CN112662578A - 一株多粘类芽孢杆菌dx32及其抑制拟盘多毛孢属植物病原真菌的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32，其菌种保藏号为CCTCC No:M 2020639。本发明还公开了多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32在抑制拟盘多毛孢属植物病原真菌中的应用。本发明的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32可以有效地抑制拟盘多毛孢属植物病原真菌，如小孢拟盘多毛孢、茶拟盘多毛孢、棕榈拟盘多毛孢、异色拟盘多毛孢和芍药拟盘多毛孢，对于菌丝以及孢子萌发均有较好的抑制作用。

Description

一株多粘类芽孢杆菌DX32及其抑制拟盘多毛孢属植物病原真 菌的应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一株多粘类芽孢杆菌DX32及其抑制拟盘多毛孢属植物病原真菌的应用。

背景技术

多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)对植物黄萎病、鹰嘴豆枯萎病、油菜腐烂病、黑松根腐病等多种植物病害均具有一定的控制作用。美国环境保护署(EPA)已将其列为可商业上应用的微生物种类之一。无论是采用HY96-2(P.polymyxa)发酵液，还是由HY96-2制成的细粒剂(KDLD)，在温室内和田间都取得了稳定的防治效果，并且 KDLD细粒剂在田间表现的效果更为突出。拟盘多毛孢属是半知菌类的一个无性型内生真菌属，是著名的植物病原体品种，与Truncatella属和Seiridium属关系密切。拟盘多毛孢属的子实体通常为分生孢子盘类型，分生孢子以芽殖方式产生。目前尚未发现多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)对拟盘多毛孢属植物病原真菌具有抑制作用。

发明内容

本发明的第一目的是提供一株多粘类芽孢杆菌DX32，其菌种保藏号为CCTCC No:M 2020639。

本发明的第二目的是提供上述多粘类芽孢杆菌DX32的用途。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32，其菌种保藏号为CCTCCNo:M 2020639。

二、根据上述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32在抑制拟盘多毛孢属植物病原真菌中的应用。

所述的拟盘多毛孢属病原真菌为小孢拟盘多毛孢、茶拟盘多毛孢、棕榈拟盘多毛孢、异色拟盘多毛孢和芍药拟盘多毛孢中的任意一种。

浙江省磐安县大溪村浙贝母种植园中在灰霉病高发区选取未感病植株，连根拔起后装入取样纸袋中，并将纸袋标记好并带回实验室进行植物内生真菌分离。摘取贝母叶片用无菌水冲洗干净后沥干，放入2％次氯酸钠溶液中3min后取出，用无菌水冲洗3次后在无菌环境下吹干，5h后将晾干的贝母叶片用灭菌的剪刀剪碎，大小约2mm×2mm，用镊子夹取至NA固体培养基平板上，28℃恒温箱暗培养。待菌落长出后，用接种环蘸取细菌菌落至新的NA固体培养基平板上划线培养，纯化直至获得大小、形态、色泽一致的单菌落。本发明的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32就是从单菌落中筛选出来的。

采用上述技术方案的积极效果：本发明的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa) DX32可以有效地抑制拟盘多毛孢属植物病原真菌，如小孢拟盘多毛孢、茶拟盘多毛孢、棕榈拟盘多毛孢、异色拟盘多毛孢和芍药拟盘多毛孢，对于菌丝以及孢子萌发均有较好的抑制作用。

附图说明

图1是本发明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32菌株在NA固体培养基上的菌落形态图；

图2是本发明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32菌株显微图片；

图3是本发明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32菌株负染色图；

图4是本发明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32菌株超薄切片图；

图5是本发明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32菌株16S rRNA序列的系统发育树状图。

本发明所涉及的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32，于2020年10月26日在中国专利局或国际专利组织承认的保藏中心进行了专利程序保藏，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCC No:M 2020639，分类命名：Paenibacillus polymyxa DX32。

具体实施方式

本发明生物材料的来源：

小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsis microspora)bio-80851、茶拟盘多毛孢(Pestalotiopsis theae)bio-80791、棕榈拟盘多毛孢(Pestalotiopsis chamaeropis)bio-090390、异色拟盘多毛孢(Pestalotiopsis versicolor)bio-09595和芍药拟盘多毛孢(Pestalotiopsis paeoniae)bio-09623均购于中国微生物菌种保藏中心。

