CN108148793A - 一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4及制备方法和应用 - Google Patents

一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4及制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108148793A
CN108148793A CN201810202554.8A CN201810202554A CN108148793A CN 108148793 A CN108148793 A CN 108148793A CN 201810202554 A CN201810202554 A CN 201810202554A CN 108148793 A CN108148793 A CN 108148793A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacterial strain
bacterium
polymyxa
bacillus
temperature
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810202554.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108148793B (zh
CN108148793A8 (zh
Inventor
徐文兴
赵梓茜
郭大勇
尤华锋
蔡丽
洪霓
王国平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN201810202554.8A priority Critical patent/CN108148793B/zh
Publication of CN108148793A publication Critical patent/CN108148793A/zh
Publication of CN108148793A8 publication Critical patent/CN108148793A8/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108148793B publication Critical patent/CN108148793B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4及制备方法和应用，CCTCC M 2018023。步骤是：A、无菌环境下挑取菌株单菌落，接种于培养液，放置在恒温培养振荡器中，调节温度、转速，振荡培养；B、每瓶装发酵液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，振荡培养；C、配制培养液：依次加入罐中，封闭罐体，对培养液加热消毒，点燃酒精将接种口消毒，在酒精持续燃烧下倒入上步制备的2 L发酵液，调控搅拌机的转速；D、将发酵液过滤，在过滤后的发酵液中加入辅料轻质碳酸钙粉末，送入离心喷雾干燥塔内干燥，收集干粉。该菌在制备治疗或预防梨树锈病药物中的应用。该菌株的干粉发酵对梨锈病具有显著的防病效果，防效达到67.09%以上，显著抑制梨树提前落叶。

