨酸,(4)苏氨酸和(6)丙氨酸。
Nakajima等人(J.Antibiot.1972,25,243-247)在70年代中期首次发现杀镰孢菌素但是未对其进行表征,Kurusu等人(J.Antibiot.,1987,40,1506-1514)在20世纪80年代末描述了杀镰孢菌素。Kajimura等人(J.Antibiot.,1996,49,129-135;J.Antibiot.,199750,220-228)、Kuroda等人(Heterocycles,2000,53,1533-1549;J.Mass Spectrom.,2001,36,30-37)和Beatty等人(Can.J.Microbiol.,2002,48,159-169)在20世纪90年代中期到21世纪早期进一步研究了杀镰孢菌素。在这个阶段的大量研究中,这些化合物根据作者被命名若干次(杀镰孢菌素A还称为LiF04a、Gatavalin或KT-6291A)。尽管关于这个主题有许多公开出版物,每次记载了来自24种已知杀镰孢菌素的相同组的经选择的化合物。
在关于所述主题的一段平静期之后,Vater等人(J.Am.Soc.Mass Spectrom.,2015,26,1130-1141)描述了通过质谱对杀镰孢菌素的结构阐释,并描述了该家族的若干类似物。Vater等人鉴定了一类新的具有7个氨基酸的杀镰孢菌素样化合物(即在肽序列中,额外的丙氨酸连接至(4)苏氨酸残基)。本文使用的术语“非环状类似物”指对应于杀镰孢菌素或杀镰孢菌素样化合物,但是缺少酯键而产生线性结构的化合物。
杀镰孢菌素的氨基酸链连接在一起并且由非核糖体肽合成酶(NRPS)修饰。多结构域NRPS由最高达15,000个氨基酸组成,因此被认为是自然界中最长的蛋白质之一(Schwarzer et al.,(2003)Nonribosomal Peptides:From Genes toProducts.Nat.Prod.Rep.20,275-287)。NRPS掺入不限于由核糖体翻译的21种标准氨基酸,这种混杂性促成了非核糖体肽的巨大的结构多样性和生物活性(Li and Jensen,(2008).Nonribosomal biosynthesis of fusaricidins by Paenibacillus polymyxa PKB1involves direct activation of a d-amino acid.Chem.Biol.15,118-127)。
在多粘类芽孢杆菌E68中,已表征杀镰孢菌素生物合成基因簇(fusGFEDCBA),并观察到NRPS编码序列(该基因簇中的最大编码DNA序列(CDS))编码6个模块的肽(Choi etal.,Identification and Functional Analysis of the Fusaricidin BiosyntheticGene of Paenibacillus polymyxa E681.Biochem.Biophys.Res.Commun.365,89-95;Liand Jensen,Identification and Functional Analysis of the FusaricidinBiosynthetic Gene of Paenibacillus polymyxa E681.Biochem.Biophys.Res.Commun.365,89-95;Li et al.,(2013).Promoter Analysis and Transcription Regulation offus Gene Cluster Responsible for Fusaricidin Synthesis of Paenibacilluspolymyxa SQR-21.Appl.Microbiol.Biotechnol.97,9479-9489)。所述生物合成簇包括其他负责脂质部分的生物合成的CDS,但是不包含转运蛋白基因(Li and Jensen,(2008).Nonribosomal biosynthesis of fusaricidins by Paenibacillus polymyxa PKB1involves direct activation of a d-amino acid.Chem.Biol.15,118-127)。在多粘类芽孢杆菌中,鉴定了fus操纵子的启动子,并且证明该启动子与转录抑制因子(AbrB)结合,之前的研究暗示所述转录抑制因子是孢子形成的调控因子;这是重要的,因为观察到杀镰孢菌素在孢子形成过程中被合成,因此协调微生物的次级代谢与其生命周期(Li et al.,(2013).Promoter Analysis and Transcription Regulation of fus Gene ClusterResponsible for Fusaricidin Synthesis of Paenibacillus polymyxa SQR-21.Appl.Microbiol.Biotechnol.97,9479-9489)。
在其他方面,本发明涉及产生十三肽菌素的类芽孢杆菌属种菌株。十三肽菌素是一组类似于多粘菌素的线性阳离子脂肽。酰基十三肽于1978年首次分离,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有抗微生物活性。Shoji,Junichi et al.,Journal of Antibiotics(1978),31(7),646-51。最近,十三肽菌素A1已被表征为土地类芽孢杆菌的菌株。Lohans,Christopher T.et al.,ChemBioChem(2014),15(2),243-249。
等位基因多样性通常被认为是产生化学多样性的原因。然而,fus簇的有趣特征在于,杀镰孢菌素的多样性(区别为它们掺入的氨基酸(Tyr、Val、Ile、allo-Ile、Phe))可通过fusA的单个等位基因产生;潜在的机制在于,负责氨基酸识别的NRPS A结构域放宽了底物特异性(Han et al.,(2012).Site-Directed Modification of the Adenylation Domainof the Fusaricidin Nonribosomal Peptide Synthetase for Enhanced Production ofFusaricidin Analogs.Biotechnol.Lett.34,1327-1334;Mousa et al.,(2015)Biodiversity of Genes Encoding Anti-Microbial Traits within Plant AssociatedMicrobes,Front Plant Sci.2015;6:231)。
在某些实施方案中,所述组合物包含类芽孢杆菌属种菌株的生物纯的培养物,所述类芽孢杆菌属种菌株包含:由显示出与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:1至少90.5%序列同一性的DNA序列编码的fusA的杀镰孢菌素合成酶基因,由显示出与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:5至少90.0%序列同一性的DNA序列编码的triE的非核糖体肽合成酶(NRPS)基因,和/或由显示出与SEQ ID NO:10至少96.9%序列同一性的DNA序列编码的nifB的固氮基因。在一些方面,类芽孢杆菌属种菌株的fusA、triE或nifB与各自的序列(即,fusA的SEQ ID NO:1或3;triE的SEQ ID NO:5或7;nifB的SEQ ID NO:10)之间的序列同一性为至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。在其他方面,类芽孢杆菌属种菌株的fusA、triE或nifB与各自的序列(即,fusA的SEQ ID NO:1或3;triE的SEQ ID NO:5或7;nifB的SEQ ID NO:10)之间的序列同一性为约80%至100%、约85%至100%、约90%至100%或约95%至100%。
由于遗传密码的简并性,不同的核苷酸密码子可用于编码特定的氨基酸。宿主细胞经常表现出密码子使用的优选模式。优选构建结构核酸序列以利用特定宿主细胞的密码子使用模式。这通常增强了结构核酸序列在转化的宿主细胞中的表达。本文公开的任何核酸序列可以被修饰以反映包含它们的宿主细胞或生物体的优选密码子使用。
本文所述核酸序列中的其他变异可编码与它们被工程化的蛋白质相比具有等同或优越特性的蛋白质。突变可以包括缺失、插入、截短、置换、融合、基序序列的重排等。
核酸序列的突变可以以特定或随机的方式引入,这两种方式都是分子生物学领域技术人员熟知的方式。存在多种定点突变技术,通常使用寡核苷酸在核酸序列的特定位置引入突变。实例包括单链拯救(rescue)(Kunkel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:488-492,1985)、独特位点消除(Deng and Nickloff,Anal.Biochem.200:81,1992)、缺口保护(Vandeyar,et al.Gene 65:129-133,1988)和PCR(Costa et al.,MethodsMol.Biol.57:31-44,1996)。随机或非特异性突变可能由化学试剂产生(一般综述参见Singer and Kusmierek,Ann.Rev.Biochem.52:655-693,1982),如亚硝基胍(Cerda-Olmedoet al.,J.Mol.Biol.33:705-719,1968;Guerola,et al.Nature New Biol.230:122-125,1971)和2-氨基嘌呤(Rogan and Bessman,J.Bacteriol.103:622-633,1970);或通过生物学方法产生,如通过致突变菌株(Greener,et al.Mol.Biotechnol.7:189-195,1997)。
这些修饰可能导致氨基酸序列的保守性或非保守性改变。保守性改变是由结构核酸序列中的添加、缺失、置换等引起,其不改变蛋白质的最终氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,编码的蛋白具有20至500个保守性改变,更优选15至300个保守性改变,甚至更优选10至150个保守性改变,最优选5至75个保守性改变。
非保守性改变包括导致氨基酸序列改变的添加、缺失和置换。在一个优选的实施方案中,编码的蛋白具有10至250个非保守性氨基酸改变,更优选5至100个非保守性氨基酸改变,甚至更优选2至50个非保守性氨基酸改变,最优选1至30个非保守性氨基酸改变。
进行上述改变的其他方法记载于Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.,1995,Bauer et al.,Gene,37:73,1985;Craik,BioTechniques,3:12-19,1985;Frits Eckstein et al.,Nucleic AcidsResearch,10:6487-6497,1982;Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989,Smith,et al,In:Genetic Engineering:Principles and Methods,Setlow etal.,Eds.,Plenum Press,N.Y.,1-32,1981,and Osuna,et al.,Critical Reviews InMicrobiology,20:107-116,1994中。
可以对本发明的蛋白质序列和编码它们的核酸片段进行修饰,以保持分子的所需性质。以下是基于改变蛋白质的氨基酸序列以产生等同物或可能改进的分子的讨论。
蛋白质序列中的某些氨基酸可以被置换为其他氨基酸,而不会明显损失所需的活性。
因此,预期可在所公开的蛋白质序列的肽序列或其相应的核酸序列中进行各种改变,而不明显损失生物活性。
进行此类改变时,可考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能中的重要性在本领域中是众所周知的(yte and Doolittle,J.Mol.Biol.,157:105-132,1982)。公认的是,氨基酸的相对亲水性特性有助于所得蛋白质的二级结构,这反过来又定义了蛋白质与其他分子的相互作用,例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等。
根据每个氨基酸的疏水性和电荷特性,为其指定了亲水性指数。它们是:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/半胱氨酸(+2.5);蛋氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸/谷氨酰胺/天冬氨酸/天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5)。
本领域已知某些氨基酸可以被具有相似的亲水性指数或评分的其他氨基酸置换,并且仍然产生具有相似的生物活性的蛋白质,即仍然获得生物功能性蛋白质。在进行这种改变时,优选置换其亲水性指数在±2以内的氨基酸,更优选在±1以内的氨基酸,最优选在±0.5以内的氨基酸。
本领域还理解,可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的置换。美国专利号4,554,101(Hopp)指出,蛋白质的最大局部平均亲水性由其相邻氨基酸的亲水性决定,与蛋白质的生物性质相关。以下为指定给氨基酸的亲水性值:精氨酸/赖氨酸(+3.0);天冬氨酸/谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺/谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(-0.5±1);丙氨酸/组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);蛋氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸/异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);和色氨酸(-3.4)。
应当理解,氨基酸可以被另一个具有相似亲水性评分的氨基酸置换,并且仍然得到具有相似生物活性的蛋白质,即仍然得到生物功能性蛋白质。在进行这种改变时,优选置换其亲水性指数在±2以内的氨基酸,更优选在±1以内的氨基酸,最优选在±0.5以内的氨基酸。
如上所述,因此,氨基酸取代基于氨基酸侧链取代基的相对相似性,例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑各种前述特征的示例性置换是本领域技术人员熟知的,并包括:精氨酸和赖氨酸;谷氨酸和天冬氨酸;丝氨酸和苏氨酸;谷氨酰胺和天冬酰胺;以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
本发明还涵盖了通过将所公开的类芽孢杆菌属种菌株或其突变体或其无细胞制品或其代谢物给予至植物或植物部分(如叶、茎(stem)、花、果实、根或种子)或通过施用到植物或植物部分生长的位置(如土壤)来处理植物以防治植物病害的方法。
在根据本发明的方法中,可将含有所公开的类芽孢杆菌属种菌株或其杀真菌的突变体的组合物施用于生长在用于生长植物的任何类型的介质(例如土壤、蛭石、碎纸板和水)中的任何植物或任何植物的任何部分,或施用到气生生长的植物或植物的部分,例如兰花或鹿角蕨。所述组合物可以例如通过喷洒(spraying)、雾化(atomizing)、蒸发(vaporizing)、散播(scattering)、粉化(dusting)、添水(watering)、喷射(squirting)、喷洒(sprinkling)、倾注(pouring)或熏蒸(fumigating)来施用。如上文已经说明,可在目的植物所在的任何需要的场所进行施用,例如农业、园艺、森林、种植园、果园、苗圃、有机种植作物、草皮草和城市环境。
根据本领域公知的方法,包括通过使用培养基和下文实施例中所述的其他方法,通过培养所公开的类芽孢杆菌属种菌株或从其衍生的杀真菌的突变体(菌株)来获得本发明的组合物。常规的大规模微生物培养方法包括深层发酵、固态发酵或液体表面培养。接近发酵结束时,随着营养物的消耗,细胞开始从生长期转变为孢子形成期,因此最终发酵产物主要是孢子、代谢物和残留的发酵培养基。孢子形成是类芽孢杆菌属的天然生命周期的一部分,并且通常由细胞响应于营养物限制而开始。设置发酵以获得高水平的菌落形成单位并促进孢子形成。发酵产生的培养基中的细菌细胞、孢子和代谢物可直接使用,或通过常规工业方法(例如离心、正切流动过滤、深层过滤和蒸发)浓缩。
本发明的组合物包括发酵产物。在一些实施方案中,清洗浓缩发酵液(例如通过渗滤方法)以除去残留发酵液和代谢物。本文使用的术语“肉汤浓缩物”指已如上文所述由常规工业方法浓缩,但是以液体形式保留的全肉汤(发酵液)。本文使用的术语“发酵固体”指发酵液干燥之后保留的固体材料。本文使用的术语“发酵产物”指全肉汤、肉汤浓缩物和/或发酵固体。本发明的组合物包括发酵产物。
使用常规干燥过程或方法(例如喷雾干燥、冷冻干燥、盘干燥、流化床干燥、转鼓干燥或蒸发),添加或不添加载体,可干燥发酵液或肉汤浓缩物。
所产生的干燥产物可进一步加工,例如通过制粉(milling)或制粒(granulation),以达到特定的颗粒大小或物理形式。还可在干燥后添加下文所述的载体。
本发明菌株的发酵液的无细胞制品可通过本领域已知的任何方法(例如发酵液的提取、离心和/或过滤)获得。本领域技术人员将了解,所谓的无细胞制品可能无法不包含细胞,而是在很大程度上没有细胞或基本上没有细胞,这取决于除去细胞所使用的技术(例如离心速度)。所得的无细胞制品可被干燥和/或用有助于将其施用到植物或植物生长培养基的组分来配制。上文所述的发酵液的浓缩方法和干燥技术也适用于无细胞制品。
在一个实施方案中,发酵产物包含至少约1×104菌落形成单位(CFU)的微生物(例如类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724或其杀真菌的突变菌株)/mL发酵液。在另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1×105菌落形成单位(CFU)微生物/mL发酵液。在另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1×106CFU微生物/mL发酵液。在又另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1×107CFU微生物/mL发酵液。在另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1×108CFU微生物/mL发酵液。在另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1×109CFU微生物/mL发酵液。在另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1×1010CFU微生物/mL发酵液。在另一个实施方案中,发酵产物包含至少约1×1011CFU微生物/mL发酵液。
本发明的组合物可以本身的形式来使用,或根据它们特定的物理和/或化学性质,以它们的制剂形式或从其制备的使用形式来使用,例如气雾剂、胶囊悬剂、冷雾化浓缩物、热雾化浓缩物、胶囊颗粒剂、微粒剂(fine granules)、用于处理种子的流动浓缩物、即用型溶液剂、粉剂(dustable powder)、乳化浓缩物、水包油乳剂、油包水乳剂、大颗粒剂、小颗粒剂、油分散粉剂、油混溶性流动浓缩物、油混溶性液剂、气体(压力下)、产气产品、发泡剂、糊剂、农药包被的种子、悬浮浓缩物、油分散液、悬乳剂浓缩物、可溶性浓缩物、悬浮剂、可湿性粉剂、可溶性粉剂、粉剂和颗粒剂(dusts and granules)、水溶性和水分散颗粒剂或片剂、用于处理种子的水溶性和水分散粉剂(powder)、可湿性粉剂、浸透活性成分的天然产物和合成物质,以及用于种子的聚合物质中和包被材料中的微囊剂,以及ULV冷雾化和热雾化制剂。
在一些实施方案中,本发明的组合物是液体制剂。液体制剂的非限制性实例包括悬浮浓缩物和油分散液。在其他实施方案中,本发明的组合物是固体制剂。液体制剂的非限制性实例包括冻干粉末和喷雾干燥的粉末。
根据本发明可处理所有的植物和植物部分。在本发明上下文中,植物可理解为意指全部植物和植物种群,例如需要的和不需要的野生植物或作物植物(包括天然存在的作物植物)。作物植物可以是通过传统育种和优化方法或通过生物技术和重组方法,或这些方法的组合而获得的植物,包括转基因植物,并且包括受到或不受植物育种者权利保护的植物品种。植物部分可理解为意指植物的所有地上和地下部分以及器官,例如嫩枝(shoot)、叶、花和根,可提及的实例为叶、针叶、秆、茎、花、子实体、果实和种子、以及根、块茎和根茎。植物部分还包括作物材料以及营养繁殖和有性繁殖材料,例如插条、块茎、根茎、接枝(slip)和种子。
如上文已经提及的,可根据本发明处理所有植物及其部分。在一个优选的实施方案中,处理野生的或通过传统生物育种法(例如杂交或原生质体融合)获得的植物物种和植物品种以及它们的部分。在另一个优选的实施方案中,处理通过重组方法(如果适合,与传统方法结合)获得的转基因植物和植物品种(遗传修饰的生物体)以及它们的部分。术语“部分”或“植物的部分”或“植物部分”已在上文中解释。特别优选地根据本发明处理在每种情况下均是市售的或使用中的植物品种的植物。植物品种理解为意指具有新性状的植物,其通过传统育种、通过诱变或通过重组DNA技术培育。植物品种可表现为品种、小种(race)、生物型和基因型的形式。
使用本发明的组合物进行的对植物和植物部分的处理可直接进行,或通过使用常规处理方法作用于环境、生境或贮存空间,例如通过浸渍(dipping)、喷洒、雾化、成雾(misting)、蒸发(evaporating)、粉化、成雾(fogging)、散播、起泡(foaming)、涂抹(painting on)、散播(spreading)、注射(injecting)、浸透(drenching)、滴灌溉(trickleirrigation),以及在繁殖材料的情况下,特别是在种子的情况下,还通过干种子处理法、湿种子处理法、浆处理法、通过形成外壳、通过用一种或多种包衣来包被等。还可以通过超低容积法施用活性物质,或将活性物质制剂或活性物质本身注射到土壤中。
优选的植物的直接处理为叶施用处理,即,将根据本发明的组合物施用到叶片上,可使处理频率和施用率与所讨论的病原体的感染压力相匹配。
优选的植物为那些有用的植物、观赏植物、草皮,通常使用的在公共场合和家庭中被用作观赏植物的树木,以及林业树木。林业树木包括用于产生木材、纤维素、纸的树木,以及从树木部分产生的产品。
本申请上下文中使用的术语“农业植物”是指这样的作物植物,即用作用于获得食品、饲料、燃料或用于工业目的的植物。
术语“植物繁殖材料”和“植物繁殖体”应理解为表示植物的所有生殖部分,例如种子和营养植物材料,例如插条和块茎(例如马铃薯),其可用于植物的增殖。这包括种子、根、果实、块茎、鳞茎、根茎、嫩枝、芽和植物的其他部分。还可提及发芽后或从土壤中出苗后待移植的幼苗和幼株。移植前,还可通过浸泡或灌注对这些幼株进行全部或部分处理。
