TWI776240B

TWI776240B - 微生物纖維之製備方法

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Publication number: TWI776240B
Application number: TW109132753A
Authority: TW
Inventors: 郭秋媚; 謝宗翰; 傅威昌; 賴進此
Original assignee: 財團法人食品工業發展研究所
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2022-09-01
Also published as: TW202212573A

Abstract

一種微生物纖維之製備方法，包含提供一培養液，該培養液基本上由水、氮源及碳源所組成；及將醋酸菌屬的細菌接種於該培養液，於26~30°C、50~150 rpm轉速下，培養3-14天而發酵生產微生物纖維；其中該氮源於該培養液中的濃度範圍為5~20 g/L，該碳源於該培養液中的濃度範圍為10~50 g/L，且該氮源/碳源比為0.1~2。本發明方法可藉由調整該培養液中的氮源濃度及碳源濃度，而控制微生物發酵生產800~8,000聚合度範圍或30,000~70,000聚合度範圍的微生物纖維及其相對應的微生物纖維產量。

Description

微生物纖維之製備方法

本發明係關於微生物纖維的製備方法，尤其有關一種藉由調整該培養液中的氮源濃度及碳源濃度，而控制所發酵生產的微生物纖維的聚合度。

膳食纖維(Dietary fiber)是繼水、蛋白質、脂肪、碳水化合物、礦物質、維生素之外的「第七大營養素」，其生理功能主要於消化道中發揮，對身體的代謝和免疫有重要的影響。許多官方機構如美國食品藥品監督管理局(U.S. Food and Drug Administration, FDA)、歐洲食品安全局(European Food Safety Authority, EFSA)、中國食品藥品監督管理局(China Food and Drug Administration, CFDA)、澳洲紐西蘭食品標準局(Food Standards Australia and New Zealand, FSANZ)及加拿大衛生部(Health Canada)及我國衛生福利部食品藥物管理署(Taiwan Food and Drug Administration, TFDA)都認同國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission, Cordex)對於膳食纖維的定義，主要考慮碳水化合物的聚合度(Degree of polymerization, DP)和組成及其具有的生理特性。我國是將膳食纖維定義為DP ＞ 3的可食碳水化合物(非澱粉質多醣)和木質素，不能被人體消化道酶分解且對人體有健康效益。由於膳食纖維的生理功效與其聚合度、結構、組成及其理化特性有關，因此不同聚合度的碳水化合物會有生理功效上的差異。目前主要的膳食纖維來源有燕麥、麩皮、大麥、玉米穀類、豆類及蔬果等，但以我國膳食纖維產業永續發展角度來看，利用植物做為膳食纖維原料勢必會面臨供應量充足與否的問題，進而影響經濟發展規模。因此，利用微生物發酵生產微生物纖維為我國膳食纖維的發展首選，不僅無原料供應限制，且所開發的微生物纖維於膳食纖維產業中更具市場區隔性和競爭力。

CN102816810B揭示一種控制細菌纖維素聚合度的細菌纖維素微生物製備方法，將 Gluconacetobacter sp.GD-BC-1CCTCC M 208149培養於三種不同培養基組成分，此三種培養基組成分包括碳源葡萄糖、甘油或木糖，氮源酵母膏、蛋白腖或生化級玉米漿，以及其他有機酸、乙醇與磷酸鈉鹽，且此三種培養基組成分中分別有5~7種成份，最終生產聚合度範圍1,361~2,350之細菌纖維素。

CN105886570A揭示以L-麩胺酸生產奈米級細菌纖維素的一種方法，是利用L-麩胺酸的添加取代成本較高的酵母萃取物和蛋白腖作為氮源，建構一低成本的培養基組成(2% 葡萄糖、0.1% 檸檬酸銨、0.5% Na ₂HPO ₄及0-0.1% L-麩胺酸)可於靜置培養條件下，發酵生產細菌纖維素膜，此前案並無描述任何相關細菌纖維素聚合度之生產技術。

