CN103397063B - 一种透明质酸的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明特别提供一种高产率的透明质酸的生产方法。所述方法采用兽疫链球菌（HA-116ATCC39920）进行发酵，在培养基中加入β-羟基丁酸钠和烟酸。本发明透明质酸生产方法，透明质酸产率高，质量好，生产成本低。

Description

一种透明质酸的生产方法

技术领域

本发明特别提供一种高产率的透明质酸的生产方法。

背景技术

透明质酸即玻璃酸（SodiumHyaluronate）、玻尿酸，简称HA，是一种酸性粘多糖。其分子结构是由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通过β-1，4和β-1，3糖苷键反复交替连接而成，分子量在1O万至400百万之间。分子中两种单糖即β-D-葡萄糖醛酸(glucuronicacid)和N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺(N—acetylglucosamine)按1：1的摩尔比组成。

分子式：（C₁₄H₂₀NNaO₁₁）n，CAS号：9004-61-9，其双糖结构如下图：

HA的分子结构图

1934年美国哥伦比亚大学眼科教授Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质，1937年，Kendall等就发现链球菌可产生HA，工业化生产水平的HA发酵是日本资生堂开始研究的，80年代开发成功，并首先应用在化妆品中。我国从80年代开始研究HA的分离纯化制备工艺和临床应用，90年代初已有HA制剂作为新药上市。不同动物组织和细菌来源的HA无种属差异，对人类及动物无抗原性，生产方法中的提取法正逐渐被微生物发酵法替代。

1937年，Kendall等发现溶血性链球菌streptococcushaemolyticus可以合成透明质酸并分泌到胞外形成荚膜；其后，又陆续报道了能合成HA的微生物菌种。由于许多链球菌都可以合成以HA多糖为唯一成分的荚膜，使得链球菌（特别是对人体危害较小的C型）成为研究最多的HA生产菌，已报道的能作为HA生产菌的链球菌有：溶血性链球菌(A型)，兽疫链球菌（C型），马链球菌（C型），粪马链球菌（C型），缺乳链球菌（C型）以及鸡霍乱杆菌(C型)等；其中A型为人体致病菌，C型则只能感染畜类。1983年，首次报道了日本的资生堂用链球菌生产HA，随后，英美等国相继报道了采用微生物发酵法生产HA的方法，大大拓宽了HA的来源，推动了HA的研究和应用。微生物发酵生产HA的实现是HA生产领域在近年来取得的最重大的进展。

HA在细菌内的生物合成路线表明，透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖在透明质酸合成酶作用下通过β-l-3和β-l-4糖苷键连接而成的二糖单体重复构建而形成的直链高分子多糖。在有氧条件下，链球菌利用氧分子将NADH氧化为NAD，同时ADP转化为ATP。ATP的积累有利于UTP的生成，而UTP是合成HA的两个前体化合物（UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖）所必须的物质，因而从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于HA的合成。但是，细胞在合成HA的同时也合成大量的小分子有机酸，其中大部分是乳酸和乙酸，使得发酵过程中pH值以0.01-0.15/min的速度降低。一方面大量的碳源流向乳酸合成，使得碳源向透明质酸的转化率很低；另一方面当发酵液pH值低于5.0时，菌体生长和代谢很慢或停止，限制了发酵生产中HA的产率（高海军，Streptococcuszooepidemicus。生物合成透明质酸的过程优化与代谢网络分析，无锡轻工业大学，1999），这也成为了限制透明质酸发酵工业的一个重要因素。

微生物产生大量乳酸的原因是为了获得大量NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的再生，当溶氧充足时，乳酸的产量很低，原因是氧可以直接氧化NADH为NAD（ChongB.f.,NielsenL.K.AmplifyingthecellularreductionpotentialofStreptococcuszooepidemicus.J.Biotech.2003,100:33-41）。但是由于透明质酸发酵液十分粘稠，导致溶氧很低，因此乳酸的产量较大。

针对以上情况，要提高透明质酸的产率，必须寻找途径减少乳酸的产生。

中国专利CN200410070767.8提供了一种方法：构建一个含有phbCAB基因序列的质粒表达载体，再导入链球菌中进行表达聚羟基丁酸（PHB），能够有效减少乳酸产生、提高透明质酸产量。PHB的合成可以将大量的NADH氧化成NAD，从而避免了NADH的积累刺激乳酸的产生，同时NAD也是合成透明质酸所需的，因而透明质酸产量提高29％，但是最终产率也只有0.45g/L。

至今尚没有使用兽疫链球菌（HA-116ATCC39920）发酵生产透明质酸时向培养基中添加β-羟基丁酸钠和烟酸的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种透明质酸的生产方法，可以提高透明质酸产率。