下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1

本实施例说明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32的分离和鉴定。

浙江省磐安县大溪村浙贝母种植园中在灰霉病高发区选取未感病植株，连根拔起后装入取样纸袋中，并将纸袋标记好并带回实验室进行植物内生真菌分离。摘取贝母叶片用无菌水冲洗干净后沥干，放入2％次氯酸钠溶液中3min后取出，用无菌水冲洗3次后在无菌环境下吹干，5h后将晾干的贝母叶片用灭菌的剪刀剪碎，大小约2mm×2mm，用镊子夹取至NA固体培养基平板上，28℃恒温箱暗培养。待菌落长出后，用接种环蘸取细菌菌落至新的NA固体培养基平板上划线培养，纯化直至获得大小、形态、色泽一致的单菌落，保存备用。

其中，NA固体培养基配方为：蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，水1000ml。

对分离得到的内生真菌进行病原菌对峙生长试验，为本发明DX32菌株对植物炭疽菌有较好的抑制作用，抑制带菌＞2mm，因此该菌株抑制作用较强。通过拮抗细菌菌落的形态学观察及显微观察显示，如图1-4所示，为本发明DX32菌株直杆状，大小 (0.6～2.6μm)×(1.1～11μm)，革兰氏阴性菌，好氧型，单端鞭毛，芽殖；在NA固体培养基上菌落多呈浅黄或白色的粘稠状，表面光滑。通过细菌通用引物16srRNA引物PCR 扩增出1365bp基因序列，GenBank中BLAST核苷酸序列对比结果表明，本发明拮抗菌株与Paenibacillus polymyxa(NR117732)相似度达99％。采用MEGA7软件通过Neighbor Joining方法建立系统发育树，结果显示本发明拮抗菌株与P.polymyxa的亲缘关系最近，支持率达100％(图5)。结合形态学特征和Biolog结果分析将本发明拮抗菌株DX32 鉴定为多粘类芽孢杆菌(P.polymyxa)。

实施例2

本实施例说明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32生理生化特性测定。

使用BIOLOG GENIII(按照试剂盒说明书操作)测定唯一碳源利用等生理生化特性指标。菌株DX₃₂对BIOLOG GENIII板的唯一碳源利用及化学物质耐受情况见表1。

表1利用BIOLOG GENIII板测定的DX32菌株唯一碳源利用等生理生化特性

注：+，阳性；-，阴性；w，弱阳性。

由表1中的结果可以看出，本发明的拮抗菌株DX₃₂可利用葡聚糖、D-麦芽糖、D- 海藻糖、D-纤维二糖、龙胆二糖、蔗糖、D-松二糖、水苏糖、D-蜜三糖、α-D-乳糖、 D-蜜二糖、β-Methyl-D葡萄糖苷、D-水杨甙、N-Acetyl-D葡萄糖胺、α-D-葡萄糖、D- 甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖、D-甘露醇，可分解果胶，可液化明胶，在pH 6、1％NaCl、丙三醇、利福霉素SV、洁霉素、盐酸胍、半乳糖醛酸、L- 半乳糖酸、D-葡(萄)糖酸、葡糖醛酰胺、氯化锂、亚碲酸钾、肌苷、丁酸钠、1％乳酸钠环境下呈阳性；不可利用D-丝氨酸、D-山梨醇、D-阿拉伯醇、myo-肌醇、D-葡萄糖-6-PO4、D-天冬氨酸、D-丝氨酸、Glycyl-L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天(门) 冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、N-Acetyl-β-D甘露糖胺、N-Acetyl-D 半乳糖胺、N-Acetyl甘露糖胺丙酮酸、3-Methyl葡萄糖、D-岩藻糖，在pH 5、8％NaCl、醋竹桃霉素、二甲胺四环素、硫酸四癸钠、葡萄糖醛酸、梭链孢酸、粘液酸、奎尼酸、 D-葡糖二酸、万古霉素、四唑紫、四唑蓝、p-Hydroxy-苯乙酸、丙酮酸盐、D-乳酸甲酯、L-乳酸、柠檬酸、α-Keto-戊二酸、D-羟基丁二酸、L-羟基丁二酸、Bromo-琥珀酸、萘啶酮酸、吐温40、γ-Amino-丁酸、α-Hydroxy-丁酸、β-Hydroxy-D,L-丁酸、α-Keto- 丁酸、乙酰乙酸、丙酸、醋酸、甲酸、氨曲南、溴酸钠环境下呈阴性；在4％NaCl和 D-果糖-6-PO₄环境下呈弱阳性。

实施例3

本实施例说明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32与常见拟盘多毛孢属病原真菌对峙生长试验。

采用对峙生长法测定本发明拮抗菌株DX₃₂对常见拟盘多毛孢属病原真菌的抑制效果。用打孔器打取5mm供试菌株菌饼放置于PDA平板直径的1/3处，挑取DX₃₂菌株单菌落至含菌饼PDA平板的对称1/3处，28℃恒温培养5天后测量DX₃₂与供试菌株菌落之间的抑菌带大小，并记录数据，无DX₃₂的含菌饼PDA平板为空白对照。