本發明揭示一種微生物纖維之製備方法，包含提供一培養液，該培養液基本上由水、氮源及碳源所組成；及將醋酸菌屬的細菌接種於該培養液，於26~30°C、50~150 rpm轉速下，培養3-14天而發酵生產微生物纖維；其中該氮源於該培養液中的濃度範圍為5~20 g/L，該碳源於該培養液中的濃度範圍為10~50 g/L，且該氮源/碳源比為0.1~2。本發明方法可藉由調整該培養液中的氮源濃度及碳源濃度，而控制微生物發酵生產800~8,000聚合度範圍或30,000~70,000聚合度範圍的微生物纖維及其相對應的微生物纖維產量。

本發明的較佳具體實施態樣包括（但不限於）以下申請專利範圍所描述者。

目前市面上大多利用高聚合度的植物纖維進行化學法降解生產不同聚合度之纖維，此製造過程中常需要使用到大量的化學溶劑，且還會有溶劑殘留之疑慮。本發明則是利用微生物發酵生產微生物纖維，毋須使用大量的化學溶劑使用，更無溶劑殘留之問題，是一種環保且友善環境之綠色製程。

本發明利用培養基組成中氮源/碳源比控制醋酸菌屬的細菌發酵生產800~8,000聚合度範圍和30,000~70,000聚合度範圍的微生物纖維，且微生物纖維產量和氮源/碳源比之間具有線性關係，因此可利用線性關係式預測出800~8,000聚合度範圍和30,000~70,000聚合度範圍的微生物纖維產量。其中氮源來源可為胺基酸及其鹽類、酵母萃取物、大豆蛋白等和碳源來源可為蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖等，培養基組成中氮源/碳源比為0.1~2之間，其中氮源添加濃度範圍為5~20 g/L和碳源添加濃度範圍為10~50 g/L。

本發明方法可被控制發酵生產800~8,000聚合度範圍或30,000~70,000聚合度範圍的微生物纖維，不同聚合度的微生物纖維除了可作為膳食纖維之外，也會因纖維聚合度不同產生不同的物性和化性(拉伸強度、結晶度、楊氏模數、溶鹼能力等)可做為乳化劑、增稠劑、敷料、高分子聚合物載體、固定化反應器載體等產品，可廣泛應用於食品、保健食品、化妝保養品、造紙、光電、醫藥等產業。

於本發明中氮源與碳源的定義如下：

碳源：提供微生物製造菌體或代謝生產物所需的碳元素，且同時供給生合成或維持生命力所需的能源，主要為碳水化合物，常見的來源主要有糖類、油脂、有機酸等。

氮源：主要用於微生物生成菌體細胞物質（胺基酸及其鹽類、蛋白質、核酸等）和含氮代謝物，氮源可分為有機氮源和無機氮源，無機態氮源主要為氨氣、氨鹽與硝酸態氮型態，而有機態氮源則以胺基酸及其鹽類、大豆蛋白或尿素等型態供給。

於本發明中氮源/碳源比（N/C）是指培養基中氮源成分與碳源成份的添加濃度比值。例如以下本案實施例所使用的氮源為麩胺酸鈉，碳源為蔗糖。故當麩胺酸鈉於培養基中的添加濃度為20 g/L，蔗糖於培養基中的添加濃度為10 g/L時，則培養基中氮源/碳源比為2 (計算方式為氮源添加濃度/碳源添加濃度 = 20/10 = 2)。