术语“位置”应理解为正在生长或打算生长植物的任何类型的环境、土壤、区域或材料,以及对植物和/或其繁殖体的生长和发育有影响的环境条件(如温度、水的可用性、辐射)。此外,术语“位置”应理解为正在生长或可能生长害虫的植物、种子、土壤、区域、材料或环境。
“作物产量”是植物状况的指标,而“作物”应理解为收获后进一步利用的任何植物或植物产物,例如,适当意义上的果实、蔬菜、坚果、谷物、种子、木材(例如,在造林植物的情况下)、花(例如,在园艺植物、观赏植物的情况下)等,即植物所产生的任何具有经济价值的东西。
根据本发明,植物,特别是农业、造林和/或观赏植物的“增加的产量”是指与在相同条件下但不施用本发明的组合物所产生的植物的相同产物的产量相比,相应植物的产物的产量增加了可测量的量。
术语“种子”包括所有种类的种子和植物繁殖体,包括但不限于真种子、种子片(seed pieces)、吸根(sucker)、球茎、鳞茎、果实、块茎、谷粒、插条、切枝等,并且在优选实施方案中为真种子。
术语“种子处理”包括本领域已知的所有合适的种子处理技术,例如拌种、种子包衣、种子粉化、种子浸泡、种子浸渍和种子造粒。
可以用本发明的组合物和方法处理和/或改善的农业植物包括例如以下植物类型:草皮、藤本植物、谷类,例如小麦、大麦、黑麦、燕麦、稻、玉米和粟/高粱;甜菜,例如糖用甜菜和饲用甜菜;水果,例如仁果、核果和软果,例如苹果、梨、李子、桃、扁桃、樱桃和浆果,例如草莓、覆盆子、黑莓;豆科植物,例如菜豆、小扁豆、豌豆和大豆;油料作物,例如油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可和花生;葫芦(cucurbit),例如南瓜(pumpkin/squash)、黄瓜和甜瓜;纤维植物,例如棉花、亚麻、大麻和黄麻;柑橘类水果,例如橙子、柠檬、葡萄柚和橘子;蔬菜,例如菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜物种、胡萝卜、洋葱、番茄、马铃薯和甜椒;樟科(Lauraceae),例如鳄梨、樟属(Cinnamomum)、樟脑,或其他植物,例如烟草、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶、胡椒、葡萄藤、啤酒花、香蕉、乳胶植物以及观赏植物,例如花、灌木、落叶树和针叶树。该列举是非限制性的。
以下植物被认为是本发明的组合物和方法特别适用的靶作物:棉花、茄子、草皮、仁果、核果、软果、玉米、小麦、大麦、黄瓜、烟草、藤本植物、稻、谷类、梨、豆、大豆、油菜、番茄、甜椒、甜瓜、卷心菜、马铃薯和苹果。
另外特别感兴趣的农业植物包括例如谷类,例如小麦、黑麦、大麦、黑小麦、燕麦或稻;甜菜,例如糖用甜菜或饲用甜菜;水果,例如仁果、核果或软果,例如苹果、梨、李子、桃、扁桃、樱桃、草莓、覆盆子、黑莓或醋栗;豆科植物,如小扁豆、豌豆、苜蓿或大豆;油料植物,如油菜、芥菜、橄榄、向日葵、椰子、可可豆、蓖麻油植物、油棕、碎坚果或大豆;葫芦,如南瓜、黄瓜或甜瓜;纤维植物,如棉花、亚麻、大麻或黄麻;柑橘类水果,如橙子、柠檬、葡萄柚或柑橘;蔬菜,如西兰花、菠菜、莴苣、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、番茄、马铃薯、葫芦或红辣椒;樟科植物,如鳄梨、樟属或樟脑;能源和原材料植物,如玉米、大豆、油菜、甘蔗或油棕;玉米;烟草,坚果;咖啡;茶;香蕉;葡萄藤(鲜食葡萄和葡萄汁葡萄藤);啤酒花;草皮;天然橡胶植物或观赏植物和林业植物,例如花、灌木、阔叶树或常青树,例如针叶树;以及植物繁殖材料如种子和这些植物的作物材料。
可根据本发明的方法改善的树木的实例为:冷杉属种(Abies sp.)、桉属种(Eucalyptus sp.)、云杉属种(Picea sp.)、松属种(Pinus sp.)、七叶树属种(Aesculussp.)、悬铃木属种(Platanus sp.)、椴树属种(Tilia sp.)、槭树属种(Acer sp.)、铁杉属种(Tsuga sp.)、梣属种(Fraxinus sp.)、花楸属种(Sorbus sp.)、桦木属种(Betula sp.)、山楂属种(Crataegus sp.)、榆属种(Ulmus sp.)、栎属种(Quercus sp.)、山毛榉属种(Fagussp.)、柳属种(Salix sp.)、杨属种(Populus sp.)。
可根据本发明的方法来改善的优选的树木为:来自七叶树属树木物种:欧洲七叶树(A.hippocastanum)、小花七叶树(A.pariflora)、红花七叶树(A.carnea);来自悬铃木属树木物种:二球悬铃木(P.aceriflora)、一球悬铃木(P.occidentalis)、加利福尼亚悬铃木(P.racemosa);来自云杉属树木物种:欧洲云杉(P.abies);来自松属树木物种:辐射松(P.radiata)、西黄松(P.ponderosa)、扭叶松(P.contorta)、欧洲赤松(P.sylvestre)、湿地松(P.elliottii)、白松(P.montecola)、美国白皮松(P.albicaulis)、多脂松(P.resinosa)、长叶松(P.palustris)、火炬松(P.taeda)、柔枝松(P.flexilis)、黑材松(P.jeffregi)、北美短叶松(P.baksiana)、北美乔松(P.strobus);来自桉属树木物种:巨桉(E.grandis)、蓝桉(E.globulus)、赤桉(E.camadentis)、亮果桉(E.nitens)、斜叶桉(E.obliqua)、王桉(E.regnans)、弹丸桉(E.pilularus)。
可根据本发明的方法来改善的特别优选的树木为:来自松属物种的树木:辐射松、西黄松、扭叶松、欧洲赤松、北美乔松;来自桉属物种的树木:巨桉、蓝桉、赤桉。
可根据本发明的方法来改善的非常特别优选的树木为:七叶树、悬铃木科(Platanaceae)、椴树、枫树。
本发明也可应用于任何草皮草,包括冷季型草皮草和暖季型草皮草。冷季型草皮草的实例为早熟禾(早熟禾属种(Poa spp.)),例如肯塔基早熟禾(草地早熟禾(Poapratensis L.)),粗茎早熟禾(Poa trivialis L.),加拿大早熟禾(Poa compressa L.),一年生早熟禾(Poa annua L.),高地早熟禾(Poa glaucantha Gaudin),林地早熟禾(Poanemoralis L.)和鳞茎早熟禾(Poa bulbosa L.);剪股颖(剪股颖属种(Agrostis spp.))例如匍匐剪股颖(Agrostis palustris Huds.),细弱剪股颖(Agrostis tenuis Sibth.),绒毛剪股颖(Agrostis canina L.),德国南部混合剪股颖(剪股颖属种,包括细弱剪股颖、绒毛剪股颖和匍匐剪股颖),以及小糠草(Agrostis alba L.);
羊茅(羊茅属种(Festuca spp.)),例如紫羊茅(Festuca rubra L.spp.rubra)、匍匐羊茅(Festuca rubra L.)、紫羊茅(Festuca rubra commutata Gaud.)、羊茅(Festucaovina L.)、硬羊茅(Festuca longifolia Thuill.)、细叶羊茅(Festucu capillataLam.)、高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)和牛尾草(Festuca elanor L.);
黑麦草(黑麦草属种(Lolium spp.)),例如一年生黑麦草(多花黑麦草(Loliummultiflorum Lam.))、多年生黑麦草(Lolium perenne L.)和意大利黑麦草(Loliummultiflorum Lam.);
以及冰草(冰草属种(Agropyron spp.)),例如扁穗冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn.)、扁穗冰草(Agropyron desertorum(Fisch.)Schult.)和蓝茎冰草(Agropyron smithii Rydb.)。
其他冷季型草皮草的实例为:喜沙草(美洲沙茅草(Ammophila breviligulataFern.))、无芒雀麦(Bromus inermis Leyss.)、香蒲如梯牧草(Phleum pratense L.)、沙香蒲(Phleum subulatum L.)、鸭茅(Dactylis glomerata L.)、碱茅(Puccinellia distans(L.)Pari.)和洋狗尾草(Cynosurus cristatus L.)。
暖季型草皮草的实例为:狗牙根(狗牙根属种(Cynodon spp.L.C.Rich))、结缕草(结缕草属种(Zoysia spp.Willd.))、偏序钝叶草(Stenotaphrum secundatum WaltKuntze)、假俭草(Eremochloa ophiuroides Munro Hack.)、地毯草(Axonopus affinisChase)、百喜草(Paspalum notatum Flugge)、狼尾草(Pennisetum clandestinumHochst.ex Chiov.)、野牛草(Buchloe dactyloids(Nutt.)Engelm.)、格兰马草(Boutelouagracilis(H.B.K.)Lag.ex Griffiths)、海滨雀稗(Paspalum vaginatum Swartz)和sideoats grama(Bouteloua curtipendula(Michx.Torr.)。冷季型草皮草通常优选地用于根据本发明的用途。特别优选早熟禾、剪股颖和小糠草、羊茅和黑麦草。尤其优选剪股颖。
本发明的组合物具有有效的杀微生物活性,并且可用于在作物保护中和在材料保护中防治不想要的微生物,例如真菌和细菌。
本发明还涉及用于防治不需要的微生物的方法,其特征在于将本发明的组合物施用于植物病原真菌、植物病原细菌和/或其生境。
杀真菌剂可用于在作物保护中防治植物病原真菌。杀真菌剂的特征在于具有对抗广谱植物病原真菌的显著功效,所述植物病原真菌包括土壤传播的病原体,特别是根肿菌纲(Plasmodiophoromycetes)、卵菌纲(Peronosporomycetes)(同义词:卵菌纲(Oomycetes))、壶菌纲(Chytridiomycetes)、接合菌纲(Zygomycetes)、子囊菌纲(Ascomycetes)、担子菌纲(Basidiomycetes)和半知菌纲(Deuteromycetes)(同义词:半知菌纲(Fungi imperfecti))的成员。一些杀真菌剂具有系统活性且可作为叶片、种子拌种或土壤杀真菌剂用于植物保护中。此外,它们适合用于防治真菌,特别是侵扰植物的木材或根部的真菌。
杀细菌剂可用于在作物保护中防治假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)和链霉菌科(Streptomycetaceae)。
可根据本发明处理的真菌病害的病原体的非限制性实例包括:
由白粉病病原体引起的病害,所述白粉病病原体例如,布氏白粉菌属(Blumeria)种,例如禾本科布氏白粉菌(Blumeria graminis);叉丝单囊壳属(Podosphaera)种,例如苹果白粉菌(Podosphaera leucotricha);单丝壳属(Sphaerotheca)种,例如黄瓜白粉菌(Sphaerotheca fuliginea);钩丝壳属(Uncinula)种,例如葡萄白粉菌(Uncinulanecator);
由锈病病原体引发的病害,所述锈病病原体例如,裸孢子囊菌属(Gymnosporangium)种,例如梨锈菌(Gymnosporangium sabinae);驼孢锈菌属(Hemileia)种,例如咖啡锈菌(Hemileia vastatrix);层锈菌属(Phakopsora)种,例如豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae);柄锈菌属(Puccinia)种,例如小麦隐匿柄锈菌(Puccinia recondite)、小麦叶锈菌(P.triticina)、禾柄锈菌(P.graminis)或小麦条锈病菌(P.striiformis);单孢锈菌属(Uromyces)种,例如疣顶单孢锈菌(Uromyces appendiculatus);
由卵菌纲(Oomycetes)的病原体引起的病害,所述病原体例如白锈菌属(Albugo)种,例如白锈病菌(Albugo candida);盘梗霉属(Bremia)种,例如莴苣盘梗霉菌(Bremialactcae);斜尖状孢子菌属(Peronospora)种,例如豌豆霜霉(Peronospora pisi)或芸苔霜霉(P.brassicae);疫霉属(Phytophthora)种,例如马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans);单轴霉属(Plasmopara)种,例如葡萄单轴霉(Plasmopara viticola);假霜霉属(Pseudoperonospora)种,例如葎草假霜霉(Pseudoperonospora humuli)或黄瓜霜霉病菌(Pseudoperonospora cubensis);腐霉菌属(Pythium)种,例如终极腐霉菌(Pythiumultimum);
由例如以下病原体引起的叶斑病和叶萎蔫病:链格孢属(Alternaria)种,例如索兰尼链格孢(Alternaria solani);尾孢属(Cercospora)种,例如病原菌甜菜尾孢菌(Cercospora beticola);枝孢属(Cladiosporium)种,例如黄瓜叶霉病菌(Cladiosporiumcucumerinum);旋孢腔菌属(Cochliobolus)种,例如禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)(分生孢子形式:德氏霉属(Drechslera),同义词:长蠕孢属(Helminthosporium))、水稻旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus);毛盘孢属(Colletotrichum)种,例如豆刺盘孢菌(Colletotrichum lindemuthanium);环黑星霉属(Cycloconium)种,例如油橄榄孔雀斑菌(Cycloconium oleaginum);间座壳属(Diaporthe)种,例如柑橘褐色蒂腐病菌(Diaporthe citri);痂囊腔菌属(Elsinoe)种,例如疮痂病的柑桔痂囊腔菌(Elsinoe fawcettii);盘长孢属(Gloeosporium)种,例如桃树腐烂病菌(Gloeosporium laeticolor);小丛壳属(Glomerella)种,例如炭疽病菌(Glomerellacingulata);球座菌属(Guignardia)种,例如葡萄球座菌(Guignardia bidwelli);小球腔菌属(Leptosphaeria)种,例如十字花科小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、颖枯壳小球腔菌(Leptosphaeria nodorum);间座壳属(Magnaporthe)种,例如稻瘟病菌(Magnaporthegrisea);盘二孢属(Marssonia)种,例如苹果盘二孢(Marssonia coronaria);微结节菌属(Microdochium)种,例如雪霉叶枯菌(Microdochium nivale);球腔菌属(Mycosphaerella)种,例如禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)、花生球腔菌(M.arachidicola)和斐济球腔菌(M.fijiensis);球腔菌属(Phaeosphaeria)种,例如小麦叶枯病菌(Phaeosphaeria nodorum);核腔菌属(Pyrenophora)种,例如圆核腔菌(Pyrenophorateres)、偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici repentis);柱隔孢属(Ramularia)种,例如柱隔孢叶斑病菌(Ramularia collo-cygni)、白斑柱隔孢(Ramularia areola);喙孢属(Rhynchosporium)种,例如大麦云纹病菌(Rhynchosporium secalis);壳针孢属(Septoria)种,例如芹菜壳针孢菌(Septoria apii)、番茄壳针孢菌(Septorialycopersii);核瑚菌属(Typhula)种,例如肉孢核瑚菌(Typhula incarnata);黑星菌属(Venturia)种,例如苹果黑星菌(Venturia inaequalis);
由例如以下病原体引起的根和茎的病害:伏革菌属(Corticium)种,例如禾伏革菌(Corticium graminearum);镰刀菌属(Fusarium)种,例如尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum);禾顶囊壳属(Gaeumannomyces)种,例如小麦全蚀病菌(Gaeumannomycesgraminis);丝核菌属(Rhizoctonia)种,诸如,例如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani);例如由稻帚枝霉(Sarocladium oryzae)引起的帚枝霉属(Sarocladium)病害;例如由小球菌核菌(Sclerotium oryzae)引起的小核菌属(Sclerotium)病害;Tapesia属种,例如Tapesiaacuformis;根串珠霉属(Thielaviopsis)种,例如烟草根黑腐病菌(Thielaviopsisbasicola);
由例如以下病原体引起的肉穗花序和圆锥花序病害(包括玉米穗轴):链格孢属(Alternaria)种,例如链格孢属种(Alternaria spp.);曲霉菌属(Aspergillus)种,例如黄曲霉菌(Aspergillus flavus);分枝孢子菌属(Cladosporium)种,例如支孢样支孢霉(Cladosporium cladosporioides);麦角菌属(Claviceps)种,例如紫色麦角菌(Clavicepspurpurea);镰刀菌属(Fusarium)种,例如大刀镰刀菌(Fusariumculmorum);赤霉菌(Gibberella)种,例如玉米赤霉(Gibberella zeae);小画线壳属(Monographella)种,例如雪腐小画线壳(Monographella nivalis);壳针孢属(Septoria)种,例如小麦颖枯壳针孢菌(Septoria nodorum);
由黑粉菌引起的病害,所述黑粉菌例如轴黑粉菌属(Sphacelotheca)种,例如玉米丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana);腥黑粉菌属(Tilletia)种,例如小麦腥黑穗病菌(Tilletia caries)、小麦矮腥黑穗病菌(T.controversa);条黑粉菌属(Urocystis)种,例如黑麦杆黑穗病菌(Urocystis occulta);黑粉菌属(Ustilago)种,例如裸黑粉菌(Ustilago nuda)、散黑穗病菌(U.nuda tritici);
由例如以下病原体引起的果实腐烂:曲霉菌属(Aspergillus)种,例如黄曲霉菌(Aspergillus flavus);葡萄孢属(Botrytis)种,例如灰葡萄孢(Botrytis cinerea);青霉属(Penicillium)种,例如扩展青霉菌(Penicillium expansum)、产紫青霉(P.purpurogenum);核盘菌属(Sclerotinia)种,例如核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum);轮枝孢属(Verticilium)种,例如黑白轮枝孢(Verticilium alboatrum);
由例如以下病原体引起的种传的和土传的腐败、发霉、萎蔫、腐烂和猝倒病害:链格孢属(Alternaria)种,例如由甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)引起的;丝囊霉属(Aphanomyces)种,例如由根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)引起的;壳二孢属(Ascochyta)种,例如由晶状体壳二孢(Ascochyta lentis)引起的;曲霉菌属(Aspergillus)种,例如由黄曲霉菌(Aspergillus flavus)引起的;分枝孢子菌属(Cladosporium)种,例如由分支胞子菌(Cladosporium herbarum)引起的;旋孢腔菌(Cochliobolus)种,例如由禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)引起的;(分生孢子形式:德氏霉属(Drechslera)、双极霉属(Bipolaris),同义词:长蠕孢属(Helminthosporium));毛盘孢属(Colletotrichum)种,例如由球炭疽菌(Colletotrichum coccodes)引起的;镰刀菌属(Fusarium)种,例如由镰刀菌属(Fusarium culmorum)引起的;赤霉菌(Gibberella)属种,例如由玉米赤霉(Gibberella zeae)引起的;亚大茎点霉属(Macrophomina)种,例如由菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)引起的;小画线壳属(Monographella)种,例如由雪腐小画线壳(Monographella nivalis)引起的;青霉属(Penicillium)种,例如由扩展青霉菌(Penicillium expansum)引起的;茎点霉属(Phoma)种,例如由病原黑胫茎点霉(Phoma lingam)引起的;拟茎点霉属(Phomopsis)种,例如由大豆拟茎点霉(Phomopsissojae)引起的;疫霉属(Phytophthora)种,例如由恶疫霉(Phytophthora cactorum)引起的;核腔菌属(Pyrenophora)种,例如由麦类核腔菌(Pyrenophora graminea)引起的;梨孢属(Pyricularia)种,例如由稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)引起的;腐霉菌属(Pythium)种,例如由终极腐霉(Pythium ultimum)引起的;丝核菌属(Rhizoctonia)种,例如由立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)引起的;根霉菌属(Rhizopus)种,例如由稻根霉菌(Rhizopusoryzae)引起的;小菌核属(Sclerotium)种,例如由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起的;壳针孢属(Septoria)种,例如由小麦颖枯壳针孢菌(Septoria nodorum)引起的;核瑚菌属(Typhula)种,例如由肉孢核瑚菌(Typhula incarnata)引起的;轮枝孢属(Verticillium)种,例如由棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)引起的;