表2本发明菌株DX32与常见拟盘多毛孢属病原真菌对峙生长的抑菌带大小(mm)

由表2中的结果可以看出，本发明的拮抗菌株对常见拟盘多毛孢属病原真菌表现出不同程度的抑制效果，并且效果均较好。其中对小孢拟盘多毛孢的抑菌带最大，达 24mm，其次是棕榈拟盘多毛孢、茶拟盘多毛孢、异色拟盘多毛孢和芍药拟盘多毛孢。

实施例4

本实施例说明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32对常见拟盘多毛孢属病原真菌菌丝生长的影响。

采用生长速率法，测定本发明拮抗菌株DX₃₂对常见拟盘多毛孢属病原真菌菌丝生长的影响。挑取本发明拮抗菌株DX₃₂单菌落至NB液体培养基中，28℃恒温震荡培养 24h，将摇好的菌液倒入40℃PDA半固体培养基中，摇匀后倒入无菌培养皿中，配制成50倍、25倍、12倍和6.25倍液的混菌平板，将在PDA平板中培养好的供试拟盘多毛孢菌落用打孔器打取直径为5×5mm大小的菌饼，菌丝面朝下接种于混菌平板中央，不含菌的PDA平板为空白对照。采用十字交叉法测量供试菌株菌落直径，并记录数据。

表3本发明菌株DX32对常见拟盘多毛孢属病原真菌菌丝生长的影响(mm)

由表3中的结果可以看出，本发明的拮抗菌株对常见拟盘多毛孢属病原真菌有不同程度的抑制效果，并且效果均较好。其中对小孢拟盘多毛孢的效果最好，其次是棕榈拟盘多毛孢和茶拟盘多毛孢，异色拟盘多毛孢和芍药拟盘多毛孢也有一定的抑制效果。

实施例5

本实施例说明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32对常见拟盘多毛孢属病原真菌的毒力敏感性测定。

同实施例4结果所示，与对照比较计算各杀菌剂处理对病菌的生长抑制率。以浓度自然对数为自变量、Probit(抑制率)为因变量得毒力回归方程，根据方程计算杀菌剂对病原菌的半数有效浓度(EC₅₀)。抑制率(％)＝(处理组菌落直径-对照组菌落直径)/(对照组菌落直径-菌饼直径)×100％。本发明菌株DX32对常见拟盘多毛孢属病原真菌的毒力敏感性见表4。

表4本发明菌株DX32对常见拟盘多毛孢属病原真菌的毒力回归方程、相关系数、EC₅₀和EC₉₀值(mg·L-1)

由表4中的结果可以看出，本发明的拮抗菌株对常见拟盘多毛孢属病原菌株有不同程度的抑制效果，并且效果均较好。其中对小孢拟盘多毛孢的效果最好，EC₅₀值达19025.56mg·L^-1，EC₉₀达182297.69mg·L^-1。其次是棕榈拟盘多毛孢和茶拟盘多毛孢，异色拟盘多毛孢和芍药拟盘多毛孢也有一定的抑制效果。

实施例6

本实施例说明多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32对常见拟盘多毛孢属病原真菌孢子萌发的影响。

培养本发明拮抗菌株DX₃₂菌液，将培养2周的常见拟盘多毛孢属病原真菌的菌板用无菌水冲洗后配置成孢子悬浊液备用。将本发明拮抗菌株DX₃₂菌液和供试菌株孢子悬浊液1:1混合，摇匀后放置于28℃恒温培养箱内静置培养。培养3天后开始记录孢子萌发数，每24h记录一次数据，等量无菌水与供试菌株孢子悬浊液混合为空白对照。

表5本发明菌株DX32对常见拟盘多毛孢属病原真菌孢子萌发的影响(10⁷/mL)

注：+：本发明菌株DX₃₂处理；-：等量清水处理，空白对照。

由表5中的结果可以看出，本发明的拮抗菌株DX₃₂对所有供试拟盘多毛孢病原真菌的孢子萌发抑制效果较好，3d和4d后孢子萌发率均为0。

本发明的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32可以有效地抑制拟盘多毛孢属病原真菌，如小孢拟盘多毛孢、茶拟盘多毛孢、棕榈拟盘多毛孢、异色拟盘多毛孢和芍药拟盘多毛孢，对于菌丝以及孢子萌发均有较好的抑制作用。

Claims (3)

1.一株多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32，其菌种保藏号为CCTCC No:M2020639。

2.根据权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)DX32在抑制拟盘多毛孢属病原真菌中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的拟盘多毛孢属病原真菌为小孢拟盘多毛孢、茶拟盘多毛孢、棕榈拟盘多毛孢、异色拟盘多毛孢和芍药拟盘多毛孢中的任意一种。

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