實施例1

將醋酸菌 Komagataeibactersp.菌落接種於含有100 mL AC培養基的250 mL錐形瓶中，AC培養基成分包括60 g/L馬鈴薯葡萄糖培養基(Potato dextrose broth)、5 g/L酵母萃取物(Yeast extract)及3 g/L蛋白腖(Peptone)，以28°C和100 rpm培養3天後，取出菌液以5%(v/v)接菌量接種於僅含有5 g/L氮源麩胺酸鈉和不同碳源濃度10~50 g/L蔗糖兩種成份的培養基中，培養基體積為200 mL，以28°C和100 rpm培養7天後，收取醋酸菌所生成的微生物纖維與95%酒精以1:4 (v:v)體積比例相互混合，再置放於4°C靜置24小時後，8,000 rpm離心10分鐘去除上清液，收集沉澱物於70°C烘乾後，測定微生物纖維產量。生成的微生物纖維之聚合度測定方法是先利用銅乙二胺(Cupriethylenediamine)溶解微生物纖維(Andritsou V, de Melo EM, Tsouko E, Ladakis D, Maragkoudaki S, Koutinas AA, Matharu AS. 2018. Synthesis and characterization of bacterial cellulose from citrus-based sustainable resources. ACS omega 3: 10365–10373)，待微生物纖維完全溶解後測定其相對黏度(Relative viscosity, η _r)和比黏度(Specific viscosity, η _sp)，並利用Eq. 1計算出極限黏度(Intrinsic viscosity, [η])。再將極限黏度[η]代入Eq. 2 Mark-Houwink關係式，計算出微生物纖維的平均分子量，最後利用Eq. 3將微生物纖維的平均分子量除以脫水葡萄糖單體分子量計算出微生物纖維的聚合度(Degree of polymerization, DP)。 [η] = {2[η _sp- ln(η _r)]/C} ^0.5(Eq. 1) 其中C為纖維濃度；η _sp/C為比濃黏度(Reduced viscosity)；ln(η _r)/C為固有黏度(Inherent viscosity)。 [η] = KM ^a(Eq. 2) 其中K和a為常數受溶劑溶質種類及溫度等因素所影響，25°C在纖維-銅乙二胺的溶液體系中，K為1.33×10 ^-4dL/g，a為0.905，M為纖維平均分子量。 DP= M/162 (Eq. 3) 其中DP為纖維聚合度，162為脫水葡萄糖單體分子量。

實驗結果顯示當氮源麩胺酸鈉濃度為5 g/L，添加不同碳源蔗糖10、20、30、40及50 g/L時，微生物纖維產量隨著碳源蔗糖濃度增加而增加 ( 第 1A 圖)，微生物纖維聚合度則隨著碳源蔗糖濃度增加而降低 ( 第 1B 圖)，當添加10 g/L蔗糖時，微生物纖維產量約0.04 g/L，所生成的微生物纖維具最大聚合度約69,300；添加50 g/L蔗糖時，可收取最大微生物纖維產量約0.8 g/L，所生成的微生物纖維聚合度約31,300。

實施例2

將醋酸菌 Komagataeibactersp.菌落接種於含有100 mL AC培養基的250 mL錐形瓶中，AC培養基成分包括60 g/L馬鈴薯葡萄糖培養基(Potato dextrose broth)、5 g/L酵母萃取物(Yeast extract)及3 g/L蛋白腖(Peptone)，以28°C和100 rpm培養3天後，取出菌液以5%(v/v)接菌量接種於僅含有10 g/L氮源麩胺酸鈉和不同碳源濃度10~50 g/L蔗糖兩種成份的培養基中，培養基體積為200 mL，以28°C和100 rpm培養7天後，按照實施例1的方法收取醋酸菌所生成的微生物纖維，並測定其產量和聚合度。實驗結果顯示當氮源麩胺酸鈉濃度為10 g/L，添加不同碳源蔗糖10、20、30、40及50 g/L時，當蔗糖添加濃度為10~40 g/L時，微生物纖維產量皆差不多約1.6 g/L，但當蔗糖濃度增加至50 g/L，微生物纖維產量則提升至2.4 g/L ( 第 2A 圖)，然而，所生成的微生物纖維聚合度並無隨著蔗糖濃度增加而有明顯的差異，其聚合度約5,700~6,900 ( 第 2B 圖)。