Description

一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4及制备方法和应用
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域，更具体涉及一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4，同时还涉及一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4的制备方法，再涉及一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4的用途。
背景技术
梨树锈病由担子菌门胶锈菌属梨胶锈菌(Gynmosporangium haraeanum Syd.＝Gynmosporangium asiaticum Miyabe ex Yamada)引起，在中国梨园内发生较为普遍，可以导致叶片和果实脱落，严重影响产量。目前中国主要采用化学药剂进行防治，如代森锰锌、烯唑醇、三唑酮等，生物防治除了有报道采用梨胶锈菌重寄生菌(葡酒锈生座孢Tuberculina vinosa Sacc.)进行防治外，尚无商品化的生防制剂。长期施用化学农药可以导致农残超标，并易使病原菌产生抗药性，导致防治效果下降。此外，长期、反复和大量使用化学农药可引起土壤、水体和大气的污染，同时也杀伤了其他有益微生物，破坏了生态平衡。从植物内筛选利用有益微生物，抑制病原菌的生长进行防病具有显著的经济和生态效益。
目前，抗病微生物以芽孢杆菌为主，已经发现具有防病潜力的芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilis)、多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、侧胞芽孢杆菌(B.laterosporus)等，但这些芽孢杆菌主要用于防治由曲霉、镰孢菌、链格孢、轮枝孢和腐霉菌引起的作物根部的病害如立枯病、猝倒病、枯萎病、根腐病、茎腐病、立枯病【Kabaluk T,Gazdik K:Directory of MicrobialPesticides for Agricultural Crops in OECD Countries.Agriculture and Agri-Food.http://www4.agr.gc.ca/resources/prod/doc/pmc/pdf/micro_e.pdf 2005,accessed November2014】，没有涉及象梨树锈病这类作物叶部病害的防治。其中，多粘类芽孢杆菌已经在美国(登记公司American Agritech)和韩国(登记公司Green BiotechCompanyLtd.)登记，前者登记用于防治作物的立枯病和猝倒病，后者登记用于防治黄瓜猝倒病；在我国，多粘芽孢杆菌(菌株HY96-2)也已经商品化，产品为0.1亿cfu/g多粘类芽孢杆菌细粒剂(商品名：康地蕾得，登记公司为浙江桐庐汇丰生化有限公司)，登记用于防治番茄、辣椒、茄子及烟草草青枯病【LI Yuan-guang(李元广)，WANG Wei(王伟)，SHE Guo-min(沈国敏)，et a1.Microbial preparation&method for preventing and curing thebacterial wilt the plant and its use(防治植物细菌性青枯病的微生物制剂和方法及其用途)：CN1415737[P].2003-05-07；LI Yuan-guang(李元广)，WEI Hong—gang(魏鸿刚)，SHEN Guo-min(沈国敏)，et a1.Preparation and application of Paenibacilluspolymyxa wettable powder formulation(多粘类芽胞杆菌可湿性粉剂、及其制备和应用)：CN101243801[P].2008-08-20】。此外，国内也有报道还未商业化但有防病潜力的多粘类芽孢杆菌菌株，如S960菌株对瓜枯萎病菌和番茄疫霉具有明显的拮抗作用【林茂兹，多粘类芽孢杆菌S960菌株发酵条件优化，福建师大福清分校学报，2015,132(5):6-11】；多粘类芽孢杆菌LM-3对水稻稻瘟病具有一定的防效；多粘类芽孢杆菌CF05对番茄灰霉病菌、串珠镰刀病菌、棉花枯萎病菌等8种真菌和葡萄根癌病菌、白菜软腐病菌等4种细菌具有拮抗活性【金莉萍，多粘类芽孢杆菌生防促生机制研究及发酵条件的优化，硕士论文，2016，浙江农林大学】；JW-725对柑橘青霉具有很强的抑制作用【赵德立等.多粘芽孢杆菌JW-725抗菌活性物质及其发酵条件的初步研究.植物保护,2006.32(1)：47-50】；多粘类芽孢杆菌DN-1对油茶炭疽病有29.8％-68.91％的防效【胡飞等，一株多粘类芽胞杆菌防治油茶炭疽病初探，中国森林病虫，2015，34(4)：1-5】，并对水稻纹枯病菌具有显著的抑制效果【周子燕等，几种因素对多粘类芽孢杆菌DN-1活性的影响，安徽农业科学，2017,45(9)：137-138】。但目前尚无报道多粘类芽孢杆菌用于防治梨锈病等梨树病害。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4，宽度为1.4-2.1μm，平均为1.7μm，长度为2.8-5.3μm，平均4.4μm，革兰氏染色反应阳性，芽孢椭圆形，单生或串生于细胞顶部或两个细胞中间。该菌株具有广谱抗真菌活性，对梨树的主要病原真菌[包括梨轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana)、梨炭疽菌(Colletotrichumfructicola、Colletotrichum gloeosporioides)、梨腐烂病菌(Valsa mali var.pyri)、梨胴枯病菌(Phomopsis fukushii)等)均有显著的抑菌活性。此外，还对其它常见园艺作物病原真菌如山茶刺盘孢菌(Colletotrichum camelliae)、拟茎点霉菌(Phomopsis sp.)、茶拟盘多毛孢(Pestalotiopsis_theae)、柑橘青霉菌(Penicillium italicum)均具有良好的拮抗活性，但对腐生菌如毛霉(Mucor racemosus)和根霉(Rhizopus nigricans)，没有或微弱的抑菌活性，显示该菌环境友好，多粘芽孢杆菌DYr4.4具有较强的活性以及耐储存特性，对梨锈病具有良好的防治效果、环境友好、抗菌谱广和防止梨树早期落叶的效果。
本发明的另一个目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4的制备方法，方法易行，操作简便，采用该方法，获得便于溶于水中使用、便于携带、耐储藏、菌体数量多的固体发酵粉剂。固体发酵后达到223亿CFU/g孢子量。室内正常自然温度储存6个月后，测定孢子数量仍然在152亿CFU/g孢子量以上，室内正常自然温度存储一年后，测量孢子数量仍然在115亿CFU/g孢子量以上。
本发明还有一个目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4在制备治疗或预防梨树锈病药物中的应用，该菌株的干粉发酵产品对梨锈病具有显著的防病效果，防效达到67.09％以上，优于较常用的化学杀菌剂甲基硫菌灵的防效(59.49％-63.7％)。此外，经过多粘芽孢杆菌DYr4.4喷施的梨树，可以显著抑制梨树提前落叶，有利于增强树势。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4的制备方法，其步骤是：
A、无菌环境下挑取DYr4.4菌株单菌落，接种于装有25mL最适培养液A(0.7％体积比葡萄糖，0.02％体积比硫酸镁，0.5％体积比蛋白胨，0.3％体积比牛肉膏，调节pH值7.5-7.6)的250mL三角瓶中，放置在恒温培养振荡器NSKY－200B中，调节温度为26－30℃、转速为150r/min，振荡培养22－26h。
B、需要准备500ml三角瓶10个，每瓶装200mL发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，26－30℃下150r/min振荡培养46－50h。
C、配制350L培养液(葡萄糖2.45kg、硫酸镁0.7kg、蛋白胨2kg、牛肉膏1.2kg)，将其依次加入500L大罐中。封闭罐体，用高温(100℃)水蒸气对培养液加热(至100℃)消毒2－3h，之后用冷水降温至26－30℃。然后点燃酒精将接种口消毒，并在酒精持续燃烧的状况下倒入上步制备的2L发酵液，并封紧接种口。发酵过程需要注意的事项如下：需要连续发酵46－50小时，温度需要手工控制在26-29℃；每两个小时通过玻璃观察发酵罐内的起泡情况，泡沫较多时用加压机将有机硅油加入发酵罐内消除泡沫；经常观察罐内的压强变化，控制合理的发酵液充氧量,有利于稳定控制芽孢杆菌的增殖,从而得到稳定的芽孢杆菌含量；根据发酵的剧烈程度，调控搅拌机的转速，从最开始的16转到40转(约开始发酵后24h，表现为温度只升不降)。
D、将发酵液过滤，并在过滤后的发酵液中加入辅料轻质碳酸钙粉末，比例为3kg/100L发酵液；送入离心喷雾干燥塔内干燥，设置参数：干燥塔高温离心处温度为201℃，出口温度为78℃：每1h收集一次干粉(高品质)；全部干燥完毕后，收集干粉(图5)。