本发明采用的技术方案如下：

一种透明质酸的生产方法，采用兽疫链球菌（保藏号HA-116ATCC39920）进行发酵，在培养基中加入β-羟基丁酸钠和烟酸。

β-羟基丁酸钠添加量为培养基质量的0.1-1%，优选0.5％。

烟酸添加量为培养基质量的0.05-0.5%，优选0.2%。

调整培养基中葡萄糖的质量百分含量为0.8-1.6％，优选1.2％。

相对于传统方法采用的培养基中葡萄糖质量百分比为2.0%，本发明葡萄糖的量相当于减少了20-60％。

本发明采用了加入β-羟基丁酸钠和烟酸的方法。β-羟基丁酸钠在胞内被氧化为乙酰乙酸，乙酰乙酸活化后只需一步反应就可以生成两分子乙酰CoA，乙酰CoA进入三羧酸循环合成NADH，最终被完全氧化并合成NAD和ATP。合成透明质酸所需的大量能量物质乙酰CoA、NAD和ATP主要依靠β-羟基丁酸钠的分解来获得，跳过了糖酵解步骤。糖酵解步骤因此在一定程度上被抑止，在透明质酸合成中的主要作用转变为提供2个前体物质葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖。而糖酵解步骤的被抑止，大大减少了乳酸和其他杂质的生成，提高了透明质酸的产率和质量。烟酸的添加是为了提供合成NAD的必要前体。

采用本发明透明质酸生产方法，透明质酸产率提高10％。提取精制步骤由3步减少为1步，收率提高5％。获得的透明质酸其蛋白质含量减少1倍。生产成本降低20-22％。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

本发明透明质酸生产方法，透明质酸收率高，质量好，生产成本低。

具体实施方式

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：

传统方法如下：

发酵采用的培养基为：蛋白胨1.0％（质量百分含量，下同）、酵母粉0.5％、葡萄糖2.0％、七水合硫酸镁0.05％、KH₂PO₄0.2％。采用的菌种保藏号为HA-116ATCC39920（CN200910164358.7中有记载），pH7.5。

变温发酵：开始时发酵温度维持在34℃，发酵12小时后，将温度升至40℃继续发酵，发酵结束时发酵液中透明质酸含量为1.05g/L，透明质酸中蛋白质含量为0.05%。

实施例1-3所采用的兽疫链球菌同传统方法。

实施例1

一种透明质酸的生产方法，采用兽疫链球菌为发酵菌种。在传统方法的培养基中加入β-羟基丁酸钠和烟酸。β-羟基丁酸钠添加量为培养基质量的0.1%；烟酸添加量为培养基质量的0.05%；同时调整培养基中葡萄糖的质量百分比为1.6％。

获得的透明质酸产率为1.17g/L，透明质酸中蛋白质含量为0.025%，生产成本降低21％。

实施例2

一种透明质酸的生产方法，采用兽疫链球菌为发酵菌种。在培养基中加入β-羟基丁酸钠和烟酸。β-羟基丁酸钠添加量为培养基质量的1%；烟酸添加量为培养基质量的0.5%；同时调整培养基中葡萄糖的质量百分比为0.8％。

获得的透明质酸产率为1.2g/L，透明质酸中蛋白质含量为0.029%，生产成本降低20％。

实施例3

一种透明质酸的生产方法，采用兽疫链球菌为发酵菌种。在培养基中加入β-羟基丁酸钠和烟酸。β-羟基丁酸钠添加量为培养基质量的0.5%；烟酸添加量为培养基质量的0.2%；同时调整培养基中葡萄糖的质量百分比为1.2％。

获得的透明质酸产率为1.22g/L，透明质酸中蛋白质含量为0.015%，生产成本降低22％。

Claims (7)

1.一种透明质酸的生产方法，其特征在于，采用兽疫链球菌进行发酵，兽疫链球菌的保藏号为HA-116ATCC39920，在培养基中加入β-羟基丁酸钠和烟酸，β-羟基丁酸钠添加量为培养基质量的0.1-1%，烟酸添加量为培养基质量的0.05-0.5%，调整培养基中葡萄糖的质量百分含量为0.8-1.6％。

2.如权利要求1所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，β-羟基丁酸钠添加量为培养基质量的0.5％。

3.如权利要求1所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，烟酸添加量为培养基质量的0.2%。

4.如权利要求1所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，调整培养基中葡萄糖的质量百分含量为1.2％。

5.如权利要求1所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，β-羟基丁酸钠添加量为培养基质量的0.1%，烟酸添加量为培养基质量的0.05%，调整培养基中葡萄糖的质量百分含量为1.6％。

6.如权利要求1所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，β-羟基丁酸钠添加量为培养基质量的1%，烟酸添加量为培养基质量的0.5%，调整培养基中葡萄糖的质量百分含量为0.8％。

7.如权利要求1所述的透明质酸的生产方法，其特征在于，β-羟基丁酸钠添加量为培养基质量的0.5%，烟酸添加量为培养基质量的0.2%，调整培养基中葡萄糖的质量百分含量为1.2％。