實施例3

將醋酸菌 Komagataeibactersp.菌落接種於含有100 mL AC培養基的250 mL錐形瓶中，AC培養基成分包括60 g/L馬鈴薯葡萄糖培養基(Potato dextrose broth)、5 g/L酵母萃取物(Yeast extract)及3 g/L蛋白腖(Peptone)，以28°C和100 rpm培養3天後，取出菌液以5%(v/v)接菌量接種於僅含有15 g/L氮源麩胺酸鈉和不同碳源濃度10~50 g/L蔗糖兩種成份的培養基中，培養基體積為200 mL，以28°C和100 rpm培養7天後，按照實施例1的方法收取醋酸菌所生成的微生物纖維，並測定其產量和聚合度。實驗結果顯示當氮源麩胺酸鈉濃度為15 g/L，添加不同碳源蔗糖10、20、30、40及50 g/L時，微生物纖維產量隨著碳源蔗糖濃度增加而增加 ( 第 3A 圖)，但當蔗糖添加濃度為20~50 g/L時，相較於蔗糖添加濃度為10 g/L所生成的微生物纖維聚合度明顯降低許多( 第 3B 圖)，當添加10 g/L蔗糖時，微生物纖維產量約1.6 g/L，所生成的微生物纖維具最大聚合度約6,300；添加50 g/L蔗糖時，可收取最大微生物纖維產量約7.2 g/L，所生成的微生物纖維聚合度約1,500。

實施例4

將醋酸菌 Komagataeibactersp.菌落接種於含有100 mL AC培養基的250 mL錐形瓶中，AC培養基成分包括60 g/L馬鈴薯葡萄糖培養基(Potato dextrose broth)、5 g/L酵母萃取物(Yeast extract)及3 g/L蛋白腖(Peptone)，以28°C和100 rpm培養3天後，取出菌液以5%(v/v)接菌量接種於僅含有20 g/L氮源麩胺酸鈉和不同碳源濃度10~50 g/L蔗糖兩種成份的培養基中，培養基體積為200 mL，以28°C和100 rpm培養7天後，按照實施例1的方法收取醋酸菌所生成的微生物纖維，並測定其產量和聚合度。實驗結果顯示當氮源麩胺酸鈉濃度為20 g/L，添加不同碳源蔗糖10、20、30、40及50 g/L時，微生物纖維產量隨著碳源蔗糖濃度增加而增加 ( 第 4A 圖)，微生物纖維聚合度則隨著碳源蔗糖濃度增加而降低 ( 第 4B 圖)，當蔗糖添加濃度為20~50 g/L時，微生物纖維聚合度降低至2,000以下，當添加10 g/L蔗糖時，微生物纖維產量約2.5 g/L，所生成的微生物纖維具最大聚合度約3,700；添加50 g/L蔗糖時，可收取最大微生物纖維產量約7.8 g/L，所生成的微生物纖維聚合度約870。

實施例5

從實施例1、2、3及4的實驗結果中，將不同氮源麩胺酸鈉添加濃度5~20 g/L和不同碳源蔗糖添加濃度10~50 g/L所生產的微生物纖維產量加以分析，顯示當固定蔗糖濃度時，麩胺酸鈉添加濃度和微生物纖維產量具有一線性關性式，如當蔗糖濃度10 g/L，Y=0.152X-0.5 ( 第 5A 圖)；當蔗糖濃度20 g/L，Y=0.296X-1.25 ( 第 5B 圖)；當蔗糖濃度30 g/L，Y=0.324X-0.145 ( 第 5C 圖)；當蔗糖濃度40 g/L，Y=0.444X-2.05 ( 第 5D 圖)；當蔗糖濃度50 g/L，Y=0.516X-1.9 ( 第 5E 圖)，其中Y為微生物纖維產量(g/L)，X為麩胺酸鈉濃度(g/L)，從關係式可得知隨著碳源蔗糖濃度增加，關係式的斜率越大，表示微生物纖維產量因碳源蔗糖添加，或是因混合氮源麩胺酸鈉和碳源蔗糖的加乘作用之助益越顯著。因此進一步分析氮源/碳源比與微生物纖維產量之關係 ( 第 6 圖)，結果顯示當氮源/碳源比(N/C ratio)在0.1~2之間與微生物纖維產量具有線性關係，當碳源蔗糖為10 g/L，Y=1.438(N/C ratio)- 0.335；當碳源蔗糖為20 g/L，Y=6.168(N/C ratio)-1.36；當碳源蔗糖為30 g/L，Y=12.11(N/C ratio)-2.19；當碳源蔗糖為40 g/L，Y=18.14(N/C ratio)-1.99；當碳源蔗糖為50 g/L，Y=25.06(N/C ratio)-2.465，其中Y為微生物纖維產量(g/L)，因此可藉由氮源/碳源比(N/C ratio)調控所生產的微生物纖維產量。