1、拮抗菌的分离：
在湖北省黄石市大冶玫瑰地采集大马士革玫瑰根，将根切成长约1cm大小的组织，经过浓度为75％体积比的酒精消毒30s，经无菌水冲洗2-3次后，放置于PDA培养基(200g马铃薯、20g蔗糖、15g琼脂粉溶于1000mL蒸馏水，PH值7.0左右)上25℃暗培养。培养36h后，将长出来的细菌菌落转移至新的PDA培养基上划线分离纯化单菌落。
分离纯化后，获得一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，菌株编号为DYr4.4，平板对峙实验中对多种致病菌(见下)具有很强的拮抗能力，田间对梨树锈病具有良好防效。该菌株分类命名为多粘类芽孢杆菌DYr4.4，2018年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2018023。
通过上述措施获得一种大马士革玫瑰根际的拮抗细菌多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株DYr4.4，一种大马士革玫瑰根际的拮抗细菌多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株dy.4.4中含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
一种来源于大马士革玫瑰根际的拮抗细菌多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)菌株DYr4.4，其于2018年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2018023。
菌株DYr4.4经过固体发酵后可以应用于梨树锈病的防治，阻止因锈病危害造成的梨树叶片脱落。
2、拮抗菌的形态分子鉴定:
对拮抗细菌基因组DNA的提取，以提取的DNA为模版，采用BSF(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和BSR(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)引物对16S rDNA部分序列进行扩增，预期大小为1500bp。
PCR反应条件为95℃预变性4min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃再延伸5min，16℃终止。PCR产物都经浓度为1％琼脂糖凝胶电泳分析，将目标片段纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将获得序列与NCBI数据库中序列采用BLASTn进行相似性分析，结果表明菌株DYr4.4的16S rDNA序列与Paenibacilluspolymyxa strain Sb3-1的16S rDNA序列(序列登陆号：CP010270.1)同源率为99％(coverage 98％,E value 0.0,identity 99％)。
3、拮抗菌的菌落和形态特征
在LB平板上，多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)DYr4.4菌株的菌落呈圆形，扁平，乳白色，不透明。经过革兰氏染色后在油镜下观察，菌体短杆状，常串生在一起，宽度为1.4-2.1μm，平均为1.7μm，长度为2.8-5.3μm，平均4.4μm，革兰氏染色反应阳性，芽孢椭圆形，单生或串生于细胞顶部或两个细胞中间(图1)。
4、拮抗菌的培养：
DYr4.4菌株的培养条件为：菌株活化采用LB培养基，即蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，蒸馏水1000ml。
采用培养基A用于菌株DYr4.4的发酵培养和孢子数目的测定，具体配方为：0.7％体积比葡萄糖，0.02％体积比硫酸镁，0.5％体积比蛋白胨，0.3％体积比牛肉膏，调节pH值7.5-7.6；其中固体培养基加琼脂7～8g(每500mL培养基)，121℃高压蒸汽灭菌20min。
将培养获得的发酵液，加最适培养基稀释到不同倍数，获得稀释倍数为1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100倍的样品菌悬液，测定600nm波长下的吸光值。同时，取50μL稀释至10-12、10-13倍在最适固体培养基上进行涂板，密封后放置于28℃的恒温培养箱进行培养，定期观察直至出现清晰可数的孢子再进行测定。测定OD600吸光值和菌体生物量线性方程为y＝6.0e15x-3.0e14(R2＝0.9936)(图2)。
5、拮抗菌的拮抗实验：
采用平板对峙法筛评价菌株DYr4.4对真菌的拮抗活性：在PDA培养基上，取10μL摇培的菌液涂划于培养皿的正中间，在离细菌线的4cm处接直径为5mm的菌丝块，设置无抑制菌处理为对照，每个处理重复3培养皿，于25℃暗培养，当对照组刚长满整培养皿时，测量各处理抑菌圈大小，根据有无抑菌带及抑菌带的大小判断其拮抗效果。
测试拮抗菌株包括梨轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana)、果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)、梨腐烂病菌(Valsa mali var.pyri)、梨胴枯病菌(Phomopsis fukushii)、山茶刺盘孢菌(Colletotrichum camelliae)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、拟茎点霉菌(Phomopsis sp.)、茶拟盘多毛孢(Pestalotiopsis_theae)、毛霉(Mucor racemosus)和意大利青霉菌(Penicilliumitalicum)，由本实验室前期分离所得。结果显示，DYr4.4除了对腐生菌毛霉和黑根霉无抑菌作用外，对其它致病真菌均有强的抑菌作用，抑菌范围为5.3-11.5mm，且对不同的致病菌的抑菌效果具有显著性差异(图3和图4)。
6、拮抗菌的固体发酵：
无菌环境下挑取DYr4.4菌株单菌落，接种于装有25mL最适培养液A的250mL三角瓶中，放置在恒温培养振荡器NSKY－200B中，调节温度为28℃、转速为150r/min，振荡培养24h。需要准备500ml三角瓶10个，每瓶装200mL发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，28℃下150r/min振荡培养48h。
配制350L培养液(葡萄糖2.45kg、硫酸镁0.7kg、蛋白胨2kg、牛肉膏1.2kg)，将其依次加入500L大罐中。封闭罐体，用高温(100℃)水蒸气对培养液加热消毒2h，之后用冷水降温至28℃。然后点燃酒精将接种口消毒，并在酒精持续燃烧的状况下倒入上步制备的2L发酵液，并封紧接种口。发酵过程需要注意的事项如下：需要连续发酵48小时，温度需要手工控制在26-29℃，温度过高用冷水降温，温度偏低用高温蒸汽加热；每两个小时通过玻璃观察发酵罐内的起泡情况，泡沫较多时用加压机将有机硅油加入发酵罐内消除泡沫；经常观察罐内的压强变化，控制合理的发酵液充氧量,有利于稳定控制芽孢杆菌的增殖,从而得到稳定的芽孢杆菌含量；根据发酵的剧烈程度，调控搅拌机的转速，从最开始的16转到40转(约开始发酵后24h，表现为温度只升不降)。
将发酵液过滤，并在过滤后的发酵液中加入辅料轻质碳酸钙粉末，比例为3kg/100L发酵液；送入离心喷雾干燥塔内干燥，设置参数：干燥塔高温离心处温度为201℃，出口温度为78℃：每1h收集一次干粉(高品质)；全部干燥完毕后，收集干粉(图5)。
7、固体发酵和储藏后菌落浓度：
经过发酵培养和喷雾干燥菌株DYr4.4干粉前期的孢子浓度达2.23×1010cfu/g；室内正常自然温度储存6个月后，测定孢子数量仍然在152亿CFU/g孢子量以上，室内正常自然温度存储一年后，测量孢子数量仍然在100亿CFU/g孢子量以上。结果表明本研究所获得的多黏芽孢杆菌DYr4.4干粉具有较强的活性以及耐储存特性。
8、拮抗菌的田间防病实验：
2017年3月至4月在华中农业大学南湖梨园进行大田药效试验。实验药剂：7％甲基硫菌灵、DYr4.4固体发酵液、清水对照。
实验共设3个处理，每个品种的每个处理设置4个重复，每个重复3棵树。共计20个小区，36棵树。小区间设保护行。采用喷雾法处理，在晴天早晨9时前和下午4时后进行，避开高温时间。每隔10d喷一次，连喷3次。
调查方法：每小区采用五点取样法，每点自上至下调查30片叶子，调查发病情况，以片为单位记录各级病指数。
分级标准：
0级：没有发病
1级：每片叶有1～2个病斑；
2级：每片叶有3～4个病斑；
3级：每片叶有5～6个病斑；
4级：每片叶有7个及以上病斑。
结果显示，DYr4.4发酵液具有显著的防病效果(图6)，在两个品种(黄花和丰水梨)的梨树上对梨锈病均表现良好的防病效果，防病达到67.09％和71.01％，优于化学农药甲基硫菌灵的防效(59.49％和63.7％)(表1)。秋季(9月中旬)观察落叶情况，喷施DYr4.4发酵液和药甲基硫菌灵的梨树叶片仍保持绿色，较少落叶，而清水对照叶片已经大量脱落(图6)。
一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4在制备治疗或预防梨树锈病药物中的应用，其步骤是：