由例如以下病原体引起的癌症(cancer)、虫瘿和扫帚病(witches’broom)病害:丛赤壳属(Nectria)种,例如仁果干癌丛赤壳菌(Nectria galligena);
由例如以下病原体引起的萎蔫病害:链核盘菌属(Monilinia)种,例如核果链核盘菌(Monilinia laxa);
由例如以下病原体引起的叶疱病或卷叶病病害,外担子菌属(Exobasidium)种,例如坏损外担菌(Exobasidium vexans);
外囊菌属(Taphrina)种,例如畸形外囊菌(Taphrina deformans);
木本植物的退行性病害:由例如根霉格孢菌(Phaemoniella clamydospora)、Phaeoacremonium aleophilium和Fomitiporia mediterranea引起的埃斯卡(Esca)病害;由例如侧弯孢壳属(Eutypa lata)引起的葡萄顶枯病(Eutypa dyeback);由例如岛灵芝(Ganoderma boninense)引起的灵芝属(Ganoderma)病害;由例如木硬孔菌(Rigidoporuslignosus)引起的硬孔菌属(Rigidoporus)病害;
由例如以下病原体引起的花和种子的病害:葡萄孢属(Botrytis)种,例如灰葡萄孢(Botrytis cinerea);
由例如以下病原体引起的植物块茎病害:丝核菌属(Rhizoctonia)种,例如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani);长蠕孢菌属(Helminthosporium)种,例如茄病长蠕孢(Helminthosporium solani);
由例如以下病原体引起的根肿病病害:根肿菌属(Plasmodiophora)种,例如芸薹根肿菌(Plamodiophora brassicae);
由细菌性病原体引起的病害,所述细菌性病原体例如,黄单胞菌属(Xanthomonas)种,例如稻黄单胞菌白叶枯致病变种(Xanthomonas campestris pv.oryzae);假单胞菌属(Pseudomonas)种,例如丁香假单胞菌黄瓜致病变种(pseudomonas syringaepv.lachrymans);欧文氏(Erwinia)种,例如噬淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)。
优选地可防治大豆的以下病害:
由例如以下病原体引起的位于叶、茎、荚和种子上的真菌病害,如链格孢属叶斑病(Alternaria leaf spot)(Alternaria spec.atrans tenuissima)、炭疽病(Colletotrichum gloeosporoides dematium var.truncatum)、褐斑病(大豆壳针孢(Septoria glycines))、尾孢属叶斑病和叶枯病(Cercospora leaf spot and blight)(菊池尾孢(Cercospora kikuchii))、笄霉属(Choanephora)叶枯病(漏斗笄霉(Choanephorainfundibulifera trispora(同义词))、dactuliophora叶斑病(Dactuliophoraglycines)、霜霉病(downy mildew)(东北霜霉(Peronospora manshurica))、德氏霉属(drechslera)枯萎病(Drechslera glycini)、蛙眼病叶斑病(大豆尾孢(Cercosporasojina))、小光壳属(leptosphaerulina)叶斑病(三叶草小光壳(Leptosphaerulinatrifolii))、叶点霉属(phyllostica)叶斑病(大豆生叶点霉(Phyllosticta sojaecola))、荚和茎枯萎病(大豆拟茎点霉(Phomopsis sojae));白粉病(扩散叉丝壳(Microsphaeradiffusa))、棘壳孢属(pyrenochaeta)叶斑病(Pyrenochaeta glycines)、丝核菌属地上部分、叶枯病和立枯病(立枯丝核菌(Rhizoctonia solani))、锈病(豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)、山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae))、痂病(大豆痂圆孢(Sphacelomaglycines))、匍柄霉属(stemphylium)叶枯病(匍柄霉(Stemphylium botryosum))、靶斑病(target spot)(山扁豆生棒孢(Corynespora cassiicola))。
由例如以下病原体引起的根部和茎基部的真菌病害,如黑根腐病(black rootrot)(Calonectria crotalariae)、炭腐病(菜豆生壳球孢(Macrophomina phaseolina))、镰孢属枯萎病或萎蔫、根腐病以及荚和根颈腐烂((尖镰孢(Fusarium oxysporum)、直喙镰孢(Fusarium orthoceras)、半裸镰孢(Fusarium semitectum)、木贼镰孢(Fusariumequiseti))、mycoleptodiscus根腐病(Mycoleptodiscus terrestris)、新赤壳属(neocosmospora)(侵菅新赤壳(Neocosmopspora vasinfecta))、荚和茎枯病(菜豆间座壳(Diaporthe phaseolorum))、茎溃疡(大豆北方茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorumvar.caulivora))、疫霉属腐病(大雄疫霉(Phytophthora megasperma))、褐茎腐病(大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata))、腐霉菌属腐病(瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、群结腐霉(Pythiummyriotylum)、终极腐霉(Pythium ultimum))、丝核菌属根腐病、茎腐和猝倒病(立枯丝核菌(Rhizoctonia solani))、核盘菌茎腐病(核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum))、核盘菌白绢病(Sclerotinia rolfsii)、根串珠霉属根腐病(根串珠霉(Thielaviopsis basicola))。
本发明的杀真菌组合物可用于治疗性或保护性/预防性地防治植物病原真菌。因此,本发明还涉及通过使用本发明的组合物而防治植物病原真菌的治疗性和保护性方法,其中将本发明的组合物施用于种子、植物或植物部分、果实或植物生长的土壤。
所述组合物在防治植物病害所需的浓度下可被植物良好的耐受,这一事实使得其能够处理植物的地上部分、繁殖的根状茎和种子以及土壤。
根据本发明可处理所有的植物和植物部分,包括栽培种和植物品种(无论是否受植物品种或植物育种者权利的保护)。栽培种和植物品种可以是通过常规的繁殖和育种方法而获得的植物,所述常规的繁殖和育种方法可通过一种或多种生物技术方法来辅助或补充,例如通过使用双单倍体、原生质体融合、随机和定向诱变、分子或遗传标记物,或通过生物工程和基因工程方法。
在一些实施方案中,本文公开的组合物用于增强植物生长、植物活力和/或作物产量。“产量”应理解为由植物产生的任何具有经济价值的植物产物,例如谷粒、适当意义上的果实、蔬菜、坚果、谷粒、种子、木材(例如,在造林植物的情况下)或甚至花(例如,在园艺植物、观赏植物的情况下)。此外,植物产物可以在收获后进一步被利用和/或加工。
根据本发明,植物,特别是农业、造林和/或观赏植物的“增加的产量”是指与在相同条件下但不施用本发明的组合物所产生的植物的相同产物的产量相比,相应植物的产物的产量增加了可测量的量。增加的产量尤其可以通过以下植物的改善特性来表征:
·植物重量增加,
·株高增加,
·生物量增加,如鲜重和/或干重增加,
·谷粒产量更高,
·更多分蘖,
·叶子更大,
·嫩枝生长增加,
·蛋白质含量增加,
·油含量增加,
·淀粉含量增加。
·色素含量增加
根据本发明的一个实施方案,产量增加至少5%。根据本发明的另一个实施方案,产量增加至少10%。根据本发明的另一个实施方案,产量增加至少15%。根据本发明的另一个实施方案,产量增加至少30%。根据本发明的另一个实施方案,产量增加至少40%。
植物状况的另一个指标是“植物活力”。植物活力体现在几个方面,如一般的视觉外观。改善的植物活力尤其可以通过以下植物的改善特性来表征:
·改善的植物生命力,
·改善的植物生长,
·改善的植物发育,
·改善的视觉外观,
·改善的植物直立性(减少植物节数/倒伏),
·改善的出苗,
·根系生长增强和/或根系更加发达,
·结瘤,特别是根瘤菌结瘤增强,
·更大的叶片,
·植物大小增加,
·植物重量增加,
·株高增加,
·分蘖数增加,
·嫩枝生长增加,
·根系生长增加(延伸根系),
·根质量大小增加(延伸根系),
·当生长在贫瘠的土壤或不利的气候条件下时,产量增加,
·光合活性增强,
·颜色变化(如色素含量(如叶绿素含量)增加),
·开花更早,
·结果更早,
·发芽更早和更好,
·谷粒成熟更早(提前),
·改善的自我防卫机制,
·非生产性分蘖更少,
·死基生叶更少,
·所需投入更少(如肥料或水),
·叶子更绿和绿叶面积增加,
·在缩短的植被期下完全成熟,
·所需肥料更少,
·所需种子更少,
·更容易收获,
·更快和更均匀的成熟,
·更长的保质期,
·更长的圆锥花序,
·延缓衰老,
·更强壮和/或更高产的分蘖,
·成分的可提取性更好,
·种子质量提高(用于在接下来的种子生产季节播种),
·乙烯产量降低和/或植物对乙烯接收的抑制,
·叶子细长,
·穗数/m2增加。
根据本发明的植物活力的改善特别意指任何一种或几种或所有上述植物特性的改善独立于组合物或活性成分的杀虫作用而得到改善。提高的活力可以例如导致更高百分数的可移植到田地的植物或增加数量的可销售的植物(例如番茄)。
在某些方面,本发明的组合物以每公顷约1×104至约1×1014菌落形成单位(CFU)、每公顷约1×104至约1×1012菌落形成单位(CFU)、每公顷约1×104至约1×1010菌落形成单位(CFU)、每公顷约1×104至约1×108菌落形成单位(CFU),每公顷约1×106至约1×1014菌落形成单位(CFU),每公顷约1×106至约1×1012菌落形成单位(CFU),每公顷约1×106至约1×1010菌落形成单位(CFU),每公顷约1×106至约1×108菌落形成单位(CFU),每公顷约1×108至约1×1014菌落形成单位(CFU),每公顷约1×108至约1×1012菌落形成单位(CFU),或每公顷约1×108至约1×1010菌落形成单位(CFU)施用。
在其他方面,本发明的组合物以每公顷约1×106至约1×1014菌落形成单位(CFU)、每公顷约1×106至约1×1012菌落形成单位(CFU)、每公顷约1×106至约1×1010菌落形成单位(CFU)、每公顷约1×106至约1×108菌落形成单位(CFU)施用。在又其他方面,本发明的组合物以每公顷约1×109至约1×1013菌落形成单位(CFU)施用。在一个方面,本发明的组合物以每公顷约1×1010至约1×1012菌落形成单位(CFU)施用。
在某些实施方案中,本发明的组合物以每公顷约0.1kg至约20kg发酵固体施用。在一些实施方案中,本发明的组合物以每公顷约0.1kg至约10kg发酵固体施用。在其他实施方案中,本发明的组合物以每公顷约0.25kg至约7.5kg发酵固体施用。在又一些实施方案中,本发明的组合物以每公顷约0.5kg至约5kg发酵固体施用。本发明的组合物还可以以每公顷约1kg或约2kg发酵固体施用。
当被植物良好的耐受性时,本发明的组合物具有有利的恒温动物毒性且可被环境良好的耐受,适用于保护植物和植物器官,用于提高采收产量,改善采收材料的品质。优选地将它们用作作物保护组合物。它们对一般敏感且具有抗性的物种具有活性,并且对所有的或一些发育阶段具有活性。
可根据本发明进行处理的植物包括以下主要作物植物:玉米、大豆、苜蓿、棉花、向日葵、芸苔属(Brassica)油料种子如甘蓝型油菜(Brassica napus)(例如加拿大油菜(canola)、油菜籽)、芜青(Brassica rapa)、芥菜型油菜(B.juncea)(例如(田)芥菜)和埃塞俄比亚芥(Brassica carinata))、槟榔科种(Arecaceae sp.)(例如油棕、椰子)、稻、小麦、糖用甜菜、甘蔗、燕麦、黑麦、大麦、粟和高粱、黑小麦、亚麻、坚果、葡萄和藤本植物以及各种植物分类单位的各种水果和蔬菜,例如蔷薇科种(Rosaceae sp.)(例如仁果类水果如苹果和梨,还有核果类水果如杏、樱桃、扁桃、李子和桃,以及浆果类水果如草莓、覆盆子、红加仑和黑加仑以及醋粟)、茶藨子科种(Ribesioidae sp.)、胡桃科种(Juglandaceae sp.)、桦木科种(Betulaceae sp.)、漆树科种(Anacardiaceae sp.)、壳斗科种(Fagaceae sp.)、桑科种(Moraceae sp.)、木犀科种(Oleaceae sp.)(例如橄榄树)、猕猴桃科种(Actinidaceaesp.)、樟科种(Lauraceae sp.)(例如鳄梨、樟属、樟脑)、芭蕉科种(Musaceae sp.)(例如香蕉树和香蕉种植园)、茜草科种(Rubiaceae sp.)(例如咖啡)、山茶科种(Theaceae sp.)(例如茶)、梧桐科种(Sterculiceae sp.)、芸香科种(Rutaceae sp.)(例如柠檬、橙子、柑橘和葡萄柚);茄科种(Solanaceae sp.)(例如番茄、马铃薯、胡椒、辣椒、茄子、烟草)、百合科种(Liliaceae sp.)、菊科种(Compositae sp.)(例如莴苣、朝鲜蓟和菊苣——包括根菊苣、菊苣(endive)或普通菊苣)、伞形科种(Umbelliferae sp.)(例如胡萝卜、欧芹、芹菜和块根芹)、葫芦科种(Cucurbitaceae sp.)(例如黄瓜——包括腌食用小黄瓜、南瓜、西瓜、葫芦和甜瓜)、葱科种(Alliaceae sp.)(例如韭和洋葱)、十字花科种(Cruciferae sp.)(例如白球甘蓝、红球甘蓝、西兰花(broccoli)、花椰菜(cauliflower)、抱子甘蓝、小白菜、球茎甘蓝、小萝卜、辣根、水芹和大白菜)、豆科种(Leguminosae sp.)(例如花生、豌豆、扁豆和菜豆——例如刀豆和蚕豆)、藜科种(Chenopodiaceae sp.)(例如唐莴苣、饲用甜菜、菠菜、甜菜根)、亚麻科种(Linaceae sp.)(例如大麻(hemp))、大麻科种(Cannabeacea sp.)(例如印度大麻(cannabis))、锦葵科种(Malvaceae sp.)(例如秋葵、可可)、罂粟科(Papaveraceae)(例如罂粟)、天门冬科(Asparagaceae)(例如芦笋);园艺和森林中的有用植物和观赏植物,包括草皮、草坪、牧草和甜叶菊(Stevia rebaudiana);以及在每种情况下,这些植物的基因修饰型。
在某些方面,发酵产物还包括制剂成分。所述制剂成分可以为润湿剂、填充剂、溶剂、自发性促进剂、乳化剂、分散剂、防冻剂、增稠剂和/或佐剂。在一个实施方案中,所述制剂成分是润湿剂。在其他方面,发酵产物是冻干粉末或喷雾干燥的粉末。
本发明的组合物可包括制剂成分,其被添加到本发明的组合物中以改善回收、功效或物理性质和/或帮助加工、包装和施用。这样的制剂成分可单独添加或组合添加。
所述制剂成分可被添加到包括细胞、无细胞制品、分离的化合物和/或代谢物的组合物中以改善功效、稳定性、物理性质、可用性和/或促进加工、包装和终端使用应用。这样的制剂成分可包括农业上可接受的载体、惰性物质、稳定剂、防腐剂、营养物或物理性质改良剂,其可被单独地添加或组合添加。在一些实施方案中,载体可包括液体材料,例如水、油和其他有机或无机溶剂,以及固体材料,例如矿物质、聚合物或通过生物方法或通过化学合成获得的聚合物复合物。在一些实施方案中,制剂成分为促进组合物与植物部分(例如叶、种子或根)粘附的粘合剂、佐剂或胶黏剂。参见例如Taylor,A.G.,et al.,“Concepts andTechnologies of Selected Seed Treatments,”Annu.Rev.Phytopathol.,28:321-339(1990)。稳定剂可包括抗结块剂、抗氧化剂、抗沉降剂、消泡剂、干燥剂、防护剂或防腐剂。营养物可包括碳、氮和磷源,例如糖、多糖、油、蛋白质、氨基酸、脂肪酸和磷酸盐。物理性质改良剂可包括填充剂、润湿剂、增稠剂、pH修饰剂、流变改性剂、分散剂、佐剂、表面活性剂、成膜剂、助水溶剂、增洁剂(builder)、抗冻剂或着色剂。在一些实施方案中,可使用水作为稀释剂或不使用水,在没有任何其他制剂制品的情况下直接使用包括由发酵产生的细胞、无细胞制品或代谢物的组合物。在一个特定的实施方案中,将润湿剂、分散剂添加到发酵固体,例如冻干粉末或喷雾干燥粉末。在一些实施方案中,在浓缩发酵液之后和/或在干燥期间和/或之后加入制剂惰性成分。当被施用到表面时,润湿剂增加活性成分的扩散和透过性质,或分散剂增加活性成分的分散性和溶解性(一旦被稀释)。示例性的润湿剂是本领域技术人员已知的并且包括磺基琥珀酸酯及其衍生物,例如MULTIWETTM MO-70R(Croda Inc.,Edison,NJ);硅氧烷,例如
Figure BDA0003332181630000311
(Evonik,德国);非离子型化合物,例如ATLOXTM 4894(Croda Inc.,Edison,NJ);烷基多聚葡萄糖苷,如
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3001(Huntsman International LLC,The Woodlands,Texas);C12-C14醇乙氧基化物,例如
Figure BDA0003332181630000313
15-S-15(The Dow Chemical Company,Midland,Michigan);磷酸酯,例如
Figure BDA0003332181630000314
BG-510(Rhodia,Inc.);和烷基醚羧酸酯,例如EMULSOGENTM LS(ClariantCorporation,North Carolina)。
保藏信息
本发明的类芽孢杆菌属种菌株的样品已根据布达佩斯条约保藏于农业研究机构培养物保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection),其位于美国伊利诺伊州,皮奥里亚市,北部大学街1815号,美国农业部农业研究服务局,农业应用研究国家中心(NRRL),邮编61604。类芽孢杆菌属种NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种NRRL B-67723和类芽孢杆菌属种NRRL B-67724各自于2018年12月4日保藏。类芽孢杆菌属种NRRL B-50374于2010年5月18日保藏。
类芽孢杆菌属种菌株被保藏在这样的条件下,即确保在该专利申请的在审期间,由专利和商标专员根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122确定的有资格的人能够获得培养物。然而,应当理解,可获得保藏物并非许可在违背政府授予的专利权的情况下实施本发明。
以下给出的实施例仅用于本发明的说明性和非限制性目的。
实施例
实施例1.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721、NRRL B-67723和NRRL B-67724对黄瓜白粉菌的抗真菌活性
将类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724以及若干其他类芽孢杆菌属种菌株在基于大豆的培养基中培养,以产生全肉汤。将全肉汤在水和有机溶剂的混合物中稀释至20%的浓度。将稀释的全肉汤施用于幼株,随后将幼株暴露于黄瓜白粉菌(PODOXA)(也称为黄瓜白粉病)的接种物。
暴露于植物病原体接种物几天后,相对于未处理的对照植物,对每株植物的病原体防治百分数进行评分。每个处理重复评估三次,并报告平均防治百分数。
之前已在几轮初始筛选中对所有菌株的抗真菌活性进行了评估,结果均优于其他类芽孢杆菌属种菌株。本分析代表了后续一轮筛选,以进一步缩小具有优异抗真菌活性的候选菌株列表。在该后续分析中,类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724属于具有最大抗真菌活性的类芽孢杆菌属菌株(参见图1)。
实施例2.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721、NRRL B-67723和NRRL B-67724对灰葡萄孢的抗真菌活性
将类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRLB-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724在基于大豆的培养基中培养,以产生全肉汤,将全肉汤在水和有机溶剂的混合物中稀释至20%和5%的浓度。将稀释的全肉汤施用于幼株,随后将幼株暴露于灰葡萄孢(BOTRCI)(也称为灰霉病)接种物。
暴露于植物病原体的接种物几天后,相对于未处理的对照植物,对每株植物的病原体防治百分数进行评分。每个处理重复评估三次,并报告平均防治百分数。重复几次该分析,代表性结果参见表1。类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724对灰葡萄孢(BOTRCI)表现出一致的高抗真菌活性。
表1.用稀释率为20%和5%的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724实现的对灰葡萄孢(BOTRCI)的防治。
处理 施用率 平均防治百分数
类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374 20% 98
5% 85
类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721 20% 88
5% 0
类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723 20% 98
5% 68
类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724 20% 60
5% 50
实施例3.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721、NRRL B-67723和NRRL B-67724对小麦叶锈菌的抗真菌活性
将类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724在基于大豆的培养基中培养,以产生全肉汤,将全肉汤在水和有机溶剂的混合物中稀释至20%和5%的浓度。将稀释的全肉汤施用于幼株,随后将幼株暴露于小麦叶锈菌(PUCCRT)(也称为小麦叶锈病)接种物。
暴露于植物病原体接种物几天后,相对于未处理的对照植物,对每株植物的病原体防治百分数进行评分。每个处理重复评估三次,并报告平均防治百分数。重复几次该分析,代表性结果参见表2。类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724对灰葡萄孢(BOTRCI)表现出一致的高抗真菌活性。