實施例6

從實施例1、2、3及4的實驗結果中，將不同氮源麩胺酸鈉濃度5~20 g/L和不同碳源蔗糖濃度10~50 g/L以氮源/碳源比與微生物纖維聚合度分析兩者關係，可明顯看出主要生產≤ 8,000聚合度範圍和30,000~70,000聚合度範圍的微生物纖維 ( 第 7 圖)，其中當培養基組成中氮源/碳源比於 0.1~0.5 範圍和氮源濃度為5 g/L時，醋酸菌可發酵生產30,000~70,000聚合度範圍的纖維，且氮源/碳源比和微生物纖維聚合度具有一對數關係式，y=22.6×ln(N/C ratio)+89.4 ( 第 8 圖)；當培養基組成中氮源/碳源比於 0.2~0.5 範圍和氮源濃度為10 g/L時，醋酸菌可發酵生產800~8,000聚合度範圍的纖維，且氮源/碳源比和微生物纖維聚合度具有一對數關係式，y=1.25×ln(N/C ratio)+7.79 ( 第 9A 圖)；當培養基組成中氮源/碳源比於 0.3~1.5 範圍和氮源濃度為15 g/L時，醋酸菌可發酵生產800~8,000聚合度範圍的纖維，且氮源/碳源比和微生物纖維聚合度具有一對數關係式，y=2.88×ln(N/C ratio)+4.47 ( 第 9B 圖)；當培養基組成中氮源/碳源比於 0.4~2 範圍和氮源濃度為20 g/L時，醋酸菌可發酵生產800~8,000聚合度範圍的纖維，且氮源/碳源比和微生物纖維聚合度具有一對數關係式，y=1.65×ln(N/C ratio)+2.21 ( 第 9C 圖)，其中y為微生物纖維聚合度，因此可藉由氮源/碳源比(N/C ratio)調控所生產的微生物纖維聚合度。再加上實施例5所揭示的氮源/碳源比和微生物纖維產量的線性關係式，因此可藉由氮源/碳源比調控所生產的微生物纖維聚合度之外，也能提供預測所生成的微生物纖維產量。

於以下申請專利範圍的請求項1所記載的「該培養液基本上由水、氮源及碳源所組成」意謂該培養液除了含有水、氮源及碳源外，還可能含有生產該水、氮源及碳源時不可避免的微量雜質，也可能含有被添加於培養液中的微量其它成分，例如維生素或藥物等，但不論是該微量雜質或其它成分都不會影響本發明的微生物發酵生產微生物纖維，亦即本發明的發明功效不會受到實質上的影響。