A、施药时期：在每年的3-4月份，采用手动喷雾器或机动喷雾器，在晴天早晨9时前和下午4时后或多云天气(主要为了避开高温时间)，进行喷雾施药，均匀喷施叶片表面。每隔10天再喷施1次，连续喷施3次。若喷施后24h遇到大雨天气，天晴后应再补施一次。
B、用量：取多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株DYr4.4干粉，按照100-500倍浓度用水稀释，每亩地200-500g。
C、叶片喷雾时候，不能与铜制剂或杀细菌剂混合使用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
A、目前报道的多粘芽孢杆菌对梨树致病菌的抑菌活性尚未报道。多粘芽孢杆菌DYr4.4对常见的梨树的主要病原真菌[包括梨轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana)、梨炭疽菌(Colletotrichum fructicola、Colletotrichum gloeosporioides)、梨腐烂病菌(Valsa mali var.pyri)和梨胴枯病菌(Phomopsis fukushii)]均有显著的抑菌活性。此外，还对其它常见园艺作物病原真菌如山茶刺盘孢菌(Colletotrichum camelliae)、拟茎点霉菌(Phomopsis sp.)、茶拟盘多毛孢(Pestalotiopsis_theae)、柑橘青霉菌(Penicillium italicum)均具有良好的拮抗活性。因此，多粘芽孢杆菌DYr4.4是首个明确可以抑制主要梨树病原真菌的多粘芽孢杆菌。
B、目前报道的芽孢杆菌对环境腐生真菌的活性不明确，多粘芽孢杆菌DYr4.4对腐生菌如毛霉(Mucor racemosus)和根霉(Rhizopus nigricans)，没有或微弱的抑菌活性，显示该菌环境友好。
C、对比商品化的多粘芽孢杆菌HY96-2(商品名：康地蕾得)，其孢子发酵后获得的浓度为0.1亿cfu/g多粘类芽孢杆菌细粒剂；而菌株DYr4.4发酵后获得的干粉孢子浓度为223亿cfu/g，发酵后活菌量显著远远高于商品化多粘芽孢杆菌HY96-2。此外，也显著高于目前已知的多粘芽孢杆菌菌株，如有报道多粘芽孢杆菌菌株DN-1固体发酵后浓度达到54亿cfu/g。此外，室内正常自然温度储存6个月后，测定孢子数量仍然在152亿CFU/g孢子量以上，室内正常自然温度存储一年后，测量孢子数量仍然在115亿CFU/g孢子量以上。表明本研究所获得的多黏芽孢杆菌DYr4.4干粉具有较强的活性以及耐储存特性。
D、目前，其它芽孢杆菌是否可以用于梨锈病的防治尚缺乏室内和室外的药效试验数据，多粘芽孢杆菌DYr4.4是首次发现的对梨锈病具有良好防效的芽孢杆菌。
E、目前，其它芽孢杆菌是否对梨树早期落叶具有一定的防效尚缺乏室内和室外的药效试验数据，多粘芽孢杆菌DYr4.4是首次发现的对梨树早期落叶具有良好防效的芽孢杆菌。
F、目前，获得的效果为，喷施贝莱斯芽孢杆菌DYr4.4三次后，与喷施清水的空白对照相比，梨树锈病得到有效抑制，且梨树叶片仍保持绿色，很少脱落。
附图说明
图1为一种DYr4.4革兰氏染色后在油镜下的形态示意图。
革兰氏染色后DYr4.4菌细胞呈紫色，芽孢呈现浅红色，显示为革兰氏阳性。
图2为一种在600nm波长下多粘类芽孢杆菌菌株DYr4.4不同吸光值与浓度间的线性关系示意图。
该图是挑取菌株DYr4.4单菌落放入培养基A(0.7％葡萄糖，0.02％硫酸镁，0.5％蛋白胨，0.3％牛肉膏，调节pH值7.5-7.6)中，28℃培养48h后，按照1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、100倍进行稀释，测定600nm波长下的吸光值。同时，取50μL涂板测定孢子数量，测定OD600吸光值和对应菌体生物量，显示吸光值(x)和菌体量(y)呈正相关，线性方程为y＝6.0e15x-3.0e14(R2＝0.9936)。
图3为一种在PDA培养基上多粘类芽孢杆菌菌株DYr4.4对12个真菌菌株的对峙抑菌效果分析示意图。
平板中央为划线的DYr4.4菌液，两边为接种的真菌菌丝块。CK-为不加菌株DYr4.4，仅加真菌菌丝块的对照。所用真菌和菌株标注在平板上方。
图4为一种在PDA培养基上多粘类芽孢杆菌菌株DYr4.4对12个真菌菌株的对峙抑菌宽度柱状示意图。
纵坐标为抑菌宽度，横坐标为测定真菌及菌株。显著性差异分析采用SPSSStatistics 21.0(WinWrap Basic；http://www.winwrap.com)进行差异显著性分析(Duncan’s test，P＝0.05)。
图5为一种多粘类芽孢杆菌菌株DYr4.4固体发酵粉剂示意图。
菌株DYr4.4经过固体发酵后，加入辅料轻质碳酸钙粉末制成的粉剂，呈灰白色，粉末状。
图6为一种DYR4.4田间防治梨锈病代表效果示意图。
左上：喷施清水对照梨树叶片；右上：喷施DYR4.4三次后梨树叶片；左下：喷施清水对照秋季梨树叶片提前大量脱落；右上：喷施DYR4.4三次后梨树叶片仍保持绿色，很少脱落。
具体实施方式
实施例1：
一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4的制备方法，其步骤是：
A、无菌环境下挑取DYr4.4菌株单菌落，接种于装有25mL最适培养液A(0.7％体积比葡萄糖，0.02％体积比硫酸镁，0.5％体积比蛋白胨，0.3％体积比牛肉膏，调节pH值7.5-7.6)的250mL三角瓶中，放置在恒温培养振荡器NSKY－200B中，调节温度为26或27或28或29或30℃、转速为150r/min，振荡培养22或24或26h。
B、需要准备500ml三角瓶10个，每瓶装200mL发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，26或28或30℃下150r/min振荡培养46或48或50h。
C、配制350L培养液(葡萄糖2.45kg、硫酸镁0.7kg、蛋白胨2kg、牛肉膏1.2kg)，将其依次加入500L大罐中。封闭罐体，用高温(100℃)水蒸气对培养液加热(至100℃)消毒1－3h，之后用冷水降温至26－30℃。然后点燃酒精将接种口消毒，并在酒精持续燃烧的状况下倒入上步制备的2L发酵液，并封紧接种口。发酵过程需要注意的事项如下：需要连续发酵46－50小时，温度需要手工控制在26或28或29℃；每两个小时通过玻璃观察发酵罐内的起泡情况，泡沫较多时用加压机将有机硅油加入发酵罐内消除泡沫；经常观察罐内的压强变化，控制合理的发酵液充氧量,有利于稳定控制芽孢杆菌的增殖,从而得到稳定的芽孢杆菌含量；根据发酵的剧烈程度，调控搅拌机的转速，从最开始的16转到40转(约开始发酵后24h，表现为温度只升不降)。
D、将发酵液过滤，并在过滤后的发酵液中加入辅料轻质碳酸钙粉末，比例为3kg/100L发酵液；送入离心喷雾干燥塔内干燥，设置参数：干燥塔高温离心处温度为201℃，出口温度为78℃：每1h收集一次干粉(高品质)；全部干燥完毕后，收集干粉(图5)。
该发明在湖北省黄石市大冶玫瑰地采集大马士革玫瑰根，将根切成长约1cm大小的组织，经过70％体积比酒精消毒30s，经无菌水冲洗2-3次后，放置于PDA培养基(200g马铃薯、20g蔗糖、15g琼脂粉溶于1000mL蒸馏水，PH值7.0左右)上25℃暗培养。培养36h后，将长出来的细菌菌落转移至新的PDA培养基上划线分离纯化单菌落。
分离纯化后，获得一种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，菌株编号为DYr4.4，平板对峙实验中对多种致病菌(见下)具有很强的拮抗能力，田间对梨树锈病具有良好防效。
通过上述措施获得一种大马士革玫瑰根际的拮抗细菌多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株DYr4.4，一种大马士革玫瑰根际的拮抗细菌多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株DYr4.4中含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
一株来源于大马士革玫瑰根际的拮抗细菌多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)菌株DYr4.4，其于2018年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2018023。
菌株DYr4.4经过固体发酵后可以应用于梨树锈病的防治，阻止因锈病危害造成的梨树叶片脱落。
一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4在制备治疗或预防梨树锈病药物中的应用，其步骤是：
A、施药时期：在每年的3至4月份，梨锈病没有发生或刚刚发生期，采用手动喷雾器或机动喷雾器，在晴天早晨9时前和下午4时后避开高温时间，进行喷雾施药，均匀喷施叶片表面。每隔10天再喷施1次，连续喷施3次。若喷施后24h遇到大雨天气，天晴后应再补施一次。
B、用量：取多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)菌株DYr4.4干粉，按照100-500倍浓度用水稀释，每亩地200-500g。