表2.用稀释率为20%和5%的类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724实现的对小麦叶锈菌(PUCCRT)的防治。
处理 施用率 平均防治百分数
类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374 20% 77
5% 17
类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721 20% 80
5% 17
类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723 20% 65
5% 25
类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724 20% 80
5% 50
实施例4.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721、NRRL B-67723和NRRL B-67724中杀镰孢菌素和十三肽菌素生物合成基因簇的分析
对类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721、NRRL B-67723和NRRL B-67724的基因组进行测序,并分析了是否存在编码负责抗微生物化合物生物合成的蛋白质的已知基因簇。该分析显示,四种菌株中的每一种都具有杀镰孢菌素合成酶(fusA),其与其他菌株中发现的杀镰孢菌素合成酶具有至少90.5%序列同一性(参见表3)。此外,所有四种菌株都具有十三肽菌素基因簇。之前曾有报告称,在土地类芽胞杆菌的实验室菌株中鉴定出十三肽菌素基因簇。Lohans CT,van Belkum MJ,Cochrane SA,Huang Z,Sit CS,McMullen LM,and Vederas JC.(2014)Biochemical,Structural,and GeneticCharacterization of Tridecaptin A1,an Antagonist of Campylobacterjejuni.ChemBioChem 15:243-249。十三肽菌素生物合成基因簇包含triA、triB、triC、triD和triE。在四种菌株中的每一种中,编码非核糖体肽合成酶(NRPS)TriE的基因与在其他菌株中发现的基因具有至少90.0%的序列同一性(参见表4)。表5和表6分别列出了四种菌株的fusA和triE基因的核苷酸序列。不希望受任何理论的束缚,在这些菌株中的杀镰孢菌素和十三肽菌素的表达可能有助于它们有效地定殖植物和预防植物病害的能力。
表3.使用快速傅立叶变换(MAFFT)通过多重比对为来自类芽孢杆菌属种菌株NRRLB-50374、NRRL B-67721、NRRL B-67723和NRRL B-67724的fusA基因创建的同一性百分数矩阵。
Figure BDA0003332181630000351
表4.使用MAFFT为来自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721、NRRLB-67723和NRRL B-67724的triE基因创建的同一性百分数矩阵。
Figure BDA0003332181630000361
表5.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721、NRRL B-67723和NRRL B-67724中编码杀镰孢菌素合成酶(fusA)的基因的核苷酸序列。
Figure BDA0003332181630000371
Figure BDA0003332181630000381
Figure BDA0003332181630000391
Figure BDA0003332181630000401
Figure BDA0003332181630000411
Figure BDA0003332181630000421
Figure BDA0003332181630000431
Figure BDA0003332181630000441
Figure BDA0003332181630000451
Figure BDA0003332181630000461
Figure BDA0003332181630000471
Figure BDA0003332181630000481
Figure BDA0003332181630000491
Figure BDA0003332181630000501
Figure BDA0003332181630000511
Figure BDA0003332181630000521
Figure BDA0003332181630000531
Figure BDA0003332181630000541
Figure BDA0003332181630000551
Figure BDA0003332181630000561
Figure BDA0003332181630000571
Figure BDA0003332181630000581
Figure BDA0003332181630000591
Figure BDA0003332181630000601
Figure BDA0003332181630000611
Figure BDA0003332181630000621
Figure BDA0003332181630000631
Figure BDA0003332181630000641
Figure BDA0003332181630000651
Figure BDA0003332181630000661
Figure BDA0003332181630000671
Figure BDA0003332181630000681
Figure BDA0003332181630000691
Figure BDA0003332181630000701
Figure BDA0003332181630000711
Figure BDA0003332181630000721
Figure BDA0003332181630000731
Figure BDA0003332181630000741
Figure BDA0003332181630000751
Figure BDA0003332181630000761
Figure BDA0003332181630000771
Figure BDA0003332181630000781
表6.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721、NRRL B-67723和NRRL B-67724中编码参与十三肽菌素生物合成的NRPS(triE)基因的核苷酸序列。
Figure BDA0003332181630000801
Figure BDA0003332181630000811
Figure BDA0003332181630000821
Figure BDA0003332181630000831
Figure BDA0003332181630000841
Figure BDA0003332181630000851
Figure BDA0003332181630000861
Figure BDA0003332181630000871
Figure BDA0003332181630000881
Figure BDA0003332181630000891
Figure BDA0003332181630000901
Figure BDA0003332181630000911
Figure BDA0003332181630000921
Figure BDA0003332181630000931
Figure BDA0003332181630000941
Figure BDA0003332181630000951
Figure BDA0003332181630000961
Figure BDA0003332181630000971
Figure BDA0003332181630000981
Figure BDA0003332181630000991
实施例5.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721、NRRL B-67723和NRRL B-67724中杀镰孢菌素的特征
类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721、NRRL B-67723和NRRL B-67724的全肉汤培养物通过如实施例1-3中在基于大豆的培养基中培养每种菌株来制备。制备了全肉汤培养物的细胞提取物,并在每种细胞提取物中定量了杀镰孢菌素样化合物。
使用超高效液相色谱/质谱三重飞行时间(UPLC/MS三重TOF)的的色谱方法对细胞提取物中的杀镰孢菌素样分子进行片段化和定量:柱子:YMC-Triart C8,4.6x 50mm,12nm;水(0.1%甲酸)和乙腈(0.1%甲酸);梯度(%B):0-5min 10-70%;洗涤。分析从AB SCIEXTRIPLE
Figure BDA0003332181630001001
质谱仪获得的质量碎片模式,以确认每种杀镰孢菌素样化合物的同一性。分析的杀镰孢菌素样化合物包括杀镰孢菌素A(“Fus A”)、杀镰孢菌素B(“Fus B”)、杀镰孢菌素C(“Fus C”)、杀镰孢菌素D(“Fus D”)、LiF05a、LiF05b、LiF06a、LiF06b、LiF07a和LiF07b。这些化合物描述于WO2016/154297,图3、4和12中列出了它们的结构。用于定量杀镰孢菌素样化合物的分析方法无法区分LiF05a和LiF06a或LiF05b和LiF06b。因此,这两组化合物产生的信号在本文中分别称为LiF05/6a和LiF05/6b。
使用已知浓度的杀镰孢菌素样化合物生成的标准曲线进行定量。根据使用杀镰孢菌素C生成的标准曲线来测定LiF05/6a、LiF05/6b、LiF07a和LiF07b的定量。使用的最低化学标准品的浓度为0.5μg/g。当从细胞提取物中的分析物检测到信号但信号强度低于使用最低标准品产生的信号强度时,确定分析物的量低于定量水平(BLOQ)。每种类芽孢杆菌属种菌株中杀镰孢菌素样化合物的定量结果列于表7中。
表7.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721、NRRL B-67723和NRRL B-67724中杀镰孢菌素样化合物的定量。
Figure BDA0003332181630001011
实施例6.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721和NRRL B-67724中固氮基因簇的分析
类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721和NRRL B-67724的基因组的额外分析揭示了这些菌株也具有固氮基因簇。以前在实验室菌株类芽孢杆菌属种WLY78中报告过固氮基因簇的存在。Wang L,Zhang L,Liu Z,Zhao D,Liu X,et al.(2013)A MinimalNitrogen Fixation Gene Cluster from Paenibacillus sp.WLY78 Enables Expressionof Active Nitrogenase in Escherichia coli.PLoS Genet9(10):e1003865。在类芽孢杆菌属种WLY78中,固氮基因簇包含nifB、nifH、nifD、nifK、nifE、nifN、nifX、hesA和nifV。类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721和NRRL B-67724中发现了类似的基因簇结构。
不希望受任何理论的束缚,在类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721和NRRL B-67724的基因组中存在固氮基因簇可能有助于这些菌株促进植物有效氮吸收和刺激植物生长的能力。
编码固氮蛋白的nifB基因组序列比较表明,各菌株的nifB序列与其他菌株的nifB序列有至少96.9%的序列同一性(参见表8)。三种菌株的nifB序列的核苷酸序列参见表9。
表8.使用MAFFT为来自类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721和NRRLB-67724的nifB基因创建的同一性百分数矩阵。
Figure BDA0003332181630001021
表9.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721和NRRL B-67724中编码固氮蛋白的基因(nifB)的核苷酸序列。
Figure BDA0003332181630001031
Figure BDA0003332181630001041
Figure BDA0003332181630001051
实施例7.类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、NRRL B-67721、NRRL B-67723和NRRL B-67724的促植物生长特性
将类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724在基于大豆的培养基中培养,以产生全肉汤,将全肉汤在水中稀释至20%浓度。在种植时,将稀释的全肉汤作为浇灌液施用于番茄植物。几天后,当番茄幼苗长成幼株时,测量每个处理组中40株完整番茄植物的平均重量和标准偏差。将未处理对照组(“UTC”)和仅用基于大豆的培养基(“培养基”)处理的组纳入分析以进行比较。
有趣的是,类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374,类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721和类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724(其中每一个都具有固氮基因簇),与UTC和培养基对照相比,在番茄植物生长中产生了显著的增加(参见图2)。相比之下,类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723(其不具有固氮基因簇)与UTC和培养基对照相比,没有增加番茄植物生长。
除非另有定义,本文的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。出于所有目的,引用的所有出版物、专利和专利出版物均通过引用的方式全文纳入本文。
应当理解,所公开的发明不限于所描述的特定方法、方案和材料,因为这些可以变化。还应当理解,本文使用的术语仅仅是为了描述特定的实施方案,而不是为了限制本发明的范围,本发明的范围将仅由所附的权利要求来限制。
本领域技术人员仅使用常规实验方法,就将了解或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等价物。这样的等价物意欲被以下权利要求所涵盖。
序列表
<110> Bayer CropScience LP
<120> 类芽孢杆菌属菌株及其使用方法
<130> BCS189006 WO
<150> 62815069
<151> 2019-03-07
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23727
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)
<400> 1
atgaatgaca tgcagttata tgatttaaca aatgcgcaga agcgtatatg gtataccgaa 60
ttactctacc cagatacgtc agtgtcacag ctttccggta cagctaagat gaaggggcat 120
atcaatattg ctgcctttat gcagtccatt aatttgatta tcaaacagta tgatgcgttc 180
cgcatccgta ttacctcagt ggatggagtg cctcagcagt acgtcgttcc ttatgaagag 240
agacagctgg agtgcctgga tcttagccac tatgaaagtg tatctgaggt ggaagcctta 300
cttgagcaac acaaaagcaa acctttgccc ctgctggatt ctgagctctt ccagttttta 360
attgtgaaga ttagcgagga agagtattgg attaatatca agatgcacca tattatttct 420
gacggaatat caatggtggt ctatggcaat cagctgacaa cattttacat ggagttaatt 480
caaggaaatg aaccgaagct gggcgacgat tgctcgtata ttcaatatat tgcagatgag 540
aatgcatacg aactttctga cagataccaa aaggataagg cttactggct ggataaattt 600
tctgatttgc ctgagcttac gggttggaag tcatataatc cgttatcttt aagcacccac 660
gccgttcggg agcattttac cgtaccagaa gtgctatatc acgagctgca agcattttgc 720
caacagaaca ggatttcttt gttccagttc ttcatgggtg cgatgtatat ctacatacac 780
aaaatgacga atcagccgga tgtggtgatt ggcacttcgt tcgctaaccg ggggaacaaa 840
aaagagaagc aaaagatagg tatgtttgtc agcaccgctg ctgccagaac atacgtcaaa 900
aaggatatgg atgtgttgag cttcctgcag gatgtagcca gagatcagat gtcagtcctg 960
cggcatcaga agtatccgta caatcagtta attcaggatc ttagagaaat gcatggtaac 1020
aaggatattc agcggctttt tggcgtttca atggaatatc gtcttatcaa ttgggttgat 1080
ttggatgatg tgcgcatttt gacggattat gatttctgcg gggacgaagt gaacgatttc 1140
gtgcttcata tcgtggagat cctggatgaa ggcgaactgg tactggatgt cgattatcgg 1200
acggagctgt ttgaacgcag tgaagttaag gacatggttt cccagttgct tacgatcgcc 1260
gagcagatca ttcattcacc tcagctttct atcgcagagg taaacttatt gggtgaacca 1320
gaagagcagt ccattttggc tctttcggaa ggcgctgcag tcgattatcc acgtgagaag 1380
accatccatg gcttattcga ggaacaagcc gagcgcacgc cagatcacgt agccgttcag 1440
atggacgaac agagcattac atacctagct ctaaacgagc aggctaacca gcttgcgaga 1500
tatttgcgct ccgagggagt agttgcagat acgctcgtag ggattatggc tgaccgttcc 1560
ttggagatgg tcattgggat gttggccatt ttgaaagcag gtggtgccta tgtaccgatt 1620
gaccccgatt atcccgagga acgtatccat tatatgctgg aggattcagg ggtccgtctg 1680
ttgctcaccc aaagtcatct atgggagagc accacttttg acggaaagct tgtgagtttg 1740
gacgaagcta caacgtatac aggagatgct tccaatctgg agagtatttc gggaccaagc 1800
catctagcct atgttatcta cacgtcgggt acgaccggca agccgaaggg cacgctgatt 1860
gaacacaaaa atgtggttcg actgctcttt aacgataaaa atctatttga tttcagctct 1920
caggatacgt ggacgctatt ccattcgttc tgcttcgatt tctccgtttg ggagatgtac 1980
ggagcgcttc tttacggagg gaaattggtg attgttccat ctctcacagc caagagccca 2040
gcagctttcc tggagttgtt gaaagacaac caagtcacca ttttaaatca gacgccgacg 2100
tatttttatc aggtgctaca ggaagagtta acgcactctt cgacagagct tggccttaga 2160
aaaatcattt ttggtggaga ggccttaagt ccatctcttc tgagaaactg gcgggtcaag 2220
tatcctgatg tgcagctgat taatatgtac ggaattacgg aaacaacggt ccatgtcacc 2280
tacaaggaaa tcacggaaca tgagattgaa gcggggaaaa gcaatattgg cagaacgatc 2340
cccacactta gcgcttatat tctcgatgag caaagacggc tgcagcctgt tggggttccg 2400
ggagagctat acattgcagg ggacggtctt gcccgtgggt atttgaatcg gccggatttg 2460
acgtctgaga aattcgttga gcatccgtat cgggcgggag agcggctgta ccgaactggg 2520
gatcttgctc gttggttgcc tgatggcaat attgaatatt tgggacggat cgaccatcag 2580
gtcaaaattc gcggctaccg aattgagctt ggcgaggtag aagcccaaat tctcaaggct 2640
ccgaacgtac gagaaacgat tgtcctcgca cgggatgacg aacagggcca aaaattgctg 2700
tgcgcctact atgtagcctc cagtgatctt tcgccggggg aattgcggtc tcagctggca 2760
gcggaactcc ccgcttacat gattccttct tattttgtcc ggctggagca aatgccgctt 2820
acgccaaatg gcaaactgga tcgccgtgcg ttgccggctc ctgaaagcag cgtacaatcc 2880
ggcgaggctt atttggctcc gagaactgct gtggaagctc agatggtact catctggcaa 2940
gatatcttgg gagttgcccg cgtcggtgtc agagataatt tctttgaaat tggtggtcac 3000
tctttgcggg caacagtgct cgtttcacgg attcacaaag aattgggatg tagcatttcg 3060
ctgcgtgagg tgtttcagtc acctacggtc gaatccttgg cgcaacttgt gaaaaaacac 3120
attccgaccc tgtacgaatc catcccacag gcaacggaaa gcgaagctta cccagtgtcc 3180
tcagcgcaaa agcggttata cgtgctgaga cagatggatg ggggagagct tagctacaat 3240
atgccagggg ccttcacagt ggatggaccg ttggatcgca cgcggctgga gtccgcgttc 3300
cagggactga tccagcgtca tgaatcccta agaaccggct tttatatgca ggatggagag 3360
cttgttcagc gtgtgcatag gaatgtgccg ttcgcgttga actatacaga ggcttcggtg 3420
gaggagacgg atacgctcat tcacaacttt attcgtgcct ttgatctgag ccaggctcca 3480
ttactgcgtg ttagcttggt gaagctccag gaggagcgtc atctgttgct gtttgatatg 3540
catcacatca tttcagatgg ggtttctatt caaatattga tacaggaact tactcatttg 3600
tatcaaggag aacagctacc agaactgcac atccaataca aggattatgc cgtatggcaa 3660
cgagaacagt cagagaacca atggcaagat cttgagaaat attggctgca atcctttgaa 3720
ggagagttgc cggtattgga tttgcctaca gacttccaac gaccttcagt tcggagcttc 3780
gagggtagcc gaattgattt tacattggat gagtctggaa ataaggcgat acaagagctt 3840
gcatcccgta caggtactac actgtatatg gtattgctgg ccgcttattc ggtactactg 3900
cacaaatata caggacagga ggacatcgtc gtaggttctc cagtagccgg aagaccgcag 3960
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gcaggagata aaacctttca ggattatctt ctggaaatca aggaaacggc gctcaaggcg 4080
tttgagcatc aggattaccc ttttgaaaaa ttggtcgaaa agctgggcgt aggacgtgat 4140
gtcagccgca atccgctctt tgacacctta ttggtattac aaaataccga gcaggaagag 4200
caggatatgg acggagtgca ctttactcct tacttgatgg acaccgtcac agccaaattt 4260
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catgcagtct cggccaatcc tcagttgcaa ctggccgaga ttgaaatgat cacaccggag 4440
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acactgcgtc gtttgggaac gttgagggag cagcctgtgg ccgtgatggg cggacgaagc 4680
attgagatgg tcattggtat gctcgcggtg cttcaggcag gtggagccta tgtgccgatt 4740
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gaacaccgga acgtggtccg tctggtcaaa gagaccaact atgtggagct gaatgaatcc 5040
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gcgttgctta acggtgggca gctctatttt gtagagaatg acgacattct gattgctgat 5160
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gtccctatca attgctatgg tccgacagag aatacgacct tctccaccac ctacaagatt 5400
ccaggttgtg ccgaaggggg tgtgccgatt ggtcgcccaa ttagtaattc gaccgcttat 5460
gtggtcaatg gatcgctgca attacagcct attggtgctt ggggtgaact cattgtcggc 5520
ggtgaaggtg tagcacgcgg atatctcaat cgtcctgatc tcacagcaga gaaatttgtt 5580
cctagtcctg tgaaggacgg agaaccctgc taccgaactg gggatttggt acgctggctt 5640
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caggtgggta tccatgataa tttctttgaa ttgggtggag actccataaa agctatccag 6120
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ggacaagcgc tgacattccc gcagaagacg aattccttcc gtgactgggg agacgccctt 6780
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agcttgttgg aggaaccagc ctatacgcta gatatcaatg gcatggtgac ggacggagcc 7440
ctgactctga cgattactta taacggaaaa cagtataagt tatctacgat ggaacagctc 7500
gctggatata ttgaagaaag cctgcgagag cttctccagc attgcgtaac ccaagaaaaa 7560
accgtattga caccaagcga cgtgcttgcg aagggtctaa gcattgccga tctggaggag 7620
ctttctaagc agatcagcca cataggcgat attgagaatg tatatagtct gacgccgatg 7680
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tccaactatt ggagccgata tctggccggt tacgagcagc agacgctttt acctcaagtc 8280
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ttcatcaata cgattcccgt tcgtgtgaag acagaggaga atctcccctt caccgttctg 8580
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ctagtcgctt atttcgtagc tgctcagaaa cttgaggtat ccgagcttcg ggccgtcctg 10380
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ctgacgtcga acggaaaaat cgatcgaaaa gcgctgcagg gcgagcgtgg atgggcagcg 10500
gcttcatctg aggctccaag gacacctgtg gaaattcaat tagccgaaat ctggcaagag 10560
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ttgacggaag agaagtttgt cgctcatccg tttgaagcgg gcgagcgtat gtaccgctcg 13260
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gatgatcaag aagcttcaac gtattggagc caatatctcg aagattatga cgggaatact 15900
gtattgccgg aaggtaaaac gaaatctcaa gccaaagagg cgggctatgt tctaaaagag 15960
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cacgtgaccg tcaacacact catgcagaca gcttggggac tgattcttca acgttataat 16080
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ataaacggag gaatagtgcg gatttatgat ggtatagata aagcggaggt tgttcagcat 17340
attttgcgcg aaaatgcggt cgatattctc aagctgacgc caacgcatct cagtctgata 17400
aaagacatga ccattccagc ggaaagtcgt attcagcaac tcattgtggg cggagaaaat 17460
ctgaccacac atttgtccaa aacgattacc gacctctttg gtggcaacat caaaatctac 17520
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aatggagaca ttgagtacat tggacgcatt gaccatcaag ttaaaatacg gggctatcgt 17880
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cggacggatg tggagaacat tttggcttca atctggcaag gtgtactcgg cgtgccgctt 18240
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cgtcgtatcc cgaacaaagg tgtcggatat ggtattttga aatatttaag cggcggttct 19440
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caggatcttg caggagggac gatggaagta tcgccttact cagtaggacc tgaggtcagt 19560
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caactttcgg tcagctataa ccgtcatcag ttccacgggg agtctgtggc taagtttgtt 19680
gacattctga agaaccgtct cagcgaagtc attggacatt gcgtaagtaa gaaaagaaca 19740
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ggagaacttc atcagcaggc gaaccgcctt gcacgtacgc tgcgtgccca aggggtcaga 21360
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tttattgggg aaaatgctaa agtactgaga cagatacttg gcaaggtcac agaggcctca 23700
tctaaaaaca agcccatttt gtcctaa 23727
<210> 2
<211> 23727
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)
<400> 2
atgaatgaca tgcagttata tgatttaaca aatgcgcaga agcgtatatg gtataccgaa 60
ttactctacc cagatacgtc agtgtcacag ctttccggta cagctaagat gaaggggcac 120
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cgcatccgta ttacctcagt ggatggagtg cctcagcagt acgtcgtccc ttatgaagag 240
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cttgagcaac acaaaagcaa gcccttgccc ctgttggatt ctgagctctt ccagttttta 360
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gatcaggatt tgcaaggaag ctcgttgcag atttctcctt atccgaccgg aagcgcccaa 7380
agcttgttgg aggaaccggc ctatacgcta gatatcaatg gcatggtgac ggacggagcc 7440
ctgactctga cgattactta taacggaaaa cagtataagt catctacgat ggaacagctc 7500
gctggatata ttgaaaaaag cctgcgggag cttctccagc attgcgtaac ccaagaaaaa 7560
accgtattga caccaagcga cgtgcttgcg aagggtctaa gcattgccga tctggaggag 7620
ctttctaagc agaccagcca cataggcgat attgagaatg tatatagtct gacgccgatg 7680
cagaagggca tgctgttcca tgatatgttt gagccgcata caggtgctta ttttgagcag 7740
gctgcctttg actttaaggg tagctttgat ccgaccgcct tcggacacag tctggatgca 7800
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ttgcaggttg tatttcggca cagaggcgct aaattggtgt acgaagacct gcgtgagatg 7920
aatgcatcgc agcgcgaagc ttacctgaag acatttggtg ctaaggacaa agcacagggc 7980
ttcaacctag ctgaagacga gcttctccgt gtatcaattt tacaaacaga tgaagagagc 8040
ttccgcctct tatggagctt tcaccacatc gtcatggatg gctggtgtgt tccgttaatt 8100
acgcaggagg tatttgaaca ctattttgcc ctcctggaag gaagagagcc gcagctggca 8160
gaggttcatc cgtacagtcg atatatcgaa tggctggaac agcaggatga agcagttgcg 8220
tccaactatt ggagccgata tctggccggt tacgagcagc agacgctttt acctcaagtc 8280
ggtggagcaa gtaagggaga aggctatgta gcagaaaagc tgaattatcc tctcagcagg 8340
gaattgactg agcgccttga aaaggtggcc agggatgctc atgtcacgat gaatatattg 8400
ctgcagtccc tctggggcat tgcgcttcaa cgctacaacg gtagccggga tgtcgtgtac 8460
ggaagtgtag tatcaggccg accagcagaa attccgggca ttgaccggat gatcggtttg 8520
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atgaagcagc agcaggaaca atatatggct tctcatatgt atgacaccta cccgctgttt 8640
gagattcagg ctcagacgga tcagaagcag gatctaatct cccatattat ggtgtttgaa 8700
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gaggaagcgg agcttcttga gcaaacgaat tatgatttta atttaattgt cctccctggc 8820
gaagaaatga gattgctgtt ccagtacaat gcacttgttt atgacccagt gacaattgag 8880
caaatcaagg gccatctggt tcacctcatg gaacaaattg tagagaaccc tgccatttcc 8940
gtggatgcac tagaattagt cacgccgcag gagagagaac agattctgaa cgtatgggga 9000
aatacaaaag gcatttacga gcactgtaac acgttccacg ggctgttgga ggaacaggcg 9060
ggacgaacgc cggatgcgac tgccatttgg ttcgaggacg agagtctgac ctatgccgag 9120
ctcaatgcaa aagccaatgg actggcgaga aggctccgta ctcagggaat caagacggga 9180
gatctggtgg gactgattgc tgaacggtcg ctcgaaatga tcgttgggat ctacggcatt 9240
atgaaagccg ggggtgccta tgttccaatc gatccagagt atccgaaaga acgaatcagt 9300
tacatgcttg aagattccgg ggcgaagcta atccttacac aggcccattt cttggagcat 9360
ctcggatgga cggaaaatgt tttgctgctg gatgaatcat cgacctatga tgccgacacc 9420
tcgaatttgg aggatactgc tggcccggat gatctggctt acgtgatcta tacttcaggt 9480
acgaccggtc agcctaaggg cgtattagtc gagcatcggg gactaccaaa tctttcagac 9540
gtatatgggg cacacttcga agttacaccg caggatcgga tcgttcagtt tgcaagcctg 9600
tcgtttgatg catcggtttc ggaaatttta acggcgctga gccatggggg tgttctgtgc 9660
atcccttcta cagaagatat tttagatcat gccctgttcg agcagttcat gaacgataag 9720
ggggttacgg tagcgacttt gccacccgct tacgctatcc accttgatcc agagcgtttg 9780
ccaacactgc ggtgcctgct aaccgctgga tcggccgcat cggtcgagtt gatcgaagag 9840
tggaggaagc atgtacgtta ctctaatggc tatggcccaa cggaggactc cgtatgcacc 9900
acaatctggt ctgtcccgga cagtgaggaa gcaacggata ttgtatctat tggacgtcct 9960
attgctaacc atagtgtgta catcttggat gaccatttta gattgcaacc tgtcggtgta 10020
gctggagagc tatgcatttc gagtatcgga ttagcacggg ggtatcataa ccagcctgag 10080
ttaatggatg agaaattcgt agacaatccg tttgctccag gagagcgtat gtatcggacg 10140
ggtgacctgg ttcgctggtt accgaatgga accatcgagt acttaggcag aatagatcac 10200
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gtgccgtccg ttcaggaagt cgtagccatg gctgcagagg gcgaagacgg ctacaaagat 10320
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agagcagtgt tcgagtctcc tactattgaa ggattggctc gtgccattga gggctataca 10740
ccgctgaatt tcgaagaaat tcctacagcg ggagcgagag agcattatcc attgtcctcg 10800
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gcctatgaaa accaggatta cccgttcgag gagctggtag acaagctgga gcttcagcgt 11760
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gcgactgcga tctacaaaca agagactgcc cagcggatgg caggccactt tgtacagctt 12000
attcgggaag ccgtctccaa tccgggaatg ccgttgtcat cccttgatat cgtgacacct 12060
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gagcatcttg cctacgtcat ctacacatca ggtacgacag gcaagccaaa gggaacgctg 12600
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tacggagcat tgctgaacgg aggacggttg gtcatcgttc catcgcttac cgcgaagagt 12780
