BRPI0705359B1 - processo de obtenção de frutooligossacarídeos em bioreator utilizando enzima frutosiltransferase - Google Patents

Abstract

processo de obtenção de frutooligossacarídeos em bioreator utilizando enzima frutosiltransferase. a presente invenção descreve um processo de obtenção de frutooligossacarídeos para ser utilizado em escala industrial apresentando, devido aos parâmetros utilizados, rendimentos satisfatórios após 24 e 48 horas de reação. o processo utiliza a enzima frutosiltransferase, obtida a partir de leveduras e/ou fungos filamentosos, para a realização de conversão enzimática da sacarose em frutooligossacarídeos. os frutooligossacarídeos obtidos são do tipo gf~ 2~ (kestose), gf~ 3~ (nistose) e gf~ 4~ (1-frutosilnistose) e se apresentam em diferentes composições dependendo do tempo de conversão enzimática. a conversão ocorre em bioreator à temperatura de 40°c a 60°c, ph de 4,0 a 6,0 e com uma concentração de sacarose variando de 30% a 70% (plv). diversas podem ser as fontes sacarose utilizadas para o processo de conversão enzimática da presente invenção, citando-se, como exemplo, a sacarose padrão analítico, açúcar cristal, açúcar mascavo, xaropes de açúcar líquido, melaço, etc. o processo a que se refere a invenção permite que a enzima possa ser utilizada na sua forma livre ou imobilizada apresentando resultados que permitem sua aplicação em larga escala.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “PROCESSO DE OBTENÇÃO DE FRUTOOLIGOSSACARÍDEOS EM BIOREATOR UTILIZANDO ENZIMA FRUTOSILTRANSFERASE” A presente invenção se refere a um processo de obtenção de frutooligossacarídeos utilizando a enzima frutosiltransferase extracelular de leveduras e/ou fungos filamentosos. Os frutooligossacarídeos obtidos são considerados alimentos funcionais que apresentam propriedades que o tornam um componente facilmente aplicável em alimentos tanto para a alimentação humana quanto para a animal.

Descrição do estado da técnica Alimentos funcionais são definidos como “todo aquele alimento ou ingrediente que, além das funções nutricionais básicas, quando consumido como parte da dieta usual, produz efeitos metabólicos e/ou fisiológicos e/ou efeitos benéficos à saúde, devendo ser seguro para consumo sem supervisão médica” (Portaria n. 398 de 30/04/1999, Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde).

Entre os diversos alimentos funcionais reconhecidos, temos os frutooligossacarídeos, considerados prebióticos. Alimentos prebióticos são compostos, normalmente por açúcares, não digeríveis, que beneficiam o consumidor por estimular seletivamente o crescimento ou a atividade das bactérias residentes no cólon intestinal. Ou seja, os prebióticos não são totalmente hidrolisados ou absorvidos no trato gastro-intestinal superior, mas são fermentados pela microbiota benéfica, os microrganismos chamados probióticos, como Lactobacillus e Bifidobacteríum (Yun, J. W. Enzyme Microbial Technology; v.19, p.107-117, 1996).

Os frutooligossacarídeos são formados por 1 a 3 unidades de frutose ligadas a uma sacarose na posição β-(2,1), sendo chamados kestose (GF2), nistose (GF3) e 1-frutosilnistose (GF4). Eles podem ser obtidos por extração de fontes vegetais ou pela ação das enzimas β-frutofuranosidase ou frutosiltransferase sobre a sacarose.

Existem vários processos de obtenção de frutooligossacarídeos desenvolvidos a partir de enzimas provenientes de fungos filamentosos. Entre estes, a companhia japonesa Meiji Seika Kaisha Ltd. desenvolveu um processo para a produção de uma solução chamada de neosugar, composta de sacarose, frutose, glicose e frutooligossacarídeos a partir de sacarose utilizando o fungo filamentoso Aspergillus niger em escala laboratorial (US 4.681.771). Este processo é reatizado com soluções de sacarose concentrada (60%), entre 50 e 60°C, em pH de 5,5 a 6,0, resultando em alto rendimento (60%) e produtividade, no entanto, o processo foi desenvolvido para uso em escala laboratorial e produção em pequena escala. Ainda neste trabalho é possível encontrar sugestões de possíveis aplicações para os frutooligossacarídeos como, por exemplo, sorvetes, biscoitos, goma de mascar etc. Desta mesma companhia, é possível ainda citar o documento US 5.314.810, que também indica a aplicação de enzimas provenientes de fungos sob a forma imobilizada em suportes já comumente empregados em técnicas conhecidas de imobilização.