C、叶片喷雾时候，可以与叶面肥和生长调剂剂一起使用。但不能与铜制剂和杀细菌剂混合使用。
拮抗菌的拮抗实验：
采用平板对峙法筛评价菌株DYr4.4对真菌的拮抗活性：在PDA培养基上，取10μL摇培的菌液涂划于培养皿的正中间，在离细菌线的4cm处接直径为5mm的菌丝块，设置无抑制菌处理为对照，每个处理重复3培养皿，于25℃暗培养，当对照组刚长满整培养皿时，测量各处理抑菌圈大小，根据有无抑菌带及抑菌带的大小判断其拮抗效果。
测试拮抗菌株包括梨轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana)、果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)、梨腐烂病菌(Valsa mali var.pyri)、梨胴枯病菌(Phomopsis fukushii)、山茶刺盘孢菌(Colletotrichum camelliae)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、拟茎点霉菌(Phomopsis sp.)、茶拟盘多毛孢(Pestalotiopsis_theae)、毛霉(Mucor racemosus)和意大利青霉菌(Penicilliumitalicum)，由本实验室前期分离所得。结果显示，DYr4.4除了对腐生菌毛霉和黑根霉无抑菌作用外，对其它致病真菌均有强的抑菌作用，抑菌范围为5.3-11.5mm，且对不同的致病菌的抑菌效果具有显著性差异(图3和图4)。
拮抗菌的固体发酵：
大罐发酵液配方：0.7％体积比葡萄糖，0.02％体积比硫酸镁，0.5％体积比蛋白胨，0.3％体积比牛肉膏，调节pH值7.5-7.6，消泡剂有机硅油3L，辅料为轻质碳酸钙粉末12kg。
无菌环境下挑取DYr4.4菌株单菌落，接种于装有25mL最适培养液A的250mL三角瓶中，放置在恒温培养振荡器NSKY－200B中，调节温度为28℃、转速为150r/min，振荡培养24h。需要准备500ml三角瓶10个，每瓶装200mL发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，28℃下150r/min振荡培养48h。
配制350L培养液(葡萄糖2.45kg、硫酸镁0.7kg、蛋白胨2kg、牛肉膏1.2kg)，将其依次加入500L大罐中。封闭罐体，用高温水蒸气对培养液加热消毒2h，之后用冷水降温至28℃。然后点燃酒精将接种口消毒，并在酒精持续燃烧的状况下倒入上步制备的2L发酵液，并封紧接种口。发酵过程需要注意的事项如下：需要连续发酵48小时，温度需要手工控制在26℃或27℃；每两个小时通过玻璃观察发酵罐内的起泡情况，泡沫较多时用加压机将有机硅油加入发酵罐内消除泡沫；经常观察罐内的压强变化，控制合理的发酵液充氧量,有利于稳定控制芽孢杆菌的增殖,从而得到稳定的芽孢杆菌含量；根据发酵的剧烈程度，调控搅拌机的转速，从最开始的16转到40转(约开始发酵后24h，表现为温度只升不降)。
将发酵液过滤，并在过滤后的发酵液中加入辅料轻质碳酸钙粉末，比例为3kg/100L发酵液；送入离心喷雾干燥塔内干燥，设置参数：干燥塔高温离心处温度为201℃，出口温度为78℃：每1h收集一次干粉(高品质)；全部干燥完毕后，收集干粉(图5)。
固体发酵和储藏后菌落浓度：
经过发酵培养和喷雾干燥菌株DYr4.4干粉前期的孢子浓度达2.23×1010cfu/g；室内正常自然温度储存6个月后，测定孢子数量仍然在152亿CFU/g孢子量以上，室内正常自然温度存储一年后，测量孢子数量仍然在115亿CFU/g孢子量以上。结果表明本研究所获得的多黏芽孢杆菌DYr4.4干粉具有较强的活性以及耐储存特性。
拮抗菌的田间防病实验：
2017年3月至4月在华中农业大学南湖梨园进行大田药效试验。实验药剂：7％甲基硫菌灵、DYr4.4固体发酵液、清水对照。
实验共设3个处理，每个品种的每个处理设置4个重复，每个重复3棵树。共计20个小区，36棵树。小区间设保护行。采用喷雾法处理，在晴天早晨9时前和下午4时后进行，避开高温时间。每隔10d喷一次，连喷3次。
调查方法：每小区采用五点取样法，每点自上至下调查30片叶子，调查发病情况，以片为单位记录各级病指数。
分级标准：
0级：没有发病
1级：每片叶有1～2个病斑；
2级：每片叶有3～4个病斑；
3级：每片叶有5～6个病斑；
4级：每片叶有7个及以上病斑。
结果显示，DYr4.4发酵液具有显著的防病效果(图6)，在两个品种(黄花和丰水梨)的梨树上对梨锈病均表现良好的防病效果，防病达到67.09％和71.01％，优于化学农药甲基硫菌灵的防效(59.49％和63.7％)(表1)。秋季(9月中旬)观察落叶情况，喷施DYr4.4发酵液和药甲基硫菌灵的梨树叶片仍保持绿色，较少落叶，而清水对照叶片已经大量脱落(图6)。
表1采用DYr4.4发酵液和甲基硫菌灵防治梨锈病后的病情指数和防治效果
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4及制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggcgggggc ccgtgcctat aactgcaagt cgagcggggt taattagaag cttgcttcta 60
attaacctag cggcggacgg gtgagtaaca cgtaggcaac ctgcccacaa gacagggata 120
actaccggaa acggtagcta atacccgata catccttttc ctgcatggga gaaggaggaa 180
aggcggagca atctgtcact tgtggatggg cctgcggcgc attagctagt tggtggggta 240
atggcctacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac 300
tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatgggcgaa 360
agcctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgc 420
cagggaagaa cgtcttgtag agtaactgct ataagagtga cggtacctga gaagaaagcc 480
ccggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg ggcaagcgtt gtccggaatt 540
attgggcgta aagcgcgcgc aggcggctct ttaagtctgg tgtttaatcc cgaggctcaa 600
cttcgggtcg cactggaaac tggggagctt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg 660
tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggg 720
ctgtaactga cgctgaggcg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 780
tccacgccgt aaacgatgaa tgctaggtgt taggggtttc gatacccttg gtgccgaagt 840
taacacatta agcattccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg 900
acggggaccc gcacaagcag tggagtatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt 960
accaggtctt gacatccctc tgaccgctgt agagataggg ctttccttcg ggacagagga 1020
gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1080
cgagcgcaac ccttatgctt agttgccagc aggtcaagct gggcactcta agcagactgc 1140
cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg 1200
gctacacacg tactacaatg gccggtacaa cgggaagcga agccgcgagg tggagccaat 1260
cctagaaaag ccggtctcag ttcggattgc aggctgcaac tcgcctgcat gaagtcggaa 1320
ttgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggtct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccacgagagt ttacaacacc cgaagtcggt gaggtaaccg caaggggcca 1440
gccgccgaag gtggggtaga tgatggggtg aagtcgtata cgaggtaacc gtacccg 1497