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acgtacttct atcagttgct acaggaagag ctcggtcatc aggcggcaga actgagcctc 12900
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attccaacgc tgcgagcgta cattttggat gaacaacgcc gtccacagcc gattggcatt 13140
ccaggtgaac tttatgtggc gggcgtaggt ctggcgcgag gctatctgaa ccgaccggaa 13200
ttgacggaag agaagtttgt cgctcatccg tttgaagcgg gcgagcgcat gtaccgctcg 13260
ggtgacttgg cacgctggtt gccggatggc agcatggagt atttgggacg gattgaccat 13320
caggttaaaa tccgtggtta ccgtattgag ctgggcgaag tggaagcgaa gctgctccat 13380
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gactccatca aggcgatcca agtgtcctcg agattgttcc aagctggata taaattagag 13800
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ggacgtatag cggaacaggg tgaaattaaa ggtgcagcag agttaatgcc aattcagcgt 13920
tggttctttg aacgccatac agcggagccg caccattata atcatgccgt catgctctat 13980
cggaaagacg gctttgatga ggctgcactc cggttgacaa tggaccaaat tgcgatccat 14040
catgacgcgc tgcgcatggt tttccggcct acagaagctg gatacgcagc ttggaatcgg 14100
ggaacggacg aaggcgagct ctacacattg gacattgccg atatgcagca ggcggaagac 14160
cagacagctg cggttcaagc ccaagccgat gccattcagg caagctttga cttggaaggt 14220
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attcatcacc tcttggttga cggcgtatcc tggcgcatcc tgtttgagga cattgcagcg 14340
gggtacgagc aggcatggaa tggacaagca atcgtccttc cacaaaagac cgattcgtat 14400
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gaaggacatg gacgggaaat gatcgtacca gacctggata ttacccgtac cgtgggttgg 14760
ttcacaaccc agtatccagt tctgctgaac ctgcaaggca gacaggaagt atctgcgcga 14820
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gtagatttgc gcgacgcatc tatgcaggaa caagaagccc gaatcaaggc ttatattgct 15600
gaagatatgg ttaaggggtt cagcttgtca gaagatccgc tgatgcgggt gaccgtcttg 15660
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cacgtaaccg tcaatacact catgcagaca gcttggggac tgattcttca acgttataat 16080
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caaacggagg acaatctcga agttgccaac ttcaccatgt ttgaacaaac caactatgac 16440
tttaacctgg ttgtgattcc aggcgaagac atcaaggtct gcattcgcta taatgcttcg 16500
gtttacgagc aagaaagcat tgcacgtatc ggaggacact tgttgcagat gctcgatcag 16560
gtggctgctc gtccgcaggc gacgatacag gaactggaga ttgtaacatc cgaggaacgg 16620
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caactttcgg tcagctataa ccgtcatcag ctcgacgggg agtccgtgac taagtttgtt 19680
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gaacttacac caagcgatgt actcctcaaa gatatcagct tagaaaagat tgaggagcta 19800
gaagagcaga cacggcatat cggcagtatt gaaaatatgt ataaactaac accgatgcaa 19860
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acacagccat cggcaaaagc agaagcctac gtgtcggaga agctggtatt cacgttggat 20520
gcggaattga ccgatcgcct ggaacaggtg gccaaacagc atcaggtgac gatgaataca 20580
ttgatgcaag cagcctgggg aatcgtgttg cagcgctaca atagaagcca ggatatcgtc 20640
ttcggaagtg tagtatcggg gagacctgcc gagattccgg gtatcgaaag tatgatcggt 20700
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gtgatgaaaa gacagcagga attatatttg gcaggacatg cttatgattc ctatccgctc 20820
tatgagattc aagcacagag cgaacaaaag caagatttga tttctcatat tatggtgttc 20880
gaaaattacc cggtagaaga gcatctggaa gagaaaattg ccagtgaaga ggctgaatac 20940
agaattacgg atgttcagat gtttgaacag acgaattatg attttaacct cattgtgctg 21000
ccgggccgta atctggagtt cttgtaccgt tacaatgccc gcgtctatga tcgggagagc 21060
gtggaacgca ttcaaggaca cttgacgaga attctgacaa gcgttgctgt tcaacctacc 21120
atccgtattg atgagctgga gttgatcacg ccagaagaga aatcgcagat tatagaggtg 21180
tggggcgata cagcagctcc ttatccgcgt gagcagaccc ttcacggtat atttgaggaa 21240
aaagcagcgc tcacaccgga tcgtacagca cttatttacg gtgaaacgga gcttacctat 21300
ggagaacttc atcagcaggc gaaccgcctt gcacgtacgc tgcgtgccca agggatcaga 21360
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gccattctaa aagctggcgg ggcctatgta ccgattgatc cggagttccc agaagatcgt 21480
attcgccaca tgctggagga ttcgggagcg aagcttctgc tgacgaagaa ccatctcaaa 21540
gatcgttttc cgttcactgg cacgatcctg gcacttgatg atccgcaggc gtatcatgcg 21600
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acgaaccgta tcacccatct caatttggtg ccgtcgatgc tcagtgtgct cgttcaatac 21960
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gaagaggaaa tggaaattat ccgcttccca gggaaaggaa cgctcaaagt attttgcttc 23040
cctccacggg taggccactc tctgggatac tatgagatgg cgaaggagct ggaagggctt 23100
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cgatacatcg atgccatcgt ggatattcaa gcagagggtc cgtatatatt cctgggatac 23220
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gttagcgacc ttattatggt agatgctatg agaaagatgt ccaaggatga atcgacaccg 23340
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tttattgggg agaatgctaa agtactgaga cagatacttg gcaaggtcac agaggcttca 23700
tctaataaca agcccatttt gtcctaa 23727
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<211> 23724
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)
<400> 3
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ttactctatc cagatacgtc agtgtcacag ctttccggta cagccaagat gaagggccgt 120
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attgtgaaga ttagcgagga tgagtattgg attaatacca agatgcacca tattatttct 420
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catattgtct cggatggtgt ttctatgaat attctcatag aagagtttct ccgcttctac 11220
caagaggagg acttattacc tgcactacag atccagtaca cagactatgc ggtatggcag 11280
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aaaaacaagc ccattttgtc ctaa 23724
<210> 4
<211> 23727
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)
<400> 4
atgaatgaca tgcagttata tgatttaaca aatgcgcaga agcgtatatg gtataccgaa 60
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cttgagcaac acaaaagaaa acccttgccc ctgctggatt ctgagctctt ccagttttta 360
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caaggaaatg aaccggagct gggcgacgat tgctcgtata ttcaatatat tgcagatgag 540
aatgcatacg aactttctga cagataccaa aaggataagg cttactggct agataaattt 600
tccgatttgc ctgagcttac gggttggaag tcatataatc cgttatcttt aagcacccac 660
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caacagaata ggatttcttt gttccagttc ttcatgggtg cgatgtatat ctacatacac 780
aaaatgacga atcagccgga tgtggtgatt ggcacttcgt tcgctaaccg ggggaacaaa 840
aaagagaagc aaaagatagg tatgttcgtc agcaccgctg ctgccagaac atacgtcaaa 900
aaggatatag atgtgttgag cttcctgcag gatgtagcca gagatcagat gtcagtcctg 960
cggcatcaga aatatccata caatcagtta attcaggatc ttagagaaat gcatgggaac 1020
aaggatattc agcggctttt tggcgtttca atggaatatc gtcttatcaa ttgggttgat 1080
ttggatgatg tgcgtatttt gacagattat gatttctgcg gggacgaagt gaacgatttc 1140
gtgcttcata tcgtggagat cctggatgaa ggcgaactgg tactggatgt cgattatcgg 1200
acagagctgt ttgaacgcag tgaagttaag gacatggttt cccagttgct tacgatcgcc 1260
gagcagatca ttcattcacc tcagctttct atcgcagagg taagcttatt aggtgaacca 1320
gaagagcaat ccattttggc tctttcggaa ggcgccgcag tcgattatcc acgagagaag 1380
accattcatg gcttattcga ggaacaagcc gagcacacgc cagatcacgt agccgttcag 1440
atggacgagc agagcattac ataccaagct ctaaacgagc aggctaacca gcttgcgaga 1500
tatttgcgct ccgagggagt aggggcagat acgctcgtag ggattatggc tgaccgttcc 1560
ttggagatgg tcatcgggat gttggccatt ttgaaagcag gtggtgccta tgtaccaatt 1620
gaccccgatt atcccgaaga gcgtatccac tatatgctgg aggattcagg tgtaagtctg 1680
ttgctcaccc aaagtcatct atgggagagc accacttttg acggaaagct tgtgagtctg 1740
gacgaagctg caacgtatac aggagatgct tccaatctgg agagtatttc gggaccaagc 1800
catctggcct atgttatcta cacgtcgggt acgactggca agccgaaggg cacgctgatt 1860
gaacacaaaa atgtagttcg actgctcttt aacgataaaa atttatttga cttcaactct 1920
caggatacgt ggacgctgtt ccattcgttc tgcttcgatt tctccgtttg ggagatgtac 1980
ggagcgcttc tttacggagg gaaattggtg attgttccat ctctcacagc caagagccca 2040
gcagctttcc tggagttgtt gaaagacaac caagtcacca tcttaaatca gacgccgacg 2100
tatttttatc aggtgctaca ggaagagtta atgcactctt cgacagagct tggccttaga 2160
aaaatcattt ttggtggaga ggctttaagt ccatctcttc tgagaaactg gcgggtcaag 2220
tatcctgatg tgcagctgat taatatgtac ggaattacgg aaacaacggt tcatgtcacc 2280
tataaggaaa tcacggaaca tgagattgaa gcggggaaaa gcaatattgg cagaacgatc 2340
cccacactta gcgcttacat tctcgatgag caaagacgcc tgcagcctgt tggggttcca 2400
ggagagctat acattgcggg agacggtctt gcccgtgggt atttgaatcg gccggatttg 2460
acgtctgaga aattcgttga gcatccgtat cgggtgggag agcggctgta ccgaactggg 2520
gatcttgctc gttggttgcc tgatggcaat attgaatatt tggggcggat cgaccatcag 2580
gtcaaaattc gcggctaccg aattgagctt ggcgaggtag aagcccaaat tctcaaggct 2640
ccaagcgtac gagaaacgat tgtcctcgca cgggaagacg aacagggcca aaaattgctg 2700
tgcgcctact atgtagcctc cagtgacctt tcgccggggg aattgcggtc tcagctggcg 2760
gcggaactcc ccgcttacat gattccttct tattttgtcc ggctggagca aatgccgctt 2820
acaccaaatg gcaaactgga tcgccgtgcg ttgccggctc ctgaaagcag cgtacaatcc 2880
ggtgaggctt atttggctcc gagaactgct gtggaagctc agatggtact catctggcaa 2940
gatatcttgg gcgttgctcg tgtcggtgtc agagataatt tctttgaaat tggtggtcac 3000
tctttgcggg caacagtgct cgtttcacgg attcacaaag aattgggatg tagcatttcg 3060
ctgcgtgagg tgtttcagtc acctacggtc gaatccttgg cgcaacttgt gaaaaaacac 3120
attccgacca tgtacgaatc catcccacag gcaacggaaa gcgaggctta cccagtgtcc 3180
tcagcgcaaa agcggttata cgtgctgaga cagatggacg ggggagagct cagctacaat 3240
atgccagggg tcttcacagt ggatggaccg ttggatcgca cgcggctgga gtctgcgttc 3300
caggcactga tccagcgtca tgaatccctg agaaccggct tttatatgca ggatggagag 3360
cttgttcagc gtgtgcatag gaatgtgccg tttgcgttga actacacaga ggctttggtg 3420
gaggagacgg atacgctcat tcacaacttt attcgtgcct ttgatctgag ccaggctcca 3480
ttactgcgtg ttagcttggt gaagctccag gaggagcgtc atctgttgct gtttgatatg 3540
catcacatca tttcagatgg ggtttctatt caaatattga tagaggaact tactcatttg 3600
tatcaaggag aacagctccc agagctgcac atccagtaca aggattatgc cgtatggcaa 3660
cgggaacagt cagagaacca atggcaagat cttgagaaat attggctgca atcctttgaa 3720
ggagagttgc cggtattgga tttgcctaca gacttccaac gaccttcagt tcggagcttc 3780
gagggtagcc gaattgattt tacattggat gagtctggca ataaggcgat acaagagctt 3840
gcatcccgta caggtactac actgtatatg gtattgctgg ccgcctattc ggtactactg 3900
cacaaatata caggacagga ggacatcgtc gtaggttctc cagtagccgg aagaccgcag 3960
gctgagcttg agggcatcat cgggatgttt gtcaacacac tggccttgcg cagctacccg 4020
gcaggagata aaacctttca ggattatctt ctggaaatca aggaaacggc gctcaaggcg 4080
tttgagcatc aggattaccc ttttgaaaaa ttggtcgaaa agctgggcgt aggacgtgat 4140
gtcagccgca atccgctctt tgacacccta ttggtattac aaaataccga gcaggaagag 4200
caggaaatgg acggagtgca ctttactcct tacttgatgg acaccgtcac agccaaattt 4260
gacctgtccc tcaatgtaga ggagaagggg tcaaaattag cctttggcct cgagtatagt 4320
acggctttat atcggcgtga aaccgtagag cgacttgcaa cgcacttgct ccgggttctg 4380