As leveduras, apesar de serem conhecidas como produtoras de frutofuranosidase (invertase) e frutoslltransferase, não são freqüentemente utilizadas na produção de oligossacarídeos, devido à sua alta capacidade hidrolítica, resultando em baixos rendimentos. Entre os gêneros capazes de produzir frutooligossacarídeos temos a Kluyveromyces, Saccharomyces, fíhodotorula, Pichia, Hansenula, Candida e Aureobasidium. As leveduras do gênero fíhodotorula, por exemplo, são produtoras de ácidos graxos, expo-polissacarídeos, lipases, invertase, carotenóides e proteína celular (biomassa). Por terem propriedades abrangentes elas são aplicadas desde processos de bio-remediação e produção de biomassa a partir de subprodutos da indústria agro-alimentar até na fabricação de queijos, como os do tipo cheddar, conferindo a coloração alaranjada (Davoli, P. e col. Applied Biochemistry and Microbiology; v. 40, p.392-397, 2004; Zheng, S. e col. Bioresource Technology; v.96, p. 1522-1524, 2005. Yech, Y. Biotechnology Letters; v.18, p. 411-416, 1996).

Embora descritos na literatura, processos de obtenção de frutooligossacarídeos a partir de enzimas extracelulares produzidas a partir de leveduras e/ou fungos fllamentosos são direcionados para produção laboratorial ou em pequena escala, apresentando limitações quando aplicados em escala industrial. Dentro deste contexto, a presente invenção apresenta um processo de obtenção de frutooligossacarídeos para ser utilizado em escala Industrial apresentando, devido aos parâmetros utilizados, rendimentos satisfatórios após 24 e 48 horas de reação.

Breve descrição da invenção A presente invenção se refere a um processo de obtenção de frutooligossacarídeos utilizando a enzima frutosiltransferase extracelular de leveduras e/ou fungos fllamentosos. O processo descrito ocorre através de conversão enzimática à temperatura de 40°C a 60°C, pH de 4,0 a 6,0 e utilizando uma solução contendo 30% a 70% (p/v) de sacarose. Os frutooligossacarfdeos obtidos são do tipo GF2 (kestose), GF3 (nistose) e GF4 (1-frutosilnistose) e se apresentam em diferentes composições dependendo do tempo de conversão enzimática A invenção também se refere a processos de obtenção de frutooligossacarídeos que compreendam o processo descrito na invenção.

Descrição resumida das figuras A Figura 1 apresenta a cinética de crescimento, consumo de substrato, produção enzimática e pH de um ensaio fermentativo de Rhodotorula sp. em meio contendo melaço e água de maceração de milho tratados, com controle de pH em 4,5. A Figura 2 apresenta perfil de proteína e atividade enzimática obtidos em purificação da fração enzimática em uma coluna aniônica. A Figura 3 apresenta um perfil de concentrações de açúcares obtidos durante a síntese de frutooligossacarídeos utilizando a enzima frutosiltransferase de Rhodotorula sp. na sua forma livre num biorreator do tipo mistura. A Figura 4 apresenta um perfil de concentrações de açúcares obtidos durante a síntese de frutooligossacarídeos utilizando a enzima frutosiltransferase de Rhodotorula sp. imobilizada em suporte inorgânico, contendo nióbio e grafite, num biorreator do tipo mistura. As figuras 4.a e 4.b são referentes ao pH de 4,5 e as figuras 4.c e 4.d referentes ao pH 6,0. A Figura 5 representa alguns tipos de biorreatores indicados para aplicação de enzimas imobilizadas: a) leito fixo, b) leito fluidizado, c) leito expandido, d) tipo mistura, e) tipo cesto.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção descreve um processo de obtenção, em escala industrial, de frutooligossacarídeos (FOS) em bioreator utilizando enzima frutosiltransferase. A enzima extracelular frutosiltransferase sintetizadora dos FOS é proveniente de leveduras e/ou fungos filamentosos sendo, preferencialmente, proveniente de leveduras do gênero Rhodotorula sp, podendo ser produzida tanto em meio de cultivo líquido sintético quanto em meio líquido alternativo. O meio sintético utilizado para a produção de enzima utilizada na presente invenção é composto de 5-10% sacarose, 1-3% extrato de levedura, 0,01% MgS04, 0,1% Κ2ΗΡ04. O meio alternativo é composto de 7-11% de água de maceração de milho e de melaço em concentrações equivalentes de açúcares redutores totais entre 6-12%. A fermentação para a produção da enzima frutosiltransferase é realizada, preferencialmente, em melo de cultivo líquido contendo 7% de água de maceração de milho e 6% de açúcares redutores totais. Tanto o melaço quanto água de maceração de milho podem ser previamente tratados com carvão ativo. O microrganismo mantido em agar inclinado GYMP {2% de glicose, 0,5% de extrato de levedura, 1% de extrato de malte, 0,2% fosfato de sódio monobásico e 2% de agar) ou congelado em 10% de glicerol, deve ser reativado e inoculado sucessivamente para atingir a quantidade de inoculo necessário na fermentação. O primeiro inóculo pode ser realizado em meio contendo 2% de sacarose ou glicose, 1% de extrato de levedura, 2% de peptona e 0,5% de K2HPO4, ajustando 0 pH entre 4,0 e 5,0 e incubado a 27-35°C e 150 rpm por 16-24 horas. O segundo inóculo é preparado com 0 mesmo meio de cuitura da fermentação a ser realizada (sintético ou alternativo), com incubação a 27-35°C e 150 rpm por aproximadamente 16 horas.

As fermentações, em batelada simples, batelada alimentada ou contínua, são realizadas em fermentadores e devem ser iniciadas com um pH inicial entre 3,5 e 5, ao qual são adicionados de 5% a 15% (v/v) de inóculo. Durante o processo, deve-se manter as variáveis: temperatura entre 25 e 35°C, preferencialmente 30°C, agitação entre 300 e 900 rpm, preferencialmente 500 rpm, e aeração entre 0,5 e 2,5 vvm, preferencialmente 1,5 vvm. O pH do processo deve ser controlado entre 3,5 a 7,5, preferencialmente 4,5, pela adição de solução de HCI. O caldo fermentado é clarificado por qualquer método usual, preferencialmente por centrifugação a 6000 g por mais de 5 minutos a 5-10°C. A recuperação da enzima também pode ser realizada pelos métodos usuais (precipitação por sulfato de amônia ou solventes), mantendo-se temperaturas baixas 2-4°C e sendo necessários aproximadamente 70% de saturação para ocorrer a precipitação das proteínas. Em seguida centrifuga-se a mistura a 6000-10000 g, a 2-4°C, por mais de 5 minutos para a extração de enzima que é novamente diluída em tampão acetato de sódio 20-50 mM, pH 4,5-5,0. A solução enzimática assim obtida pode ser congelada, imobilizada ou liofilizada.

Para a determinação da atividade enzimática, faz-se uma reação de 0,5 mL da suspensão enzimática com 4,5 mL de solução de sacarose 30-50% em tampão acetato 0,05 M a 50-60°C em pH 4,5-5,0. Retirando-se amostras em intervalos de tempos regulares até totalizar 30 minutos de reação para a dosagem de glicose e açúcares redutores Considerando uma unidade de atividade de frutofuranosídase (UF) como a quantidade de enzima necessária para a hidrolise de 1 μιτιοΙ de sacarose por minuto e uma unidade de frutosiltransferase (UTf) como a quantidade de enzima necessária para transferir 1 μιτιοΙ de frutose (F) por minuto, pode-se calcular as atividades pela determinação de açúcares redutores (AR) e de glicose (G) (Chen, W & Liu, C. Enzyme Microbial Technology; v.18, p.153-160,1996).

Como: onde F é frutose, G é glicose, FT é frutose transferida e AR açúcares redutores. A partir destes dados, calcula-se as atividades da seguinte forma: UF = AR [μτηοΙ /min] e UTf = (2G -ART) [μιτιοΙ /min]. A enzima recuperada pode ser purificada por cromatografia tônica para posterior utilização no processo de obtenção de FOS. A purificação da enzima consiste em injetar a amostra em coluna trocadora de ânions, equilibrada com tampão acetato de sódio ou fosfato de sódio (50 ou 100 mM, pH 5,5-6,0). A velocidade de operação (linear) deve ser entre 0,5 e 2 cm/min. Após a aplicação de 1 volume de coluna deste tampão a eluição é iniciada pela aplicação de um gradiente salino (NaCI 1M em tampão) linear ascendente (0-100%). O processo de obtenção de frutooligossacarfdeos em bioreator utilizando enzima frutosiltransferase da presente invenção ocorre a partir de uma solução contendo 30% a 70% (p/v) de sacarose, temperatura de 40°C a 60°C e pH de 4,0 a 6,0. Preferencialmente, o processo que trata a presente invenção ocorre a partir de uma solução contendo 50% (p/v) de sacarose, temperatura de 50°C e pH 5,0. Diversas podem ser as fontes de sacarose utilizadas para o processo de conversão enzimática da presente invenção, citando-se, como exemplo, a sacarose padrão analítico (P.A.), açúcar cristal, açúcar mascavo, xaropes de açúcar líquido, melaço, etc. A concentração de enzima frutosiltransferase no processo enzimátlco da presente invenção varia de 2 a 30 UTF por grama de sacarose. Preferencíalmente, a concentração de enzima frutosiltransferase no processo enzimático da presente Invenção varia de 10 a 15 UTF por grama de sacarose. A enzima frutosiltransferase utilizada no processo de obtenção de FOS da presente invenção, pode ser obtida a partir de ievedura ou fungo filamentoso e, preferencialmente, a enzima é obtida a partir da levedura Rhodotorula sp. 0 processo de conversão enzimátlca descrito na presente invenção ocorre em bioreatores de mistura ou similares e, preferencialmente, o processo ocorre em bioreatores do tipo leito fixo. A enzima frutosiltransferase responsável pela bioconversão do susbstrato da presente invenção pode estar na forma livre ou imobilizada. Os suportes utilizados para imobilização podem ser de origem orgânica ou inorgânica. No caso de suporte orgânico, utiliza-se, preferencialmente, o alginato de sódio. No caso de suporte inorgânico, utiliza-se, preferencialmente, suporte constituído de nióbio e grafite. A presente invenção também se refere a um processo de obtenção de frutooligossacarídeos que compreende o processo de obtenção de frutooligossacarfdeos definido anteriormente.

Em uma concretização preferida, a produção da enzima frutosiltransferase responsável pela bioconversão do susbstrato da presente invenção é realizada utilizando-se meio composto de 6% de melaço (concentrações equivalentes de açúcares redutores) e 7% de água de maceração de milho. A temperatura durante todo o processo é de 30°C, agitação de 650 rpm e aeração de 1,5 wm. O pH é controlado durante o processo fermentativo, pela adição de HCI 1N, mantendo-o constante no valor de 4,5, Verifica-se que em 48 horas de fermentação a enzima atinge a máxima atividade, conforme apresentado na Figura 1. A recuperação e purificação da enzima é realizada através de centrifugação do caldo fermentado a 6000 g por 10 min a 5-10°C em centrífuga refrigerada para eliminação das células (biomassa). Para a recuperação da enzima é adicionado etanol à -20°C até atingir uma concentração de 70%. Todo o processo é realizado sob agitação branda e temperatura entre 2 e 4°C, de tal forma que não ocorre desnaturação da enzima. Após a adição do etanol, a solução é centrifugada a 6000g por 10 min a 2-6°C. O precipitado contendo a enzima é re-suspendido em tampão acetato de sódio 50 mM, pH 4,5 e armazenado em congelador (-18°C). Este processo de precipitação da enzima resulta na recuperação de 65% (±10%) da atividade enzimática contida no meio fermentado. A solução de enzima extraída pela adição de etanol é purificada em uma coluna aniônica (HiLoad™ 16/10 Q-Sepharose® Fast Flow - Pharmacia Biotech) equilibrada com tampão acetato de sódio 100mM (pH 5,5). A eluição ó realizada por gradiente salino linear: 0 a 90% de NaCI 1M em tampão acetato de sódio 100mM. Todo o processo é realizado em fluxo de 1 cm3 por minuto. As frações coletadas são analisadas quanto à atividade enzimática e teor de proteínas presentes. Os resultados são apresentados na Tabela 1 e na Figura 2. TABELA 1 Em uma concretização preferida da presente invenção, a produção de frutooligossacarídeos por enzima extracelular de Rhodotorula sp na sua forma livre é realizada com uma concentração de 50% (p/v) sacarose comercial (açúcar cristal), pH 5,0 (tampão acetato de sódio 50 mM), 50 °C e 6,5 UTf por mililitro. Nestas condições obtém-se 63% de rendimento, equivalente a 320 g de frutooligossacarídeos por mL após 72 horas de reação. No entanto após 24 horas a produção de frutooligossacarídeos equivale a 95% do máximo, sendo o maior produto o GF2. Se houver necessidade de uma solução com maior concentração de frutooligossacarídeos de cadeias maiores, GF3 e GF4, é interessante levar a reação até 60 ou 72 horas quando estes alcançam a porcentagem de 50% do total de frutooligossacarídeos presentes. A Figura 3 apresenta um perfil de concentrações de açúcares obtido durante a síntese com enzima livre.

Em outra concretização preferida da invenção, a produção de frutooligossacarídeos é realizada por enzima extracelular de Rhodotorula sp imobilizada em suporte inorgânico composto de grafite e nióbio. A conversão enzimática é conduzida com uma concentração de 50% (p/v) sacarose comercial {açúcar cristal), pH 5,0 (tampão acetato de sódio 50 mM), 50 °C e 6,5 Ujf por mililitro. Nestas condições, ao finai de 72 horas de síntese obtém-se 66,4% e 58,33% de rendimento para o pH 4,5 e 6,0 respectivamente. A concentração de cada frutooligossacarídeo que se obtém ao final das 72 h está demonstrada na Tabela 2, onde se observa que a maior produção é sempre de GF2 e que GF4 só é produzido com 48h no pH 4,5 e com 72h no pH 6,0. Com 24 horas de síntese o rendimento obtido é de 73,82% e 73,74% para o pH 4,5 e 6,0 respectivamente. Mas com 48 h de síntese o rendimento respectivo é de 91% e 95,6%. A Figura 4 apresenta um perfil de concentrações de açúcares obtido durante a síntese com enzima imobilizada. TABELA 2 REIVINDICAÇÕES

Claims (8)

1. Processo de obtenção de frutooligo ssa caríd eos em bíoreator utilizando enzima frutosiltransferase caracterizado pelo fato de que ocorre a partir de uma solução contendo 50% a 70% (p/v) de sacarose. temperatura de 50°C, pH 5,0,e uma concentração de enzima frutosiltransferase de 2 a 30 Utf por grama de sacarose,

2 Processo de obtenção de frutooligossacarídeos de acordo com reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que ocorre com uma concentração de enzima frutosiltransferase de 10 a 15 Utf por grama de sacarose.

3. Processo de obtenção de frutooligossacarídeos de acordo com reivindicação 2 caracterizado pelo fato de que a enzima frutosiltransferase é obtida a partir da levedura Rhodotorula sp,

4. Processo de obtenção de frutooligossacarídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizado pelo fato de que a obtenção de frutooligossacarídeos ocorre em bíoreator de leito fixo,

5. Processo de obtenção de frutooligossacarídeos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a enzima frutosiltransferase está imobilizada ou na forma livre.

6. Processo de obtenção de frutooligossacarídeos de acordo com reivindicação 5 caracterizado pelo fato de que a imobilização ocorre em suporte sólido inorgânico ou orgânico,

7. Processo de obtenção de frutooligossacarídeos de acordo com reivindicação 6 caracterizado pelo fato de que o suporte sólido orgânico è composto de alginato de sódio.

8. Processo de obtenção de frutooligossacarídeos de acordo com reivindicação 6 caracterizado pelo fato de que o suporte sólido inorgânico ê composto por nióbio e grafite.