Claims (4)

1.一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4，其特征在于：拮抗细菌多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）菌株DYr4.4，保藏编号为CCTCC M 2018023。
2.根据权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4，其特征在于：所述的多粘类芽孢杆菌菌株DYr4.4中含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4的制备方法，其步骤是：
A、无菌环境下挑取DYr4.4菌株单菌落，接种于装有25mL最适培养液A：0.7％葡萄糖，0.02％硫酸镁，0.5％蛋白胨，0.3％牛肉膏，调节pH 值7.5-7.6的250 mL 三角瓶中，放置在恒温培养振荡器中，调节温度为26－30℃、转速为150 r/min，振荡培养22－26h；
B、准备500ml三角瓶10个，每瓶装200 mL发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，26－30℃下150 r/min振荡培养46－50h；
C、配制350L培养液：葡萄糖2.45kg、硫酸镁0.7kg、蛋白胨2kg、牛肉膏1.2 kg，将其依次加入500L大罐中，封闭罐体，用100℃水蒸气对培养液加热至100℃消毒2－3h，之后用冷水降温至26－30℃，然后点燃酒精将接种口消毒，在酒精持续燃烧下倒入上步制备的2L发酵液，并封紧接种口，连续发酵46－50小时，温度手工控制在26-29℃；每两个小时通过玻璃观察发酵罐内的起泡情况，泡沫较多时用加压机将有机硅油加入发酵罐内消除泡沫；观察罐内的压强变化，控制发酵液充氧量, 根据发酵的程度，调控搅拌机的转速，从开始的16转到40转；
D、将发酵液过滤，在过滤后的发酵液中加入辅料轻质碳酸钙粉末，比例为3 kg/100L发酵液；送入离心喷雾干燥塔内干燥，设置参数：干燥塔高温离心处温度为201℃，出口温度为78℃：每1h收集一次干粉；干燥完毕后，收集干粉。
4.权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4在制备治疗或预防梨树锈病药物中的应用，其步骤是：
A、施药时期：在每年的3-4月份，采用手动喷雾器或机动喷雾器，在晴天早晨9时前和下午4时后或多云天气，进行喷雾施药，均匀喷施叶片表面，每隔10天再喷施1次，连续喷施3次，喷施后24h遇到雨天气，天晴后应再补施一次；
B、用量：取多粘类芽孢杆菌菌株DYr4.4干粉，按照100-500倍浓度用水稀释，每亩地200-500 g；
C、叶片喷雾时候，与叶面肥和生长调剂剂一起使用。
CN201810202554.8A 2018-03-13 2018-03-13 一种广谱抑菌活性的多粘类芽孢杆菌DYr4.4及制备方法和应用 Active CN108148793B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810202554.8A CN108148793B (zh) 2018-03-13 2018-03-13 一种广谱抑菌活性的多粘类芽孢杆菌DYr4.4及制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810202554.8A CN108148793B (zh) 2018-03-13 2018-03-13 一种广谱抑菌活性的多粘类芽孢杆菌DYr4.4及制备方法和应用