catgcagtct cggccaatcc tcagttgcaa ctggccgaga tagaaatgat cacaccggag 4440
gagaaagtac agatcgttga agtatttaac gcgacatcgg ctccttatcc aagggacaag 4500
accattcatg agctgttcgt agaacaagtc aatcgtacac cagagcagac ggcgcttgta 4560
ttcggcgatg tccagctaac gtaccttgaa ttgcaagaca aggcgagccg actggcccaa 4620
acactgcgtc gtttgggaac gttgagggag cagcctgtgg ccgtgatggg cggacgaagc 4680
attgagatgg tcattggtat gctcgcggtg cttcaagcgg gtggagccta tgtgccgatt 4740
gatcctgatt acccggaaga tcgggttcgt tatatgctta atgattccga cgccaagcta 4800
ttattggtgc aaaagggcga gcttataagt gtagactacg gtataccgat tgtcgatctt 4860
agcagtgaag aggcctatgc agctgaacct gcccagccgg agactgctca gggatcgcag 4920
gggcttgctt atgtcatcta tacatcgggt acgacgggta gaccgaaggg cgttatggtt 4980
gaacaccgga acgtggtccg tctagtcaaa gagaccaact atgtggagct gaatgaatcc 5040
acacgaattt tgcagacagg agccgtggcc tttgatgctt ctacattcga aatatgggga 5100
gcgttactta acggtgggca gctctatttc gtggagaacg acgatatcct gattgccgat 5160
aggctaaaag cggccattac caagtacggg attacaacaa tgtggcttac ttcaccgctt 5220
ttcaatcagc tttccctgca ggatgagtac ctgttcagag ggctaaaaac attgctggtc 5280
ggcggagacg tactgtccat atctcatatg aaccgtgtaa tcgaggctaa tcctgatctt 5340
gtccctatca atggctatgg tccgacagag aatacgacct tctccaccac ctacaagatt 5400
ctgggtcgtg ccgaaggggt cgtgccgatt ggccgcccaa ttagtaattc taccgcttat 5460
gtggtcaatg gatcgctgca attacagcct attggtgctt ggggtgaact cattgtcggc 5520
ggtgaaggtg tagcgcgcgg atatctcaat cgtcctgatc tcacagcaga gaaatttgtt 5580
cctagtcctg tgaaggacgg agaaccctgc tacagaactg gggatttggt acgctggctt 5640
ccagatggga atttggagtt taaaggaaga attgatgagc aggtcaaaat acgtggttac 5700
cgcatcgaac tccctgaaat cgaggcccaa ctggccaaga tggagtcagt aatcgacgcc 5760
gtagtggtcg ttcgcgcgga tgagcttggc gagaagcaac tttgcgctta ttatgtggcg 5820
gatcgtacgc tcacggcagg cgaagtacgt ctttccctat cgcaggtact tccaggctat 5880
atgattccat cctactttat ccagatggat cgtatgccat taacgtcaaa cggaaaagtg 5940
gaccggaggt ctctgccggc tcctcaagta ggcgcgcata caggacggaa gtatacagct 6000
cctcgtacac cggctgagga agctttggca tctgtctggc aaggggtgct gggtgccgaa 6060
caggtgggta tccatgacaa tttctttgaa ttgggcggag actccataaa agctattcag 6120
gtgtcgtcac ggttactgca ggccggctat cggttagaga tgaagcagct gttcaaatcg 6180
ccaaccattg ccgagctagg cgcggaaatt caaacggctg tgcatatggc tgaacaggga 6240
gttgtgcgtg gaacgactcg cttgactcca gtccaacagt ggttctttgg acggaagcag 6300
gcagagcctc atcacttcaa tcaagcggtt atgctgtatc gtgaacaggg atttgaggaa 6360
aaggccttgc atcaggtgct aagaaaactc gctgagcatc atgacgccct tcgcatggtt 6420
ttccgtcaga cagagcatgg ctacgaagct tggaatcgtg atcttgaaga aggagagttg 6480
tatagcctat tcaccgctga tttacggaat gaatccgatc cgactgtagc cattacatcg 6540
ctgtcggatg acattcagtg cagtatcaat ctggcagaag gtccgctgct gaagttagga 6600
cttttccatt gtcaggatgg agaccacctt ctgatcgtga tccaccattt ggtggtggac 6660
ggagtatcct ggcggatttt gttcgaggat attgcagcag gttatgagca ggtgattcaa 6720
ggacaagcgc tgacattccc gcagaagacg gattccttcc gtgattgggg agacgccctt 6780
gctcgttatt cggaaggtcc agaaatggag actcatcggg cgtattggag agagctggag 6840
gatcagccac tcgaacagtt gccgaaggat gaggctgtgg aaagccttct tgtacaggat 6900
agcaaagtag taacagcaca atggactcta gaagaaaccg accaattatt gagaaaagcc 6960
catcgtgctt atcaaacaga gacgaatgat ctgctattga ctgctctggg catggcggta 7020
tccaaatggt ctggcatcgg aaaggttgct gtgaatctgg aaggacacgg tcgtgagccg 7080
attataccga atatcgacat cacccgtacc gtaggctggt ttacaagtca atatccggtg 7140
attttagact tggggaataa cccggaagtg gcctccttga tcaagtctgt gaaagaaggg 7200
ctgcgccgaa ttccgaacaa aggtattggc tacgggttgc tcaaaacgat ggcaagtcag 7260
ttggatgaag gcagcttcag cttgcagcct gagatttctt ttaactatct ggggcaattt 7320
gatcaggatt tgcaaggaag ctcgttgcag atttctcctt atccgaccgg aagcgcgcaa 7380
agcttgttgg aggaaccggc ctatacgcta gatatcaatg gcatggtgac ggacggagcc 7440
ctgactctga cgattactta taacggaaaa cagtataagt catctacgat ggaacagctc 7500
gctggatata ttgaagaaag cctgcgggaa cttctccagc attgcgtaac ccaagaaaaa 7560
accgtattga caccaagcga cgtgcttgcg aagggtctga gcattgccga tctggaggag 7620
ctttctaagc agacgagtca cattggcgat attgagaatg tatatagtct gacgccaatg 7680
cagaagggca tgctgttcca tgatatgttt gagccgcata caggtgctta ttttgagcag 7740
gccgcttttg attttaaggg tagctttgat ccgatcgcct tcgggcacag tctggatgca 7800
gtagtggagc gtcatgctat cctgcgcacg aacttttaca gcggatgggg cagcgagcct 7860
ttgcaggttg tatttcggca cagaggcgct aaattggtgt acgaagacct gcgggagatg 7920
aatgcatcgc agcgcgaagc ttacctgaag acatttggtg ctaaggacaa agcactgggc 7980
ttcaacctag ctgaagacga gcttctccgt gtatccattt tacaaacaga tgaagagagc 8040
ttccgtctct tatggagttt tcaccacatc gtcatggatg ggtggtgtgt tccgttaatt 8100
acgcaggagg tatttgaaca ctattttgcc ctcctggaag gtagagagcc gcagttggca 8160
gaggttcatc cgtacagtcg atatatcgaa tggctcgaac agcaggatga agcaattgcg 8220
tccaactatt ggagccgata tctggccggt tacgagcagc agacgctttt acctcaagtc 8280
ggtggagcaa gtaagggaga aggctatgta gcagaaaagc tgaattatcc tctcagcagg 8340
gaattgactg agcgccttga aaaggtggcc agggatgctc atgtcacgat gaatatattg 8400
ctgcagtccc tctggggcat tgcgcttcaa cgctataacg gtagccgaga tgtcgtgtac 8460
ggaagtgtag tatcaggcag accagcagaa attccgggca ttgatcggat gatcggtttg 8520
ttcatcaata cgattcccgt tcgtgtgaag acagaggaga atctcccctt cacagttctg 8580
atgaagcagc agcaggaaca atatatggct tctcatatgt atgacaccta cccgttgttt 8640
gagattcagg ctcagacgga tcagaagcag gatctaatct cccacattat ggtgtttgag 8700
aactatcctg tggaggagga ggtagagcgt ctgggtggtg gcgaggctgc ctttgagatt 8760
gaggaagcgg agcttcttga gcaaacgaat tatgatttta atttaattgt cctccctggc 8820
gaagaaatga gattgctgtt ccagtacaat gcacttgttt atgacccagt gacaattgag 8880
caaatcaagg gccatctggt ttacctcatg gaacaaattg tagagaaccc tgccatttcc 8940
gtggatgcac tagaattagt cacgccgcag gagagagaac agattctgaa cgtatgggga 9000
aatacaaaag gcatttacga gcactgtaac acgttccacg ggctgttgga ggaacaggcg 9060
ggacgaacgc cggatgcgac tgccctttgg ttcgaggaca agagtctgac ctatgccgag 9120
ctcaatgcaa aagccaacgg actggcgaga aggctccgta ctcagggaat caagacggga 9180
gatctggtgg gactgattgc tgaacggtcg ctcgaaatga tcgttgggat ctacggcatt 9240
atgaaagccg ggggtgccta tgttccaatc gatccagagt atccgaaaga acgaatcagt 9300
tacatgcttg aagattccgg ggcgaagctg atccttacac aggcccatct cttggagcat 9360
ctcggatgga cggaaaatgt tttgctgctg gatgaatcat cgacctatga tgccgacacc 9420
tcgaatttgg aggctactgc tggcccggat gatctggctt acgtgatcta cacttcaggt 9480
acgacgggtc agcctaaggg cgtattagtc gagcatcggg gactaccgaa tctttcggac 9540
gtatacggga cacacttcga agttacaccg caggatcgga tcgttcagtt tgcaagtctg 9600
tcgtttgatg catcggtttc ggaaatttta acggcgctga gccacggggc tgctctgtgc 9660
atcccttcta cacaagatat tttagatcat gccctgttcg agcagttcat gaacgataag 9720
gggattacgg tagcgacttt gccacccgct tacgctatcc accttgatcc agagcgtttg 9780
ccaacactgc ggtgcctgct aaccgctgga tcggccgcat ccgtcgagtt gatcgatgag 9840
tggaggaagc atgtacgtta ctctaatggc tatggcccaa cagaggactc cgtatgcacc 9900
acaatctggt ctgtcccgga cagtgaggaa gcaacggata ttgtatctat tgggcgacct 9960
attgctaacc acagtgtgta catcttggat gaccatttta gattgcagcc tgtcggtgta 10020
gctggagagc tatgcatttc gagtatcggg ttagcacggg ggtatcataa tcggcctgag 10080
ttaatggatg agaagttcgt ggacaatccg tttgctccag gagagcgcat gtatcggacg 10140
ggtgacctgg ttcgctggtt accgaatgga atcatcgagt acttaggtcg aatagatcac 10200
caagtcaaaa tccgcggtta ccgtatcgag ctgggcgagg tagaagcaca aatgctcaga 10260
gtgccgtccg ttcaggaagt cgtagccatg gctgtagagg gcgatgacgg ctacaaagat 10320
ctagtagctt acttcgtagc cgctcagaaa cttgaggtgt ccgaacttcg gactgttctg 10380
tcggagatga tacctggata tatgattcct tcccgcttca tacaactgga ggacatgcct 10440
ttgacgtcga acggaaaaat cgaccgaaaa gcgctgcagg gcgagcgtgg atgggcagtg 10500
gcttcatctg aggctccaag gacacctgtg gaaattcaat tagctgaaat ctggcaagag 10560
gtgctgggtg tagagagcgc gggagtgaag gataatttct tccattttgg aggtcattca 10620
ctgcgtgcag ccctgctagt ctcacgaatt cgcaaggaaa tgaatcgcga gattagtctg 10680
agagcagtgt tcgagtctcc tactattgaa ggattggctc gtgccattga gggctataca 10740
ccgctgaatt tcgaagaaat tcctacagcg ggagcgagag agcattatcc attgtcctcg 10800
gcccaaaaac gactgtttat tctaagtcag ctggaaggtg gagagctgag ctacaatatg 10860
ccgggggtcc ttaccgttga gggagctttg gatcgggaac ggctagagca ggcattccgt 10920
cgtctgattc atcgtcatgg ttcgctgcgt actcgctttg tgaccgtgaa cggtgaacct 10980
gtacagcagc tcctgacaga tgttccgttt actgtggaat atgcggagtt gagcgaggaa 11040
gaggcaggag ctacccttca gcagtttgtc cgccctttcg atctaggtgt agctccattg 11100
ctgcgggttg gccttattcg aattgcacat gagcgccatt tactattgtt tgacatgcat 11160
catattgtct cagatggggt ttctatgaat attctcatag aagagtttct ccgcttctac 11220
caagaggagg acgtatttcc tgagctacag atccagtaca cagactatgc tgtatggcag 11280
caagagcagc tcgaaagcga gcgtcttaag gcccaggagg cttactggct ggatgctttc 11340
cgtggaagct tgccagtgct ggatttgcca ggagatgaag ttcgtcctgc ggtgcgaagc 11400
tttgcgggcg atcgaatcga cttccaaatt gattcttctc tgagtgcttc acttcaggag 11460
ctggctaccc ggacgggttc cactctgttc atggtactgc tggcagccta tacagcgctc 11520
ttgcacaagt acacaggtca ggaagatgtc attgtcggtt cacctgtggc aggaagatct 11580
catgcgacac tcgaaggcct catcggtatg ttcgtcggca cagtggcact tcgtacttat 11640
ccagaaggag agaagccttt cgaggcttat ctgcaggaag tgaaggaaac agcgctgcgg 11700
gcctatgaaa accaggatta cccgttcgag gagctggtag aaaagctgga gcttcagcgt 11760
gatttgagcc gtaacccact atttgatacc atgtttgtcc tgcaaaatat cgagcaggga 11820
gaacaagaaa tagaaggatt gcgcttcact ccttacgata atgtacatcc ggctgccaag 11880
ttcgatctta cgctgaccgt gagtgaagca gacggggcat tgaattgcac gcttgagtat 11940
gcgactgcga tctacaagca agagactgct gagcggatgg caggccactt tgtacagctt 12000
attcgggaag ccatcgccaa tcccgcactg ccgttgtcat cccttgatat cgtgacacct 12060
caggaaaaat caaggctgat gaaagcgccg gacgaagcca aggcagatta tcctcgtgac 12120
aagacgatcc atgcgctgtt cgaggagcag gccgcacata ctccgaatgc agtggcagtc 12180
gtatgtgaag atgcgaccct gtcctacagc gagctgaacg agcgggccaa tggacttgcc 12240
cgaacgctga gggaacgtgg tttgcaacca gacggtttgg ctggaattat ggcggatcgt 12300
tcccttgaaa tggtggtcgg aattttagcc atcttgaagg caggcggggc ctatgtccct 12360
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ctactgctga cacaagcgca tctggagcaa cgggtctcct tcgccgggga tatcgtaagt 12480
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gagcatcttg cctacgtcat ctacacatcg ggtacgacag gcaagccaaa gggaacactg 12600
attgagcata aaaatgtagt tcgcttgctc tttaatgata aaaatatgtt tgactttggt 12660
cctcaggata cgtggacact gttccattca ttctgttttg acttctctgt atgggaaatg 12720
tacggagcat tgctaaacgg aggacggttg gtcatcgttc catcgcttac cgcgaagagt 12780
ccagatcgtt tcttgcaatt gcttaaggat cagaaggtca ccgttttgaa ccagacaccg 12840
acgtatttct accagttgct acaggaagag ctcggtcatc aagcggcaga actgagcctc 12900
cgcatgatta tcttcggtgg agaggcatta gccccggccc tgctcaagga ctggagaacg 12960
aagtatccgc aagtgcagct cattaacatg tacggcatta ccgaaacgac cgtgcatgta 13020
acctacaagg aaattacaga gttggaaatt gaacagggcc gtagcaatat cggcaccacg 13080