無

第 1A~1B 圖為本發明方法之醋酸菌培養於添加氮源麩胺酸鈉5 g/L和不同碳源濃度10~50 g/L蔗糖的培養基7天之微生物纖維產量的柱狀圖( 第 1A 圖)；微生物纖維聚合度的柱狀圖( 第 1B 圖)。第 2A~2B 圖為本發明方法之醋酸菌培養於添加氮源麩胺酸鈉10 g/L和不同碳源濃度10~50 g/L蔗糖的培養基7天之微生物纖維產量的柱狀圖( 第 2A 圖)；微生物纖維聚合度的柱狀圖( 第 2B 圖)。第 3A~3B 圖為本發明方法之醋酸菌培養於添加氮源麩胺酸鈉15 g/L和不同碳源濃度10~50 g/L蔗糖的培養基7天之微生物纖維產量的柱狀圖( 第 3A 圖)；微生物纖維聚合度的柱狀圖( 第 3B 圖)。第 4A~4B 圖為本發明方法之醋酸菌培養於添加氮源麩胺酸鈉20 g/L和不同碳源濃度10~50 g/L蔗糖的培養基7天之微生物纖維產量的柱狀圖( 第 4A 圖)；微生物纖維聚合度的柱狀圖( 第 4B 圖)。第 5A~5E 圖為本發明方法之醋酸菌培養於添加不同氮源麩胺酸鈉5~20 g/L和碳源蔗糖10 g/L的培養基7天之微生物纖維產量的線性關係圖( 第 5A 圖)；醋酸菌培養於添加不同氮源麩胺酸鈉5~20 g/L和碳源蔗糖20 g/L的培養基7天之微生物纖維產量的線性關係圖( 第 5B 圖)；醋酸菌培養於添加不同氮源麩胺酸鈉5~20 g/L和碳源蔗糖30 g/L的培養基7天之微生物纖維產量的線性關係圖( 第 5C 圖)；醋酸菌培養於添加不同氮源麩胺酸鈉5~20 g/L和碳源蔗糖40 g/L的培養基7天之微生物纖維產量的線性關係圖( 第 5D 圖)；醋酸菌培養於添加不同氮源麩胺酸鈉5~20 g/L和碳源蔗糖50 g/L的培養基7天之微生物纖維產量的線性關係圖( 第 5E 圖)。第 6 圖為本發明方法之醋酸菌培養於氮源/碳源比(N/C ratio)為0.1~2範圍的培養基7天之微生物纖維產量的線性關係圖。第 7 圖為本發明方法之醋酸菌培養於氮源/碳源比(N/C ratio)為0.1~2範圍的培養基7天之微生物纖維聚合度分佈圖。第 8 圖為本發明方法之氮源/碳源比(N/C ratio)為0.1~0.5範圍和氮源麩胺酸鈉濃度為5 g/L時，醋酸菌培養7天之氮源/碳源比和微生物聚合度之對數關係圖。第 9A~9C 圖本發明方法之氮源/碳源比(N/C ratio)為0.2~0.5範圍和氮源麩胺酸鈉濃度為10 g/L時，醋酸菌培養7天之氮源/碳源比和微生物聚合度之對數關係圖( 第 9A 圖)；氮源/碳源比(N/C ratio)為0.3~1.5範圍和氮源麩胺酸鈉濃度為15 g/L時，醋酸菌培養7天之氮源/碳源比和微生物聚合度之對數關係圖( 第 9B 圖)；氮源/碳源比(N/C ratio)為0.4~2範圍和氮源麩胺酸鈉濃度為20 g/L時，醋酸菌培養7天之氮源/碳源比和微生物聚合度之對數關係圖( 第 9C 圖)。

無

Claims

一種微生物纖維之製備方法，包含：提供一培養液，該培養液基本上由水、氮源及碳源所組成；及將醋酸菌屬的醋酸菌Komagataeibacter sp.接種於該培養液，於26~30℃、50~150rpm轉速下，培養3-14天而發酵生產微生物纖維；其中該氮源於該培養液中的濃度範圍為5~20g/L，該碳源於該培養液中的濃度範圍為10~50g/L，且該氮源/碳源比為0.1~2；其中當該培養液的氮源/碳源比為0.1~0.5及該氮源濃度為5g/L時，該細菌可發酵生產30,000~70,000聚合度範圍的微生物纖維，且氮源/碳源比和微生物纖維聚合度具有一對數關係式；或當該培養液的氮源/碳源比為0.2~2及該氮源濃度為10~20g/L時，該細菌可發酵生產800~8,000聚合度範圍的微生物纖維，且氮源/碳源比和微生物纖維聚合度具有一對數關係式。
如請求項1所述之製備方法，其中該氮源為有機含氮化合物，及該碳源為碳水化合物。
如請求項1所述之製備方法，其中該碳源為蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、或甘露糖。
如請求項1所述之製備方法，其中該氮源為麩胺酸或其鹽類、酵母萃取物、大豆蛋白或尿素。
如請求項1所述之製備方法，其中該培養液基本上由水、麩胺酸鈉和蔗糖所組成。