Publications (3)

Publication Number Publication Date
CN108148793A true CN108148793A (zh) 2018-06-12
CN108148793A8 CN108148793A8 (zh) 2018-07-24
CN108148793B CN108148793B (zh) 2020-11-06

Family

ID=62456640

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810202554.8A Active CN108148793B (zh) 2018-03-13 2018-03-13 一种广谱抑菌活性的多粘类芽孢杆菌DYr4.4及制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108148793B (zh)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109022315A (zh) * 2018-08-13 2018-12-18 东北农业大学 一株广谱抗病的生防芽胞杆菌及其应用
CN110438048A (zh) * 2019-08-23 2019-11-12 华中农业大学 利用白酒酒糟生产多黏芽孢杆菌添加剂的方法及其应用
CN111172065A (zh) * 2020-01-06 2020-05-19 河南新仰韶生物科技有限公司 一株高产多粘类芽孢杆菌及其应用
CN112662578A (zh) * 2020-11-10 2021-04-16 浙江省农业科学院 一株多粘类芽孢杆菌dx32及其抑制拟盘多毛孢属植物病原真菌的应用
CN112662579A (zh) * 2020-11-10 2021-04-16 浙江省农业科学院 一株多粘类芽孢杆菌dx32及其抑制植物炭疽病菌的应用
CN113512502A (zh) * 2021-07-12 2021-10-19 中国农业科学院郑州果树研究所 一种内生真菌及其在防治腐烂病中的应用
WO2023131664A3 (fr) * 2022-01-05 2023-10-12 Medinbio Procédé de génération d'un plan de traitement adapté pour le développement d'une surface cultivée sans pesticides d'origine chimique, procédé de traitement de la surface cultivée, modele d'apprentissage et systéme associés