attccgacgc tgcgagcgta cattttggat gaacaacgcc gtccacagcc gattggcatt 13140
ccaggtgaac tctatgtggc gggcgtaggt ctggcgcgag gttatctgaa ccgaccggaa 13200
ttgacggaag agaagtttgt cgctcatccg tttgaagcgg gcgagcgcat gtaccgctcg 13260
ggtgacttgg cacgctggtt gccggatggc agcatggagt atttgggacg gattgaccat 13320
caggtaaaaa tccgtggtta ccgtatcgag ctgggcgaag tggaagcgaa gctgctccat 13380
gctccgtctg taagggaggc cgttgtgctc gcccgagagg atggaagtgg acaaaaagtg 13440
cttgtcggct atttcactgc cgatcagatg ctgacggtag gcgagttgag aaaagccttg 13500
gctgccgaac tgccgactta tatgattcca tcttacttta tgcaattgga acagatgcct 13560
ttgacgccaa atggcaagct ggatcgcaaa gcgcttccgg ctccagaggc caatgtgcag 13620
actggagcgg tttatgaacc gccaaggacg aaggctgagg aagccttggc ttccgtatgg 13680
caaggtgtgc tgggagcgca gcaggtcggc atccatgatc atttctttga tctgggtggt 13740
gattccatca aggcgatcca agtgtcctcg agattgttcc aagccggata taaattagag 13800
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ggacgtacag cggaacaggg cgaaattaaa ggtgcagcag agttaatgcc aattcagcgt 13920
tggttctttg aacgccatac agcggagccg caccattata atcatgccgt catgctctat 13980
cggaaagacg gctttgatga agctgcactc cggttgacaa tggaccaaat tgcgatccat 14040
catgatgcgc tgcgtatggt tttccggtct acagaagctg ggtatgtagc ttggaatcgg 14100
ggaacggacg aaggcgagct ctacacattg gacattgccg atatgcggca ggcggaagac 14160
cagacagctg cggttcaggc ccaagccgat gccattcagg caagttttga cttggaaggt 14220
ggcccactgt tcaagctagg cctgttccat tgtgacgatg gcgatcattt gttgattgtc 14280
attcatcacc tcttggttga cggcgtatcc tggcgcatcc tgtttgagga cattgcagcg 14340
gggtacgagc aggcattgaa tggacaagca atcgtccttc cacaaaagac cgattcgtat 14400
cttgtatggt ctgagcaagc gacgaagtat gcagcagggc ctgctctgga caaggagcgt 14460
gcatactggc agctgatcga agaggcgatt ttggccccac tgccgaagga tgaggatcag 14520
aagccgggca ccatccggga tactgaatcg gttacggtaa cgtggtctgc gcaggaaaca 14580
gacctgctgt tgcggcaagc gaaccgggcg tatcatacgg agacgaacga cttgctcttg 14640
actgctctgg gggcagccat tcagcgctgg acaggcatgg agcagatttt ggtcaatctt 14700
gaagggcatg gacgggaaat gatcgtacca gacctggata ttacccgtac cgtcggttgg 14760
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<211> 11214
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)
<400> 5
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atttggggaa cgctgctgaa cgggggacaa ctgtatgtgg taagtcatga cactattctg 4800
gatgcctcca agctcaagca ggcgattgac aagtatcgtg ttaacacgat gttcatgacc 4860
acggctttat tcaatcagta ttcgcagcaa gaaatcggag tgtttgcgtc cttgaaggag 4920
ttgctcgtgg gtggtgatgt attgtctgta ccacacgtca atcgtgtgtt gaaggagtac 4980
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cggattgatc aacaggttaa aattcgcggt taccggattg agctgggcga ggtggaggcg 9960
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gatcggtttc cgctgacgac aaacggcaaa atcgaccgca aagctttacc tgtgccggac 10200
aaagggctgc acacgggtat agaatatgtc gcaccgcgaa ccgatgtgga acagttgctg 10260
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ctggaacccg gatttatcga ggaaaatgta aaaagtatcc gtgccacaat acaaaagata 11160
actcggaaca cggacaaaga catgacacaa gacttggcac atcataaatc ttga 11214
<210> 6
<211> 11214
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)
<400> 6
ttgaaagcct tatttgagaa ggaaaaaaat tactggagtc ataaactgga atctgaggat 60
catatcatct gcctaccata caccaaccat gtgtccagaa gtacaactgt aacgagttta 120
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acaggtggcg ctccatgggc cgtgtttatg gtcctgcttg ctggagtaga gagcttattg 240
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accttcaaag ctttgctgtc tcaaatcaaa acctctgtcg gcgaagctat tgaacatcaa 420
aacattcctt tttggaacta ttctgaatta cttgacattc aacgtaatga ggatggaaag 480
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ggaggacatt ccctgcgggc gacacatgtc atatcactca tttataagga attgcataaa 2640
aatgtgcagc taaaggattt gttccagcat ccgacaattg aacagctggc gcaggttatt 2700
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ggtccgctga tgagactggg gctgttccgt tgcccggatg gagatcatct gctggtcgtg 6300
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ctgataaatc tagagggaca tggacgtgaa gccattttac cagaggtgga cattactcga 6780
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<213> 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)
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<210> 10
<211> 1500
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)
<400> 10
atggactctt tagctgatct ctcggaaacc cccttagtat tggaaaccct cagacgacat 60
ccctgttata acgaagaggc acatcgctat tttgcgcgca ttcatcttcc agtagccccg 120
gcatgcaata ttcaatgcca ttattgcaac cgaaaattcg attgcgtcaa tgaaagccgt 180
cccggcgttg ttagtgaact gctcacgccg gagcaggcgg cgagcaagac ctatggcgta 240
gcggcacagc ttatgcagct gtccgttgtc ggcattgcgg gacctggaga tccgctggcc 300
aatgcggagg caaccttcga taccttccgc cgggtccgtg agacagttaa ggatgtcata 360
ttctgtctca gcacaaatgg ccttaccttg atcaggcata ttgacaggat tgtagagctg 420
ggtatttcgc atgtcacgat cacgatcaat gctgtagatc cagtggtggg gagccgcatt 480
tatggatggg tctacgatga aggaaaacgc tatgcaggag aggaggccgc gcggctgttg 540
attgaccgcc agctggcagg cttgaagatg ctggcttcga gaggcgtatt gtgcaaggtg 600
aactcggtgc tgattcccga agtcaatgat gcccatctgc cggaggtagc cagggtggtc 660
aaggagcacg gtgcagtgct gcacaacatt atgccgctca tcatcgcacc tggtagccgg 720
tatgagcagg aagggatgcg ggctccccgt ccccgtctgg tccggcagct gcaggagcaa 780
tgtgctgaag cgggggctgt cattatgcgc cattgccgtc agtgcagggc ggatgcgatt 840
ggactgctgg gcgaggatcg caatcaggat tttacatggg agaacatagc ggctgctcct 900
cccatggatg aaggggcaag gacacaattt cagaaagaac tggatgagaa ggtgagagtg 960
agaatggaac gcaaggaggg acaatcacac cacaaacaac cgtcaaccgg ggctggctgt 1020
agctgcccgt tatcgggaga taagcctgaa gcgagcttca cctcaaagcc agtcctaatc 1080
gcagtggcca gtcgtggcgg agggaaggtg aatcagcatt tcggccgtgc caaggaattt 1140
atgatctatg aaagcgacgg gaccatcgta aatttcatag gcattcgtaa ggtgcaatcc 1200
tactgccacg ggaaagccga ttgcaatggg gacaaggtcg agacgatgaa ggagatcctt 1260
tccatggtgc atgactgtgc attgctgctg tcgtccggca taggcgaagc ccccaaagag 1320
gcattgcagg aagctggcgt gctgcctatt gtatgcggcg gggatattga ggaatcggtt 1380
ctggaatatg tgaaatttct gcgttatatg tatcctgtgc agagcaataa aggaagtaag 1440
cgcaataagg gagttaaggg caatcattcg gatttaccca ttaaacattt tggaggctga 1500
<210> 11
<211> 1500
<212> DNA
<213> 类芽孢杆菌属(Paenibacillus)
<400> 11
atggactctt tagctgatct ctcggaaacc cccttagcat tggacaccct tagacgacat 60
ccctgttata acgaagaggc acatcgctat tttgcgcgca ttcatcttcc agtagccccg 120
gcatgcaata ttcagtgcca ttattgcaac cgcaaattcg attgcgtcaa tgaaagccgt 180
cccggcgttg ttagtgaact gctcacgccg gagcaggcgg cgagcaagac ctatggcgta 240
gcggcacagc tgatgcaact gtccgttgtc ggcattgcgg gacctggaga tccgctggcc 300
aatgcggagg caaccttcga taccttccgc cgggtccgtg agacagttaa ggatgtcata 360
ttctgtctca gcacgaatgg ccttaccttg atcaggcata tcgacaggat tgtagagttg 420
ggtatttcgc atgtcacgat cacgatcaat gctgtagatc cagtggtggg gagccgcatt 480
tatggatggg tctacgatga aggaaaacgc tatgcaggag aggaggccgc gcggctgttg 540
attgaccgcc agctggcagg cttgaagatg ctggcttcga gaggcgtatt gtgcaaggta 600
aactcggtgc tgattcccga agtcaatgat gcccatctgc cagaggtagc cagggtggtc 660
aaggagcacg gcgcggtact gcacaacatt atgccgctca tcatcgcacc cggcagtcgg 720
tatgagcatg aagggatgcg ggccccccgt ccccgtctgg tccggcagct gcaggagcaa 780
tgtgctgagg cgggagctgt cattatgcgc cattgccgtc agtgcagggc ggatgcgatt 840
ggactgctgg gcgaggatcg caatcaggat tttacatggg agaacattgg ggctgctcct 900
cccatggatg aagaggcaag ggcacaattt cagaaagaac tggatgagaa ggtgagagtg 960
agaatggaac gcaaggaggg acaatcgcac cacaaaaaaa cgtcaaccgg ggttggatgt 1020
agctgcccgt tatcggagga taagcctgaa gcaagcttta cctcaaagcc agtcctaatc 1080
gctgtggcca gtcgtggcgg agggaaggtg aatcagcatt tcggtcgtgc caaggaattc 1140
atgatctatg aaagcgacgg gactatcgta aatttcatag gcattcgtaa ggtgcaatcc 1200
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gcattgcagg atgctggcgt gctgcctatt gtatgcggcg gggatattga ggaatccgtt 1380
ctggaatatg taaaatttct gcgttatatg tatcctgtgc agagcaataa gggaagtaag 1440
cgcaataagg gagttaaggg caatcattcg gatttaccca ttgaacattt tggaggctga 1500

Claims (20)

1.一种包含含有杀镰孢菌素和十三肽菌素的类芽孢杆菌属种菌株的生物纯的培养物或其无细胞制品的组合物;
其中所述类芽孢杆菌属种菌株包含由显示出与SEQ ID NO:3至少90.5%序列同一性的DNA序列编码的fusA的杀镰孢菌素合成酶基因;和
所述类芽孢杆菌属种菌株包含由显示出与SEQ ID NO:7至少90.0%序列同一性的DNA序列编码的triE的非核糖体肽合成酶(NRPS)基因。
2.根据权利要求1所述的组合物,其包含杀镰孢菌素A、杀镰孢菌素B、杀镰孢菌素C、杀镰孢菌素D、LiF05a、LiF05b、LiF06a、LiF06b、LiF07a和/或LiF07b。
3.根据权利要求1或2所述的组合物,其中所述组合物有效地防治由选自灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、黄瓜白粉菌(Sphaerotheca fuliginea)和小麦叶锈菌(Pucciniatriticina)的真菌引起的植物病害。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物,其中所述类芽孢杆菌属种菌株为类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724或其杀真菌的突变菌株。
5.根据权利要求4所述的组合物,其包含类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723、类芽孢杆菌属种菌株NRRLB-67724或其杀真菌的突变菌株的发酵产物。
6.根据权利要求4或5所述的组合物,其中所述杀真菌的突变菌株的基因组序列与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724具有大于约90%的序列同一性,以及/或者所述杀真菌的突变菌株具有与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67723或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724相当或更好的杀真菌活性和/或杀镰孢菌素水平。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物,其中
所述类芽孢杆菌属种菌株还包含固氮基因簇;和
所述固氮基因簇包含由显示出与SEQ ID NO:10至少96.9%序列同一性的DNA序列编码的nifB的固氮基因。
8.根据权利要求7所述的组合物,其中所述固氮基因簇的表达有助于增强植物生长、植物活力和/或作物产量。
9.根据权利要求7或8所述的组合物,其中
所述类芽孢杆菌属种菌株包含由显示出与SEQ ID NO:1至少97.3%序列同一性的DNA序列编码的fusA的杀镰孢菌素合成酶基因和
所述类芽孢杆菌属种菌株包含由显示出与SEQ ID NO:5至少97.5%序列同一性的DNA序列编码的triE的NRPS基因。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的组合物,其中所述类芽孢杆菌属种菌株为类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724或其杀真菌的突变菌株。
11.根据权利要求10所述的组合物,其包含类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724或其杀真菌的突变菌株的发酵产物。
12.根据权利要求10或11所述的组合物,其中所述杀真菌的突变菌株的基因组序列与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724具有大于约90%的序列同一性,以及/或者所述杀真菌的突变菌株具有与类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-50374、类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67721或类芽孢杆菌属种菌株NRRL B-67724相当或更好的杀真菌活性和/或杀镰孢菌素水平。
13.一种处理农业植物以防治病害的方法,其中所述方法包括将有效量的根据权利要求1至12中任一项所述的组合物施用于所述植物、所述植物的部分和/或所述植物的位置。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述方法包括将所述组合物施用于叶片植物部分。
15.根据权利要求13或14所述的方法,其中将所述组合物以每公顷约1×1010至约1×1012菌落形成单位(CFU)的类芽孢杆菌属种菌株或每公顷约0.5kg至约5kg发酵固体施用。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法,其中所述病害是真菌病害或细菌病害。
17.一种用于增加农业植物的活力和/或作物产量的方法,其中用有效量的根据权利要求1至12中任一项所述的组合物处理所述植物、所述植物繁殖体、所述植物的种子和/或所述植物正在生长或打算生长的位置。
18.根据权利要求17所述的方法,其中所述处理作为沟内处理、种子处理和/或叶片处理进行。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法,其中所述农业植物选自大豆、玉米、小麦、黑小麦、大麦、燕麦、黑麦、油菜、粟、稻、向日葵、棉花、糖用甜菜、仁果、核果、柑橘、香蕉、草莓、蓝莓、扁桃、葡萄、芒果、木瓜、花生、马铃薯、番茄、胡椒、葫芦、黄瓜、甜瓜、西瓜、大蒜、洋葱、西兰花、胡萝卜、卷心菜、菜豆、干豆、油菜籽、豌豆、小扁豆、苜蓿、车轴草、三叶草、亚麻、象草、牧草、莴苣、甘蔗、茶、烟草和咖啡;每一种都为其天然或遗传修饰的形式。
20.用根据权利要求1至12中任一项所述的组合物处理的种子。
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