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101243801A (zh) * 2007-03-30 2008-08-20 上海泽元海洋生物技术有限公司 多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂、及其制备和应用
US20110275514A1 (en) * 2008-11-25 2011-11-10 Masanao Takaishi Composition for controlling plant diseases and method for controlling plant diseases
CN102851243A (zh) * 2012-09-07 2013-01-02 北京市农林科学院 一株多粘类芽孢杆菌及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101243801A (zh) * 2007-03-30 2008-08-20 上海泽元海洋生物技术有限公司 多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂、及其制备和应用
US20110275514A1 (en) * 2008-11-25 2011-11-10 Masanao Takaishi Composition for controlling plant diseases and method for controlling plant diseases
CN102851243A (zh) * 2012-09-07 2013-01-02 北京市农林科学院 一株多粘类芽孢杆菌及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DARIA RYBAKOVA 等: "Endophytes-assisted biocontrol: novel insights in ecology and the mode of action of Paenibacillus", 《PLANT SOIL》 *
刘英胜 等: "梨锈病发病规律及综合防治技术", 《河北果树》 *
毕涛: "山东省烟草青枯病病原鉴定及化学药剂和生防菌株的筛选", 《万方》 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109022315A (zh) * 2018-08-13 2018-12-18 东北农业大学 一株广谱抗病的生防芽胞杆菌及其应用
CN109022315B (zh) * 2018-08-13 2021-10-22 东北农业大学 一株广谱抗病的生防芽胞杆菌及其应用
CN110438048A (zh) * 2019-08-23 2019-11-12 华中农业大学 利用白酒酒糟生产多黏芽孢杆菌添加剂的方法及其应用
CN111172065A (zh) * 2020-01-06 2020-05-19 河南新仰韶生物科技有限公司 一株高产多粘类芽孢杆菌及其应用
CN111172065B (zh) * 2020-01-06 2022-06-24 河南新仰韶生物科技有限公司 一株高产多粘类芽孢杆菌及其应用
CN112662578A (zh) * 2020-11-10 2021-04-16 浙江省农业科学院 一株多粘类芽孢杆菌dx32及其抑制拟盘多毛孢属植物病原真菌的应用
CN112662579A (zh) * 2020-11-10 2021-04-16 浙江省农业科学院 一株多粘类芽孢杆菌dx32及其抑制植物炭疽病菌的应用
CN113512502A (zh) * 2021-07-12 2021-10-19 中国农业科学院郑州果树研究所 一种内生真菌及其在防治腐烂病中的应用
CN113512502B (zh) * 2021-07-12 2022-07-26 中国农业科学院郑州果树研究所 一种内生真菌及其在防治腐烂病中的应用
WO2023131664A3 (fr) * 2022-01-05 2023-10-12 Medinbio Procédé de génération d'un plan de traitement adapté pour le développement d'une surface cultivée sans pesticides d'origine chimique, procédé de traitement de la surface cultivée, modele d'apprentissage et systéme associés

Also Published As

Publication number Publication date
CN108148793B (zh) 2020-11-06
CN108148793A8 (zh) 2018-07-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108148793A (zh) 一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌DYr4.4及制备方法和应用
CN111548976B (zh) 一株多粘类芽孢杆菌菌株及其应用
CN108641981B (zh) 一株生防芽孢杆菌鉴定及应用
CN101575574B (zh) 一种哈茨木霉类复合菌培养物及其在植保方面的应用
CN100334201C (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其应用
CN108330089A (zh) 一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7及制备方法和应用
CN105219681B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens D2WM及制备方法和应用
CN105018366B (zh) 甲基营养型芽孢杆菌及其应用
CN102433282B (zh) 枯草芽孢杆菌nb12及其培养方法和应用
CN101993836B (zh) 枯草芽孢杆菌菌株yb-81、菌剂及其制备方法和应用
CN104694397B (zh) 一株球毛壳菌及其应用
CN104164394B (zh) 一株拮抗植物病原菌的菌株及其应用
CN101967455B (zh) 防治小麦根部病害的解淀粉芽孢杆菌ea19及其制剂
CN104694446B (zh) 一种多粘类芽孢杆菌jx‑13及其应用
CN109234197B (zh) 一株能够同时防治烟草黑胫病和根黑腐病且具有促生作用的铜绿假单胞杆菌及其应用
CN101423812A (zh) 解淀粉芽孢杆菌和微生物制剂及其制备方法
CN113717901B (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治多种蔬菜病害中的应用
CN106190920B (zh) 枯草芽孢杆菌yn145及其应用
CN106867934B (zh) 一株暹罗芽孢杆菌及其在防治植物白粉病中的应用
CN112760248B (zh) 一种可防治桃褐腐病的林肯链霉菌及其应用
CN106479934B (zh) 一种灰霉病菌拮抗菌株及其筛选方法和应用
CN104673705B (zh) 一株防治小麦赤霉病的解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN103952328B (zh) 一种枯草芽孢杆菌菌株a33、菌剂及制备方法和应用
CN109266589A (zh) 一株抑制炭疽菌和镰刀菌的杰米拉类芽孢杆菌及其应用
CN102559562B (zh) 一种具有防治水稻稻瘟病的水稻内生细菌及其在水稻稻瘟病防治中的用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CI02 Correction of invention patent application

Correction item: Biological Conservation Information

Correct: CCTCCNO: M 2018023 2018.01.12

Number: 24-01

Page: The title page

Volume: 34

Correction item: Biological Conservation Information

Correct: CCTCCNO: M 2018023 2018.01.12

Number: 24-01

CI02 Correction of invention patent application
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant